曾娟妮 劉 筱 伍偉明 尹 婷 吳志榮 李文華

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

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美洲大蠊提取液對(duì)大鼠難愈合創(chuàng)面VEGF表達(dá)影響的研究

曾娟妮1劉 筱2伍偉明2尹 婷2吳志榮2李文華2

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

目的：探討外用單味動(dòng)物藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制。方法：將50只大鼠分為急性創(chuàng)面組、模型組、貝復(fù)濟(jì)組、美洲大蠊提取液組，用RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法，觀察大鼠皮膚修復(fù)組織VEGFmRNA的表達(dá)。結(jié)果：VEGFmRNA的表達(dá)在第5、7、11天，急性愈合創(chuàng)面組VEGFmRNA的表達(dá)量顯著高于美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組及模型組(P<0.01)；在第5、7、11天，美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量顯著高于模型組(P<0.01)；在第5、11天，美洲大蠊提取液組與貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；第7天，肉芽組織生長(zhǎng)期，美洲大蠊提取液組與貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：美洲大蠊提取液通過(guò)提高VEGFmRNA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

美洲大蠊提取液；慢性難愈合創(chuàng)面；RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；基因表達(dá)

慢性難愈合創(chuàng)面是指創(chuàng)面在各種內(nèi)外因素作用下不能通過(guò)正常的愈合進(jìn)程達(dá)到解剖和功能上的完整，從而進(jìn)入一種病理性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，最終導(dǎo)致經(jīng)久難愈。藥理研究證明美洲大蠊提取物能促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，促進(jìn)血管增生，加速壞死組織脫落，迅速修復(fù)各類(lèi)潰瘍及創(chuàng)傷創(chuàng)面；抗感染、消除炎性水腫，提高機(jī)體免疫功能；外用可快速激活局部免疫細(xì)胞，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間[1-2]。目前，美洲大蠊提取物被廣泛應(yīng)用在創(chuàng)面修復(fù)、胃潰瘍、腫瘤等領(lǐng)域[3-4]。筆者前期將美洲大蠊提取物外用于肛管難愈合創(chuàng)面，并取得滿意療效[5]。但其促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面的機(jī)制尚未探討。因此本實(shí)驗(yàn)研究從創(chuàng)面愈合機(jī)制為出發(fā)點(diǎn)，以RT-PCR為主要研究方法，從肉芽組織中新生血管為切入點(diǎn)，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從局部生長(zhǎng)因子等角度探討美洲大蠊促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制提供理論依據(jù)，并為中醫(yī)藥的外治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)50只大鼠，2月齡，體重200～250g，雌雄不限“均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，混合飼料單籠飼養(yǎng)”，50只大鼠隨機(jī)分組，先取12只建立大鼠急性愈合創(chuàng)面模型，其余38只建立大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型，慢性難愈合創(chuàng)面組再隨機(jī)分為模型組、貝復(fù)濟(jì)陽(yáng)性組(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20013152，實(shí)驗(yàn)全過(guò)程使用同批號(hào)藥物)、美洲大蠊提取液實(shí)驗(yàn)組(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000004，實(shí)驗(yàn)全過(guò)程使用同批號(hào)藥物)。

1.2 大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型建立 參照付小兵等[6]全層皮膚缺損法經(jīng)改進(jìn)制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 Trizol：Invitrogen；Real-time PCR mix：Promega A6001；DNA Marker：Fermentas；異丙醇：上?；瘜W(xué)試劑公司；氯仿：上?；瘜W(xué)試劑公司；引物：上海生工；Gold View核酸染料：上海生工；瓊脂糖粉：上海生工。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器及耗材 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo；核酸蛋白分析儀：德國(guó)eppendorf；PCR儀：德國(guó) Biometra；凝膠成像分析儀：美國(guó)Bio-Rad；微量移液器：德國(guó)eppendorf。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.5.1 引物設(shè)計(jì) 從NCBI中下載以下基因序列，引物設(shè)計(jì)采用Primer5.0軟件，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.5.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 從組織中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以該cDNA為模板，用針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)合成的QPCR引物進(jìn)行real-time PCR，以檢測(cè)組織中目的基因的表達(dá)。組織中總RNA抽提：①取50～100mg組織，每孔加入1000μL Trizol，吹打，室溫靜置5min；②每管加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置3min；4℃，12000rpm，離心15min；③從每管中吸取上清至另一新的1.5mL EP管。加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置20min；④4℃，12000rpm離心10min后，去上清；加入至少1mL 4℃預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀；⑤4℃，10000rpm離心5min，棄上清；4℃，10000rpm再次離心5min，吸去殘液，室溫干燥(不需完全干燥)；⑥加入20μL RNase-free水，至完全溶解，備用。

1.5.3 1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度。

1.5.4 第一鏈cDNA合成 ①取1.0μg Total RNA加Nuclease-Free Water到無(wú)RNA酶的EP管中，混勻后離心，70℃溫浴10min，立即置于冰上；②加一下反應(yīng)體系的其他試劑(冰上進(jìn)行)，混勻，短暫離心。③上述體系在42℃反應(yīng)15min，然后在70℃水浴鍋中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活。④將得到cDNA 置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2結(jié)果

2.1 1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度

2.2 VEGF電泳結(jié)果

圖2注：GAPDH電泳圖, 第 1、2、3泳道是急性愈合創(chuàng)面組，4、5、6泳道是模型組, 7、8、9泳道是貝復(fù)濟(jì)組，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液組。

圖3注：VEGF mRNA表達(dá)電泳結(jié)果,第1、2、3泳道是急性愈合創(chuàng)面組，4、5、6泳道是模型組, 7、8、9泳道是貝復(fù)濟(jì)組，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液組，可反映出VEGFmRNA的表達(dá)量從高到低依次是急性愈合創(chuàng)面組、貝復(fù)濟(jì)組、美洲大蠊提取液組、模型組，在第7天，美洲大蠊提取液組與貝復(fù)濟(jì)組的VEGFmRNA的表達(dá)量無(wú)明顯差異。

2.3 結(jié)果(見(jiàn)表2)

表2 VEGF基因表達(dá)情況 (平均光密度值

注：美洲大蠊提取液組與急性愈合創(chuàng)面組比較,▲▲P<0.01；美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組與模型組比較,△△P<0.01；美洲大蠊提取液組與貝復(fù)濟(jì)組比較，*P<0.05。

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在第5天、第7天、第11天，急性愈合創(chuàng)面組VEGFmRNA的表達(dá)量顯著高于美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組及模型組(P<0.01)，表明造模成功；在第5天、第7天、第11天，美洲大蠊提取液組、貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量顯著高于模型組大鼠(P<0.01)；在第5天、第11天，美洲大蠊提取液組比貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量稍低，但差異不明顯(P>0.05)；在第7天的肉芽組織生長(zhǎng)期，美洲大蠊提取液組與貝復(fù)濟(jì)組VEGFmRNA的表達(dá)量無(wú)差異(P>0.05)；表明美洲大蠊提取液在創(chuàng)面肉芽生長(zhǎng)期能誘導(dǎo)內(nèi)源性VEGF的基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成并減少效應(yīng)T細(xì)胞在組織局部蓄積的作用，促進(jìn)創(chuàng)面血液循壞、增強(qiáng)創(chuàng)面免疫力，從而促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)、抑制瘢痕生長(zhǎng)。

3.2 血管生成可為創(chuàng)面的修復(fù)提供充足的氧分,有利于細(xì)胞的增殖；新生血管是肉芽組織的主要成分,肉芽組織是膠原沉積、改建的場(chǎng)所,因此,血管新生是創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中重要的一環(huán)[7]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種特異的直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，可以刺激體內(nèi)尤其是缺血部位的血管生成，是迄今為止已知的最強(qiáng)烈的促血管生長(zhǎng)因子，它主要是通過(guò)啟動(dòng)微血管發(fā)生的初始過(guò)程-出芽，并最終形成成熟的血管結(jié)構(gòu)[8].因此，VEGF在皮膚潰瘍愈合過(guò)程中起決定性作用。在慢性創(chuàng)面，由于VEGF表達(dá)較正常創(chuàng)面下調(diào)而導(dǎo)致血管生成的下降,被認(rèn)為是慢性創(chuàng)面難愈合的重要原因[9]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)肉芽結(jié)果中VEGFmRNA的表達(dá)來(lái)探討單味動(dòng)物中藥對(duì)促愈具有非常重要的意義，但美洲大蠊提取液在創(chuàng)面重塑期與貝復(fù)濟(jì)組表達(dá)有差異，那么它是否能減少瘢痕的形成有待于進(jìn)一步探討。

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(編輯：穆麗華)

On Effect of American Periplaneta Extract on VEGF’s Gene Expression of Rats’ Chronic Refractory Wound

ZENG Juanni1LIU Xiao2WU Weiming2YIN Ting2WU Zhirong2LI Wenhua2

1.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410000,China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China

Objective to study the external use of traditional Chinese medicine of single animal to promote the mechanism of wound healing.Methods dividing 50 rats into acute wound group, model group, rb-bfgf group, and American periplaneta extract group, using RT-PCR testing method to observe the rat’s expression of skin repairing tissue of VEGFmRNA. Results the expression of VEGFmRNA on the fifth day, the seventh day and the eleventh day,the acute healing wound group has a significantly higher amount of expression than American periplaneta extract group and rb-bfgf group (P<0.01); On the fifth day, the seventh day and the eleventh day, the expressions of VEGFmRNA of both American periplaneta extract group and rb-bfgf group are significantly higher than model group (P<0.01); On the fifth day and the eleventh day, American periplaneta extract group has difference with the rb-bfgf group on the expression quantity of VEGFmRNA(P<0.05), on the seventh day, which is the growing period of granulation tissue, American periplaneta extract group has no difference with rb-bfgf group on the expression quantity of VEGFmRNA (P>0.05).Conclusion American periplaneta extract promotes the wound healing by increasing the expression of VEGFmRNA.

American Periplaneta Extract; Chronic Refractory Wound; Rt-pcr (reverse transcription and polymerase chain reaction; Genetic Expression

2016-07-14

本課題受湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：201466)支助;湖南省教育廳重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)外科學(xué)一肛腸方向?qū)ｍ?xiàng)支助。

曾娟妮(1979-)，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事肛腸疾病的研究與治療，E-mail：zengjuanni@yahoo.cn

R285.5

A

1007-8517(2016)19-0064-03