劉云龍，張學雷

（1.中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東青島266100；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島266061；3.國家海洋局海洋生態(tài)環(huán)境科學與工程重點實驗室，山東青島266061）

鹽度對大葉藻種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育的影響

劉云龍1，3，張學雷2，3*

（1.中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東青島266100；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島266061；3.國家海洋局海洋生態(tài)環(huán)境科學與工程重點實驗室，山東青島266061）

大葉藻海草場是重要生境但在我國嚴重退化，亟需研究有效的修復方法。本文以桑溝灣的大葉藻種子為研究對象，探討了鹽度急變（0～30）對種子萌發(fā)、萌發(fā)后繼續(xù)發(fā)育和存活及幼苗幼葉的光合與呼吸速率的影響，為以種子繁殖修復大葉藻海草場提供參考。結果表明：鹽度降低促進種子萌發(fā)，鹽度15及以下效果顯著，鹽度0時萌發(fā)率最高；鹽度0～15中萌發(fā)的種子均可發(fā)育成幼苗，發(fā)育和衰亡的比例和速率受萌發(fā)鹽度背景和萌發(fā)后培養(yǎng)鹽度的雙重影響——較高萌發(fā)鹽度有利于種子萌發(fā)后的發(fā)育和存活，種子萌發(fā)后于鹽度5～30中均可建成幼苗并存活、但在鹽度0或1中發(fā)育至不同程度后全部死亡。鹽度5～30范圍內，幼苗幼葉均有凈產氧，光合和呼吸作用及凈產氧率具隨鹽度升高而增強趨勢。于鹽度0或5中萌發(fā)、鹽度5～30中進一步培育的變鹽育苗策略，最高實現(xiàn)了24%或12%的種子于2個月內建成幼苗并繼續(xù)發(fā)育，可作為種子繁殖法修復大葉藻海草場的技術參考。

大葉藻；海草；種子；萌發(fā)；幼苗；鹽度

1　引言

大葉藻（Zostera marina L.）是溫帶近岸的海生沉水性高等植物［1］，其形成的海草場與紅樹林、珊瑚礁等生態(tài)系統(tǒng)齊名［2］：生產力和生物多樣性高［3—4］，對近岸生物地球化學循環(huán)有重要影響［5—7］。

大葉藻海草場退化會導致環(huán)境惡化、漁業(yè)資源減少等［8—9］，促使人們重視其意義并嘗試進行修復［10—16］。種子繁殖法已成為大葉藻海草場修復的研究熱點［15—20］，但其有效性卻一直受種子自然萌發(fā)率低［16，21—22］、萌發(fā)周期長［23］及幼苗建成率低［11，16］等瓶頸問題的限制。因此，鹽度、溫度和溶氧等［24—26］多種影響大葉藻種子萌發(fā)的因素得到關注，其中關于鹽度對大葉藻種子萌發(fā)的影響研究較多卻仍存有分歧：許多研究認為鹽度降低促進大葉藻種子萌發(fā)、提高種子萌發(fā)率［24—30］。但也有研究發(fā)現(xiàn)鹽度15與35中萌發(fā)率相近［23］，甚至認為鹽度對萌發(fā)并無重要影響［21］——這或如Phillips等［27］所研究和歸納：鹽度對不同區(qū)域、不同種群的大葉藻種子萌發(fā)具不同效果。此外，鹽度對大葉藻種子發(fā)育形成幼苗的影響也未見確切報道。

我國北方海域一度繁盛的大葉藻海草場［31］，目前已嚴重退化［6，32］，亟需得到保護和修復。本研究擬闡明鹽度對種子萌發(fā)和后續(xù)發(fā)育的影響，為利用種子繁殖法大規(guī)模修復海草場提供依據(jù)。

2　材料與方法

2.1實驗材料

2014年7月，當?shù)卮笕~藻果實集中成熟期［1，33］，于山東省榮成市桑溝灣東楮島近岸（鹽度30，水溫22℃）大葉藻海草場［6，34］（37.0420°N，122.5726°E）人工采集成熟種子（具灰綠、暗棕或黑色堅硬外殼作為成熟標準［1，35］，圖1a），沉于室內水族箱的循環(huán)流動自然海水（鹽度30±2，水溫15～20℃）中避光保存2個月（根據(jù)Orth和Marion［36］修改）。

圖1　大葉藻種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育過程形態(tài)變化Fig.1 The morphology changes of Z．marina during seed germination and seedling formation and development

實驗中不同鹽度的海水培養(yǎng)液由鹽度30天然海水（取自青島沙子口附近，經(jīng)孔徑0.8μm濾膜過濾）與鹽度0去離子水（自來水經(jīng)UNIQUE-R20型超純水機處理）按比例配制而成。

2.2實驗方法

2.2.1大葉藻種子萌發(fā)培養(yǎng)

隨機選取海草種子置于6孔無菌培養(yǎng)板內，每孔置20粒種子、10 mL培養(yǎng)液（去離子水或鹽度5、10、15、20、30的海水），每個鹽度處理為1組，設6個平行（1板6孔），于人工恒溫氣候室內15℃避光培養(yǎng)（大葉藻種子萌發(fā)適宜水溫為10～15℃［37］）。每天固定時間段統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)、并將其取出，每3 d更換一次培養(yǎng)液。

2.2.2萌發(fā)種子的繼續(xù)培育

首先，隨機選取海草種子置于盛有去離子水或鹽度5、15海水的錐形瓶中，每瓶置5 000粒種子、2 L培養(yǎng)液，人工恒溫氣候室內15℃避光培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液并取出已萌發(fā)種子。

第二步，將上述處理中第20 d所獲的萌發(fā)種子和鹽度30海水保存過程中自然萌發(fā)的種子分別轉入無菌培養(yǎng)板中，每孔5粒種子和10 mL培養(yǎng)液為一個平行，每處理組設3～8個平行（因萌發(fā)種子數(shù)量不同而有差異）。其中，經(jīng)鹽度0培養(yǎng)萌發(fā)的種子直接轉入鹽度0、1、5、10、15、20和30的培養(yǎng)液中；鹽度5中萌發(fā)的種子直接轉入鹽度5、10、15、20和30的培養(yǎng)液中；鹽度15中萌發(fā)的種子直接轉入鹽度15、20和30的培養(yǎng)液中；鹽度30中萌發(fā)的繼續(xù)在鹽度30的新培養(yǎng)液中培養(yǎng)。于20℃（大葉藻幼苗生長適溫15～25℃［37-38］）人工氣候室內的回旋振蕩器（120 r／min）上培養(yǎng)40 d，光照／黑暗：12 h／12 h（光照強度：3 000 lx）。每天固定時間段觀察、記錄已萌發(fā)種子的發(fā)育生長情況并取出已建成完整幼苗繼續(xù)培育，每3 d更換新鮮培養(yǎng)液。

2.2.3幼苗的繼續(xù)培育

將2.2.2中所獲的完整幼苗轉入新的無菌培養(yǎng)板中繼續(xù)培育，每孔1苗和10 mL與之前培養(yǎng)鹽度相同的海水，光、溫條件同2.2.2，與同步進行的2.2.2實驗同時結束。每天固定時間段觀察、記錄幼苗的發(fā)育情況，每3 d更換一次新鮮培養(yǎng)液。

2.2.4幼苗的氧代謝測定

取鹽度0中萌發(fā)種子在鹽度5、10、15、20和30海水中發(fā)育成的具2片幼葉的幼苗，經(jīng)黑暗培養(yǎng)6 h后，迅速剪取（位置如圖1-Ⅳ中紅框示）幼葉、瀝去表面海水后稱重（Sartorius分析天平，精確至0.000 1 g），剪切為2～3 mm長片段與原海水培養(yǎng)液2 mL一起轉入液相氧電極測定儀（Hansatech Chlorolab-2型）反應杯中，加封電極后微轉子攪拌（30 r／min）于20℃測定溶解氧值的變化：首先無光處理，1 min后記錄5 min溶解氧值下降數(shù)據(jù)；隨后打開LED光源（波長627 nm，光量子通量400μmol／（m2·s）；預試驗表明此光照強度無光抑制作用）記錄15 min溶解氧值變化數(shù)據(jù)。

2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析

子葉端（內含種胚）種皮發(fā)生脹裂后，子葉和胚軸均完全顯露的大葉藻種子為已萌發(fā)種子［26］（圖1c）；萌發(fā)后的種子分化出第一幼葉和幼根為建成的完整大葉藻幼苗［29］（圖1f）；大葉藻幼苗分化出第二幼葉（圖1g）為進一步發(fā)育的標志。

萌發(fā)率=n／N×100%，N和n分別為培養(yǎng)孔中種子粒數(shù)和觀察期內萌發(fā)種子的累積粒數(shù)；

第一幼葉分化率、完整幼苗建成率均按n／N× 100%計算，n為萌發(fā)種子經(jīng)培育40 d分化出第一片幼葉或建成完整幼苗的個數(shù)，N為培養(yǎng)孔中的初始萌發(fā)種子數(shù)；

死亡率=n／N×100%，n為40 d培育期內培養(yǎng)孔中發(fā)生死亡、腐爛的種子和幼苗累積總數(shù)，N為培養(yǎng)孔中的初始萌發(fā)種子數(shù)；

第二幼葉分化率=n／N×100%，n為實驗期內各處理組中由N個完整幼苗形成的具2幼葉幼苗的個數(shù)。

以液相氧電極測定儀自配軟件，分別計算溶解氧曲線在無光降低和有光上升段的變化速率［Δ，μmol／（mL·min）］，再計算大葉藻葉片的呼吸耗氧［R，μmol／（min·g）］和凈產氧速率［P，μmol／（min·g）］：

式中，v為反應杯內液體體積（單位：mL），m為受試葉片鮮重（單位：g）；光合作用產氧速率［μmol／（min· g）］=R+P。

以SPSS 17.0軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗鹽度對種子萌發(fā)率和育苗鹽度對萌發(fā)種子的第一幼葉分化率、幼苗建成率、死亡率、幼葉耗氧及凈放氧速率的總體效應，如檢驗出顯著總體效應則以LSD或Tamhane's T2檢驗比較各鹽度處理間的效果差異［39］。統(tǒng)計檢驗中的萌發(fā)率、第一幼葉分化率、幼苗建成率和死亡率值均經(jīng)反正弦轉換，以p＜0.05作為顯著性水平。

3　結果

3.1鹽度對種子萌發(fā)率的影響

大葉藻種子萌發(fā)率呈隨鹽度降低而增加的趨勢（圖2），實驗鹽度0～15的培養(yǎng)液中均有種子萌發(fā)而鹽度20～30中無種子萌發(fā)。低鹽度0～15中培養(yǎng)3 d即有種子萌發(fā)，培養(yǎng)20 d后萌發(fā)率僅有緩慢增加。第21 d鹽度0中萌發(fā)率平均為57.5%，高于鹽度5及以上中的萌發(fā)率（p＜0.05）；鹽度5中萌發(fā)率平均為17.5%，高于鹽度10及以上的萌發(fā)率（p＜0.05），鹽度10和15中萌發(fā)率平均分別為5.8%和4.2%。與之相比，鹽度30中堆存2個月的種子自然萌發(fā)率低于0.2%。

圖2　不同鹽度海水培養(yǎng)21 d大葉藻種子累積萌發(fā)率（平均值±標準誤差，字母示萌發(fā)率的統(tǒng)計分析差異）Fig.2 Accumulated germination rates（mean±S.E.）of Z．marina seeds incubated at different salinities in 21 days.The letters above bars indicate the significant differences of the germination rates

圖3　后續(xù)培養(yǎng)鹽度對0～15鹽度中萌發(fā)的大葉藻種子發(fā)育和死亡率的影響（平均值±標準誤差）Fig.3 Effects of post-germination incubation salinities on development and mortality of Z．marina seeds germinated at salinities 0-15

3.2鹽度對種子萌發(fā)后繼續(xù)發(fā)育的影響

萌發(fā)和育苗鹽度對種子萌發(fā)后的第一幼葉分化率、幼苗建成率和死亡率均有影響：總體上，隨萌發(fā)培養(yǎng)鹽度升高，第一幼葉分化率、幼苗建成率有增加趨勢而死亡率呈降低趨勢（圖3）；育苗鹽度對第一幼葉分化率、幼苗建成率和死亡率的影響程度不同，其中育苗鹽度0中種子形成第一幼葉后即死亡、育苗鹽度1中幼苗建成后即死亡（圖3），鹽度0～15中萌發(fā)的種子在鹽度5～30中可建成幼苗并繼續(xù)發(fā)育（圖3、4）（但鹽度0、5中萌發(fā)種子于鹽度30中的第一幼葉分化率和幼苗建成率均較低而死亡率高，圖3），育苗鹽度升高呈促進已建成幼苗繼續(xù)發(fā)育的趨勢（圖4）。

圖4　幼苗在不同鹽度中的第二幼葉分化率Fig.4 Percentages of Z．marina seedlings with two leaves at different salinity treatments

在適宜育苗的鹽度5～30中，平均60%以上萌發(fā)種子可形成第一幼葉（但鹽度0萌發(fā)鹽度30育苗僅35%形成第一幼葉）、平均35%～85%可建成幼苗（但鹽度0萌發(fā)鹽度30建苗率低于5%）（圖3），建成的幼苗50%以上可以繼續(xù)發(fā)育（圖4）。與之相比，鹽度30中堆存種子自然萌發(fā)后的建苗率為67%、死亡率為33%（圖5），建成的幼苗90%可以繼續(xù)發(fā)育（圖4）。

圖5　鹽度30中堆存種子自然萌發(fā)后的繼續(xù)發(fā)育進程Fig.5 The development of Z．marina seeds that germinated naturally during massive storage at salinity 30

鹽度對種子萌發(fā)后的發(fā)育和死亡速率也有影響，趨勢是隨萌發(fā)鹽度的降低、育苗鹽度的升高，種子萌發(fā)后的發(fā)育減緩，死亡也隨萌發(fā)鹽度降低和適宜育苗鹽度升高而較早出現(xiàn)。鹽度30中堆存種子自然萌發(fā)后4 d初現(xiàn)第一幼葉、7 d全部形成第一幼葉，第11 d出現(xiàn)完整幼苗，12 d出現(xiàn)死亡（圖5）。與之相比，鹽度0～15中種子萌發(fā)后，第一幼葉最早出現(xiàn)在4 d和3 d，育苗鹽度15～30間又有1～2 d的延遲；完整幼苗最早形成于6 d，但相同的適宜育苗鹽度（15、20或 30）中完整幼苗初現(xiàn)時間因萌發(fā)鹽度0～15變化而有1 d～2 d提前，育苗鹽度5～30間也有1 d～17 d的延遲；死亡最早于5 d、6 d和7 d初現(xiàn)，適宜育苗鹽度15～30間死亡初現(xiàn)也有3 d～5 d的提前（圖6）。

圖6　后續(xù)培養(yǎng)鹽度對0～15鹽度中萌發(fā)的大葉藻種子第一幼葉、完整幼苗和死亡初現(xiàn)時間的影響Fig.6 Effects of post-germination incubation salinities on the emergence of the first leaf，seedling and mortality of Z．marina seeds germinated at salinities 0-15

3.3鹽度對幼苗葉片氧代謝的影響

大葉藻幼苗幼葉光合作用的產氧速率（凈產氧與耗氧速率之和）于鹽度5中最低［平均0.501μmol／（min·g）］、鹽度30中最高［平均0.687μmol／（min· g）］，呈現(xiàn)隨鹽度升高而增加的趨勢；幼葉凈產氧速率隨鹽度升高也有增加的趨勢，凈產氧速率在鹽度30中最高［平均0.363μmol／（min·g）］、鹽度10中最低［平均0.226μmol／（min·g）］；幼葉呼吸耗氧率亦呈隨鹽度升高而增加的趨勢，于鹽度5中最低、鹽度30中最高［平均分別為0.246μmol／（min·g）、0.324 μmol／（min·g）］（圖7）。

圖7　海草幼苗葉片在不同鹽度海水中的氧代謝速率（平均值±標準誤差）Fig.7 Rates（mean±S.E.）of respiration and net oxygen production by young leaves of Z．marina seedlings at different salinities

4　討論

如引言中述及，關于鹽度對大葉藻種子萌發(fā)影響的研究結果存有分歧；本研究的結果顯示桑溝灣的大葉藻種子萌發(fā)率受鹽度影響顯著，且萌發(fā)率具隨鹽度降低而提高趨勢、在淡水中具顯著最高的萌發(fā)率（圖2），這與Yamaki和Ogawa［40］對相近緯度的日本中部同種海草研究結果相符，支持關于低鹽度對大葉藻種子萌發(fā)有促進作用的多數(shù)研究結果［24—30］。低鹽度促進萌發(fā)作用的機制仍尚不明確，可能與種子萌發(fā)需自外界吸收水分以支持其胚細胞橫向擴張、子葉及胚軸增大與伸長［41—42］有關，而低鹽度和淡水中的低滲透環(huán)境有利于大葉藻種子吸收水分。此外，大葉藻等海草被認為是遠古淡水或陸生植物在海侵中演化成的適應海洋沉水生活的高等植物［43—44］，低鹽度甚至淡水促進其種子萌發(fā)或反映了其進化遺跡，或呈現(xiàn)了許多生物早期發(fā)育中會出現(xiàn)的“返祖現(xiàn)象”［45］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)鹽度和育苗鹽度對大葉藻種子萌發(fā)后的發(fā)育均有影響（圖3、4和6），即較高萌發(fā)鹽度有利于種子萌發(fā)后的發(fā)育和存活、鹽度0～15中萌發(fā)的種子于鹽度5～30中進一步培養(yǎng)均可建成幼苗并存活，與已報道的低鹽度中萌發(fā)的種子發(fā)育和存活能力減弱［46］相符，也支持鹽度0～30中萌發(fā)種子均可形成幼苗的報道［29，46］。種子萌發(fā)后的發(fā)育和存活也受育苗鹽度的限制，盡管有大葉藻能于含足夠無機碳的蒸餾水中存活的報道［47］，本研究卻發(fā)現(xiàn)大葉藻于鹽度5及以上才能繼續(xù)存活、發(fā)育（圖3、4），支持大葉藻存活于鹽度5～42中的報道［47—49］；這和育苗鹽度升高（5～30）利于幼苗繼續(xù)發(fā)育的結果（圖4、6）一起反映了大葉藻作為海生植物的進化適應，即盡管其種子萌發(fā)期仍保留淡水適應的返祖現(xiàn)象，其成苗和生長仍對海水有絕對需求。

結果顯示鹽度5～30中的幼苗幼葉均有凈產氧（圖7），即有機物在體內有凈積累，部分解釋了上述范圍鹽度中大葉藻幼苗可存活、發(fā)育的生理基礎；同時，幼葉光合作用隨鹽度升高而增強的趨勢也支持已有報道［50］，與隨育苗鹽度升高幼苗的繼續(xù)發(fā)育受促進的趨勢一起，支持較高鹽度23～31更適合大葉藻幼苗生長的報道［49，51］。但隨著育苗鹽度升高（15～30），種子萌發(fā)后的發(fā)育減緩、死亡也較早出現(xiàn)（圖6），提示存在除有機物合成積累以外的因素制約。

本文中，大葉藻種子經(jīng)低鹽度0、5或15萌發(fā)培養(yǎng)21 d，再轉入鹽度5～30繼續(xù)培育40 d，最高分別可實現(xiàn)平均24.4%、12.3%或2.5%的建苗并繼續(xù)發(fā)育，這顯著高于同期在鹽度30堆存的大葉藻種子2個月內的自然萌發(fā)成苗率（小于0.2%），也優(yōu)于已報道的人工播種在海區(qū)的大葉藻種子6個月的成苗率（0～3.7%）［18］。該結果揭示了人為低鹽或淡水促萌接續(xù)適宜鹽度培育進行大葉藻育苗的優(yōu)越性，展示了利用種子繁殖修復大葉藻海草場的可行性。但本研究也發(fā)現(xiàn)，低鹽度0～5中萌發(fā)的種子直接轉入較高鹽度育苗的高死亡率（圖3）會影響利用該人工育苗技術的有效性，育苗鹽度升高（15～30）有延遲幼苗發(fā)育和縮短存活期的趨勢（圖6），因此對相應鹽度處理（如：萌發(fā)種子對鹽度變化的過渡適應）需進一步探索。

5　總結

鹽度對大葉藻種子萌發(fā)、幼苗的形成發(fā)育和存活均具影響，也影響其幼苗的光合和呼吸作用速率。降低鹽度促進大葉藻種子萌發(fā)，鹽度降為15及以下時有顯著高的萌發(fā)率，淡水中萌發(fā)率最高；由此獲得的萌發(fā)種子在鹽度5～30中均可建成完整幼苗、存活并繼續(xù)發(fā)育，較高鹽度更適宜幼苗發(fā)育和生長；通過適當變鹽度培養(yǎng)處理（鹽度0或5培養(yǎng)種子萌發(fā)、鹽度5～30培育萌發(fā)種子），最高可實現(xiàn)24%或12%的種子于2個月內形成健全幼苗并繼續(xù)發(fā)育，展示出利用種子繁殖修復大葉藻海草場的可行性和有效性。

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The effects of salinity on seed germination and seedling development of the seagrass，Zostera marina L.

Liu Yunlong1，3，Zhang Xuelei2，3
（1．College of Environmental Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266100，China；2．First Institute of O-ceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China；3．Key Lab of Science and Engineering for Marine Ecology and Environment，State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China）

Critical habitats of Zostera marina beds have greatly declined and request studies of effective method（s）for rehabilitation.Seeds of Z．marina were collected from Sanggou Bay，Dongchudao，Rongcheng，Shandong，China，and the effects of acute salinity variation（0-30）on the seed germination and seedling development were studied in the laboratory，to provide information for the rehabilitation of seagrass bed with seed reproduction.The results showed that lowering salinity induced the germination rate of Z．marina seeds，with significance occurred at salinities 15 and lower，and the highest germination rate at salinity 0.Seeds germinated at salinities 0，5 and 15 could develop into seedlings and survive，with the percentage and time period influenced by both germination salinity background and post-germination incubation salinity：（1）higher germination salinities promoted germinated seeds developing into seedlings and surviving better，（2）seedlings were established and continued growth and further development at post-germination incubation salinities 5-30，while 100%mortality occurred after various development at salinity 0 or 1.Seedling leaves presented net production of oxygen at salinities 5-30，with a trend of higher gross and net production of oxygen and higher respiration rates at higher salinities.The results indicated that Z．marina seeds could produce 24%or 12%of health seedlings within two months treatment of acute salinity variation，germinating at salinities 0 or 5 and developing at salinities 5-30，which presented a practical method of seagrass bed rehabilitation with Z．marina seeds.

Zostera marina L.；seagrass；seed；germination；seedling；salinity

劉云龍，張學雷.鹽度對大葉藻種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育的影響［J］.海洋學報，2016，38（2）：104—111，

10.3969／j.issn.0253-4193.2016.02.010

Liu Yunlong，Zhang Xuelei.The effects of salinity on seed germination and seedling development of the seagrass，Zostera marina L.［J］.Haiyang Xuebao，2016，38（2）：104—111，

10.3969／j.issn.0253-4193.2016.02.010

Q331

A

0253-4193（2016）02-0104-08

2015-08-11；

2015-11-24。

國家自然科學基金委-山東省聯(lián)合基金項目“海洋生態(tài)與環(huán)境科學”（U1406403）。

劉云龍（1986—），男，山東省臨沂市人，博士生，主要從事海洋生態(tài)保護與修復研究。E-mail：liuyunlong＠fio.org.cn

張學雷（1973—），男，博士，研究員，主要從事海洋生態(tài)保護與修復、生物多樣性等研究。E-mail：zhangxl＠fio.org.cn