馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)提取方法的篩選

唐世明+曹君邁+陳彥云+馬玉龍

摘要：以青薯168、克新1號的芽眼部、側(cè)部及髓部為試驗(yàn)材料，分別采用丙酮提取法、三氯乙酸（TCA）提取法、鹽提取法、醇提取法、酚提取法提取，并用分光光度法對不同部位的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。采用2因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，研究品種、提取方法、取樣部位以及不同因素組合對蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明：不同品種的蛋白質(zhì)含量不同，青薯168顯著高于克新1號（P<0.05），達(dá)128.0 mg/L；不同提取方法之間蛋白含量不同，丙酮提取法、鹽提取法和TCA提取法的蛋白含量間無顯著差異，但顯著高于酚提取法、醇提取法（P<0.05），前3種提取方法的蛋白質(zhì)含量為153.3～159.7 mg/L；馬鈴薯塊莖芽眼部的蛋白質(zhì)含量顯著高于側(cè)部及髓部（P<0.05），達(dá)140.7 mg/L；品種、提取方法、取樣部位不同組合間差異顯著（P<0.05）。綜合比較可知，適合青薯168芽眼部的提取方法為鹽提取法，適合克新1號芽眼部的提取方法為TCA提取法。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯塊莖；品種；提取方法；部位；蛋白質(zhì)含量

中圖分類號： TS201.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0326-03

馬鈴薯是多年生草本，可作一年生或一年兩季栽培作物，既可糧菜兼用，又可制成生物燃料及飼料，還具有和胃、調(diào)中、健脾、益氣的作用，對胃潰瘍、習(xí)慣性便秘、膠原病、熱咳及皮膚濕疹也有治療功效。同時，馬鈴薯也是一種營養(yǎng)保健食品。馬鈴薯資源非常豐富，而且己有報(bào)道表明，馬鈴薯蛋白粉的營養(yǎng)價值明顯優(yōu)于豆粕[1]，是優(yōu)質(zhì)的天然氮源，具有廣闊的發(fā)展前景[2]。馬鈴薯蛋白能很好地被人體所吸收，屬于完全蛋白質(zhì)[3-4]，其蛋白效價可以與雞蛋、酪蛋白相媲美，營養(yǎng)價值優(yōu)于從谷物或豆類中提取的蛋白質(zhì)[5]。馬鈴薯蛋白最接近動物蛋白，是很好的保健食品[6-7]，其蛋白質(zhì)的凈消化利用率也很高[8]，馬鈴薯的蛋白可利用價值為71%，比谷物高21%。馬鈴薯中的必需氨基酸含量高于大多數(shù)糧食作物，富含賴氨酸、色氨酸，是一般糧食所不能比的。與大米和面粉相比，馬鈴薯具有更多的優(yōu)點(diǎn)，可以堪稱“十全十美的食物”[9]。近年來，馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)組學(xué)的研究有助于我們了解塊莖生長和發(fā)育機(jī)理，也有助于馬鈴薯塊莖產(chǎn)量及品質(zhì)等性狀的提高[10]。因此，開展馬鈴薯蛋白質(zhì)提取方法的研究對開展其他研究工作具有重要意義。

國內(nèi)外關(guān)于馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)提取方法的報(bào)道較少，李萌萌等開展了馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)提取方法的研究[11-12]。而由于馬鈴薯不同品種的蛋白質(zhì)含量存在很大差異，且受到環(huán)境溫度、薯塊成熟度及薯塊上不同部位的影響，其結(jié)果也不同，不同的材料需要采用適合其特性的部位進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取[11]。針對這些問題，本試驗(yàn)選用不同品種馬鈴薯的不同部位進(jìn)行不同提取方法的篩選，以期為馬鈴薯蛋白質(zhì)提取及其進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用馬鈴薯品種為克新1號（Kexin 1）、青薯168（Qingshu168），由寧夏固原天啟薯業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)1采用2因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素1為品種（V），V1為克新1號（Kexin 1）、V2為青薯168（Qingshu 168）；因素2為提取方法（T），分5個水平，T1為丙酮提取法，T2為鹽提取法，T3為三氯乙酸（TCA）提取法，T4為酚提取法，T5為醇提取法。試驗(yàn)重復(fù)3次，共10個處理。

試驗(yàn)2采用2因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素1為提取方法（T），分5個水平：T1～T5；因素2為取樣部位（P），分為3種處理：P1為芽眼部，P2為側(cè)部，P3為髓部。試驗(yàn)重復(fù)3次，共15個處理。

試驗(yàn)3采用2因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，因素1為品種（V），含V1、V2；因素2為取樣部位（P），分為3種處理：P1、P2、P3。試驗(yàn)重復(fù)3次，共6個處理。

1.2.2 馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取部位 芽眼部：芽眼在塊莖上呈螺旋狀排列，頂端密，基部稀，提取時繞芽眼周邊約0.7 cm、深度約0.6 cm提取。側(cè)部：即維管束環(huán)，從皮層往內(nèi)0.6 cm左右的厚度。髓部：塊莖中央部位，在塊莖的橫切面上，可以明顯地看出塊莖中央為髓部，外面圍繞著開放維管束環(huán)。

1.2.3 馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取方法 TCA提取法、丙酮提取法采用王改萍等的方法[13]。酚提取法、鹽提取法及醇提取法分別采用Hurkman等報(bào)道的方法[14-16]。

1.2.4 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用郭藹光等介紹的方法[17]進(jìn)行。用牛血清蛋白（BSA）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定595 nm處的吸光度。用繪圖軟件，以蛋白濃度為縱坐標(biāo)（y）、D595 nm為橫坐標(biāo)（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見圖1。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理后，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行2因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種對馬鈴薯蛋白質(zhì)含量的影響

由表1可知，不同品種之間蛋白質(zhì)含量不同，青薯168顯著高于克新1號。

2.2 提取方法對馬鈴薯蛋白質(zhì)含量的影響

由表2可知，不同提取方法對蛋白質(zhì)含量均有影響，TCA法、丙酮提取法、鹽提取法之間無顯著差異，但顯著高于酚提取法和醇提取法，后二者之間無顯著差異。

2.3 不同部位對馬鈴薯蛋白質(zhì)含量的影響

由表3可知，不同取樣部位對蛋白質(zhì)含量均有影響。芽眼部位蛋白質(zhì)含量顯著高于髓部和側(cè)部，但后二者之間無顯著差異。

2.4 品種和提取方法對馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)含量的影響

由表4可知，克新1號品種以TCA提取法為佳，青薯168品種以鹽提取法為佳，均以丙酮提取法次之。酚提取法、醇提取法提取的蛋白質(zhì)含量最低。

2.5 提取方法和取樣部位對馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)含量的影響

由表5可知，適合芽眼的提取方法有TCA提取法、鹽提取法，其次為丙酮提取法；適合側(cè)部的提取方法有鹽提取法、丙酮提取法，其次為TCA提取法；適合髓部的提取方法有丙酮提取法，其次為TCA提取法和鹽提取法；適合3個部位提取的最差方法為酚提取法、醇提取法。

2.6 品種和取樣部位對馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)含量的影響

由表6可見，不同馬鈴薯取樣部位、不同品種的蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)出一定的規(guī)律。馬鈴薯塊莖不同部位、品種間的蛋白質(zhì)含量差異基本達(dá)顯著水平。青薯168、克新1號均以芽眼部位含量最高，髓部最低。因此，這2個品種取樣的最佳部位均為芽眼。

3 討論

本試驗(yàn)以青薯168、克新1號的芽眼部、側(cè)部及髓部為試驗(yàn)材料，分別采用丙酮提取法、TCA提取法、鹽提取法、醇提取法、酚提取法提取蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，不同品種之間蛋白質(zhì)含量不同，青薯168顯著高于克新1號；不同提取方法之間蛋白含量不同，丙酮提取法、鹽提取法與TCA法提取的蛋白含量無顯著差異，但顯著高于酚提取法、醇提取法，而后二者無顯著差異；不同取樣部位對蛋白質(zhì)含量均有影響，芽眼部位蛋白質(zhì)含量顯著高于髓部、側(cè)部，但后二者之間無顯著差異；克新1號品種以TCA提取法為佳，青薯168品種以鹽提取法為佳，均以丙酮提取法次之，酚提取法、醇提取法提取的蛋白質(zhì)含量最低?？梢姡m合芽眼的提取方法有TCA提取法、鹽提取法，其次為丙酮提取法；適合側(cè)部的提取方法有鹽提取法、

丙酮提取法，其次為TCA提取法；適合髓部的提取方法有丙酮提取法，其次為鹽提取法和TCA提取法。綜合試驗(yàn)的可操作性，建議馬鈴薯蛋白質(zhì)采用丙酮提取法。

李萌萌等使用5種方法從馬鈴薯中薯9號塊莖中提取蛋白質(zhì)，并用Bradford法測定其中蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果顯示：磷酸緩沖液提取法的粗蛋白含量最高，為105.3 mg/L，其次是直接提取方法，為72.3 mg/L，提取蛋白質(zhì)最少的是酚提取法，為10.3 mg/L；蛋白質(zhì)純度最好的提取方法是TCA法，純度可達(dá)10.92%；其次是直接提取法，為7.66%；酚提取法最低，僅為1.32%[11]。以上結(jié)果綜合表明，直接提取法效果最好。范吉星等以紅海欖根為材料，比較丙酮沉淀法、TCA法、酚法等幾種方法，認(rèn)為上述方法均不甚理想，蛋白提取的純度較低，也無法呈現(xiàn)清晰的條帶，而經(jīng)過改良的酚法則得到了很好的效果[18]。谷瑞升等以木本植物為材料，比較丙酮沉降法、TCA法和直接提取法等方法，認(rèn)為丙酮沉降法最優(yōu)，建議馬鈴薯蛋白質(zhì)提取采用丙酮提取法[19]。

在本試驗(yàn)中，醇提取法、酚提取法效果均較差，蛋白質(zhì)損失量較高。而應(yīng)用丙酮提取法、鹽提取法、TCA提取法所得結(jié)果均比醇、酚提取法好，表明對于馬鈴薯塊莖來說，丙酮提取法、鹽提取法、TCA提取法可能是較適合的方法。但這些方法的不足之處是蛋白液中含有相對較多的雜質(zhì)，有可能對進(jìn)一步的深入研究帶來干擾。因此需要進(jìn)一步探索更適合、更簡便、更高效尤其是純度更高的馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)的分離純化方法，為利用和深入研究馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)提供依據(jù)。

有研究表明，料液比為1 g ∶10 mL、浸泡溫度為35 ℃、pH值為9.8、浸泡時間為1h時，鹽提取法提取馬鈴薯蛋白質(zhì)的得率最大，達(dá)0.80 g/100 g[15]。本試驗(yàn)的鹽提取法的條件大致相同，最終提取到的蛋白質(zhì)含量為159.67 mg/L。

TCA沉淀法、丙酮沉淀提取法是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析中最常見的提取方法，這2種方法雖然操作步驟少、耗時短、提取過程中損失較少、簡便易行，具有廣泛的適用性，在微生物材料以及動植物組織中具有很好的分離效果。但是沉淀所得提取物里含有大量的蛋白質(zhì)粗提物和雜質(zhì)，還需要除去雜質(zhì)并且需要強(qiáng)力的裂解緩沖液及機(jī)械輔助，才能提取到較純的蛋白質(zhì)。醇提取法在加2-氯乙醇提取之前通過加入氯化鈉除去鹽溶性蛋白，所以總體提取的蛋白含量很少，但是馬鈴薯醇提取蛋白僅適用于電泳分析技術(shù)。

酚提取法雖然提取的蛋白質(zhì)含量低，但卻是一種非常適合植物材料尤其是難提取材料的蛋白質(zhì)提取方法。植物細(xì)胞由于細(xì)胞壁和眾多胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)的存在，給蛋白質(zhì)提取、純化帶來了很大的難度。酚提法與TCA提取法、丙酮提取法的直接沉淀相比，避免了大量組織殘?jiān)?、水溶性雜質(zhì)的污染，也能除去鹽離子。在樣品制備過程中，核酸、鹽、酚、色素和多糖等可溶性物質(zhì)進(jìn)入水相，蛋白質(zhì)和脂類則進(jìn)入酚相，從而得到了分離。酚層中的蛋白質(zhì)可通過沉淀進(jìn)一步純化并除去鹽。該方法所得雜質(zhì)較少，很適合用于進(jìn)行電泳試驗(yàn)。TCA沉淀法雖然能夠很好地去除蛋白樣品中的鹽離子，但是對色素、多糖等雜質(zhì)的去除效果并不是很明顯，而且蛋白質(zhì)經(jīng)過多次沉淀后溶解是比較困難的，這樣會有很多蛋白質(zhì)損失。首先在樣品中加入聚乙烯吡咯烷酮吸附劑，這樣可以減少植物中的酚類、醌類和色素等次生代謝物質(zhì)的干擾；其次，酚可以有效去除樣品中的可溶性雜質(zhì)，也能除去鹽離子[20]。另外，由于酚的脂溶性，酚提取法非常有利于膜蛋白的提取，而膜蛋白往往與植物的耐鹽性密切相關(guān)[21]。因此，酚改良法是一種有效提取紅海欖根部蛋白的方法。

鹽提取法提取的蛋白質(zhì)含量雖高，但是相對于別的方法鹽提取法操作復(fù)雜，需要控制好pH值、溫度、料液比和提取時間等因素，同時透析袋的使用也不方便。當(dāng)樣品溶液中的鹽離子濃度超過100 mmol/L時，樣品的電內(nèi)滲比較高[22]，而且等電聚焦電壓也上不去，這會嚴(yán)重影響等電聚焦的進(jìn)行，因此可以認(rèn)為，鹽是雙向電泳最常見的一種雜質(zhì)。

4 結(jié)論

由本研究可以得出以下結(jié)論。（1）不同品種之間蛋白質(zhì)含量不同，青薯168顯著高于克新1號。（2）不同提取方法之間蛋白含量不同，丙酮提取法、鹽提取法和TCA法提取的蛋白含量無顯著差異，但顯著高于酚提取法、醇提取法，而后二者無顯著差異。（3）不同取樣部位對蛋白質(zhì)含量均有影響。芽眼部位蛋白質(zhì)含量顯著高于髓部和側(cè)部，但后二者之間無顯著差異。（4）2個品種有利于蛋白提取的組合，V1品種以V1T3為佳，V2品種以V1T2為佳。2個品種均為丙酮提取法較佳，最差為酚提取法、醇提取法，因此淘汰后2種方法。（5）適合芽眼的提取方法有TCA提取法、鹽提取法，其次為丙酮提取法；適合側(cè)部的提取方法有TCA提取法、丙酮提取法，其次為鹽提取法；適合髓部的提取方法有鹽提取法，其次為丙酮提取法、TCA提取法；3個部位最差為酚提取法、醇提取法，故淘汰后2種方法。（6）為了試驗(yàn)操作方便，建議馬鈴薯蛋白質(zhì)提取采用丙酮提取法。

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