姚 紅 （山東省東平縣畜牧獸醫(yī)局 271500）

犬細小病毒的分離鑒定

姚 紅 （山東省東平縣畜牧獸醫(yī)局 271500）

犬細小病毒(canine parvovirus, CPV)屬于自主復(fù)制性細小病毒科，細小病毒屬，它能引起急性腸炎，白細胞減少，嘔吐以及幼犬的心肌炎等病癥。為了更好的了解犬細小病毒病在我國的流行和變異情況，通過對寵物醫(yī)院疑似犬細小病毒病例進行病毒分離，分離出一株犬細小病毒，經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生物學(xué)以子病毒學(xué)等鑒定，證明分離出的毒株為細小病毒。

1 犬細小病毒病原生物學(xué)

犬細小病毒(canine parvovirus, CPV)是細小病毒科，細小病毒亞科，細小病毒屬的成員，具有細小病毒屬的典型形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

1.1 形態(tài)特點與理化性質(zhì)

CPV的病毒粒子為等軸對稱的二十面體，無囊膜，抗氯仿，耐酸耐熱。在電鏡下觀察病毒顆粒的外觀呈圓形或六邊形，直徑為20～24nm[1]。

1.2 血凝特性

CPV具有血凝特性，能凝集豬及恒河猴的紅細胞(本試驗用的是豬的紅細胞)，這一特性可作為病毒特性的參考指標。

1.3 病毒培養(yǎng)特性

小病毒的DNA復(fù)制發(fā)生在細胞核內(nèi)，其復(fù)制過程出現(xiàn)于細胞周期的S期。這是因為細小病毒DNA復(fù)制完全依賴于宿主DNA聚合酶及其復(fù)制體系。如果利用DNA聚合酶抑制劑處理宿主細胞，細小病毒DNA在宿主細胞內(nèi)完全不能進行復(fù)制。所以當體外進行該病毒培養(yǎng)傳代時，不能像一般常規(guī)實驗?zāi)菢拥鹊郊毎L成單層后才接毒，而必須在細胞培養(yǎng)的同時或最遲在24h內(nèi)接種病毒，這樣才能達到使病毒增殖的目的。

1.4 犬細小病毒衣殼蛋白

據(jù)文獻[3]報道CPV衣殼蛋白是由VP1和VP2構(gòu)成，VP3是VP2的裂解物，它只在衣殼裝配和病毒基因組包裝后才出現(xiàn)，其相對量隨著感染進程和發(fā)展而增加。CPV粒子表面由60個機構(gòu)亞單位裝配而成，其中VP2占到54～55個，而VP1只占到5～6個[4]，因此VP2是構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分，同時細小病毒的主要抗原位點也在VP2蛋白上，因此VP2上的幾個堿基和氨基酸的改變就會影響抗原特征和宿主范圍，CPV以及CPV不同病毒型間存在差異[5]。

2 犬細小病毒的分離與鑒定

2.1 犬細小病毒的分離

本試驗通過貓?zhí)ツI細胞(F81)增殖犬細小病毒，同時采用同步接毒的方法使病毒增殖，最后收獲病毒，進行鑒定試驗。

2.1.1 試驗試劑及儀器 （1）病料：在周邊寵物醫(yī)院采集臨床表現(xiàn)有體溫升高、嘔吐、血樣腹瀉、脫水等癥狀的疑似犬細小病毒的病例中，采集糞樣。（2）細胞株：貓?zhí)ツI細胞(F81) （3）主要試劑：胰蛋白酶，，胎牛血清(FCS)。（4）主要器材70P-72型超速離心機，購自日本HITACHI公司；DW-40L262型立式醫(yī)用冰箱，購自中國海爾公司。（5）各種溶液的配制：①DMEM 營養(yǎng)液的配制：取DMEM粉劑一袋(13.5)，再用電子天平稱取碳酸氫鈉1.5g，放入1500ml的圓底燒瓶中，緩緩加入三餾水定容至1L，混勻后用10mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH值到7.2～7.4，用0.22μm的一次性濾器過濾除菌后，再分別加入2%和10%的胎牛血清，放入4℃冰箱中保存待用。②D-Hanks液的配制：用電子天平分別稱取氯化鈉0.40g、磷酸二氫鉀0.06g、氯化鈉8.00g、碳酸氫鈉0.35g、磷酸氫二鈉0.09g、酚紅0.01g加入1500ml的圓底燒瓶中，緩緩加入三餾水定容1L，全部混勻后用1mol/L的氫氧化鈉或者1mol/L的鹽酸調(diào)pH為7.2，然后智能壓力蒸汽滅菌器121℃高壓滅菌20min，至4℃冰箱內(nèi)儲存。②0.25%的胰酶的配制：用電子天平分別稱取胰蛋白酶(1∶250)1.25g、EDTA二鈉0.514g、葡萄糖2.5g加入容量瓶中，緩緩加入D-Hanks液定容至500ml，然后用 一次性濾器濾過，在分裝到青霉素瓶中，用封口條封好后放入-20℃的冰箱中儲存。②PBS 液的配制∶用電子天平分別稱取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉1.15g、磷酸二氫鉀0.2g放入容量瓶中，加入100mol/L的EDTA20ml，然后用蒸餾水稀釋至1000ml。

2.1.2 細胞培養(yǎng)與病毒增殖 （1）病毒的粗提：取寵物醫(yī)院采集的糞便用Hanks液配制成1∶10的乳劑，離心10min，取上清，經(jīng)0.22μm微孔濾膜無菌濾過后準備接種。（2）細胞復(fù)蘇：把細胞凍存管從液氮中迅速取出，立即放入40℃水浴中，邊浸邊搖動，使細胞凍存液盡快融化，用75%的酒精棉擦拭凍存管，打開管蓋，吸出細胞懸液，然后800rpm/min離心5min，吸棄凍存液，準備進行細胞培養(yǎng)。（3）細胞培養(yǎng)：復(fù)蘇的細胞接入100ml的細胞瓶內(nèi)并加入細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，把細胞瓶置于培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)培養(yǎng)，第2天觀察細胞的生長狀態(tài)，待到細胞基本長滿單層時進行傳代，具體方法是傾棄細胞舊液，用Hanks液洗滌2～3次，之后加入0.25%的胰酶(以浸沒細胞單層為佳)進行消化，待細胞將要分離而呈圓粒時，加入細胞維持液終止消化，用刻度吸管反復(fù)吹打細胞，直至完全分散，重新懸浮細胞，按一傳而接入新的細胞瓶中，置于培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)培養(yǎng)。（4）病毒的增殖與提純∶采用同步接毒的方法，取長滿單層的細胞在細胞傳代的同時將帶接種的樣品按19接種細胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5%CO2)24h后再換維持液，繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)正常細胞作對照。每天在電鏡下觀察接毒后的細胞形態(tài)，并更換維持液，5d左右把細胞瓶中出現(xiàn)細胞病變的經(jīng)-20～37℃反復(fù)凍融3次后收毒，用此方法反復(fù)增殖病毒，用于提純病毒，提出的病毒置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 結(jié)果 正常的F81細胞貼壁生長，細胞之間連接緊密并且均質(zhì)透明，呈現(xiàn)不規(guī)則的多邊形，犬細小病毒(CPV)感染貓?zhí)ツI細胞(F81)后一般在盲傳3～5代時出現(xiàn)明顯的脫落、變形、游離、拉網(wǎng)等細胞病變(CPE)。

2.1.4 討論 CPV主要侵害動物黏膜上皮細胞，因此分離病料時選擇動物的腸道內(nèi)容物，腸黏膜上皮細胞，用F81細胞增殖CPV出現(xiàn)了明顯的細胞病變，這與前任的研究結(jié)果相符合。由于CPV的DNA在復(fù)制時需要處于有絲分裂過程中宿主細胞某些機能的輔助，CPV分離培養(yǎng)不同于一般病毒分離，主要是病毒本身所帶的基因有限，需要宿主細胞幫助其復(fù)制病毒增殖錢所用的各種酶，這就要求宿主細胞必須處在細胞分裂的S期，故培養(yǎng)病毒是一般采用同步接毒的方法，這樣能達到使病毒良好增殖的目的。

2.2 犬細小病毒的鑒定

分離出的病毒通過免疫電鏡觀察到大小均一，直徑在20～24nm，外觀為圓形的病毒粒子，從而可從形態(tài)學(xué)上對細小病毒作以鑒定；而通過血凝試驗（HA）能凝集豬的紅細胞，凝集效價達1×109并且能被細小病毒的陽性血清有規(guī)律的抑制，結(jié)果與其生物學(xué)特性符合；通過PCR的擴增結(jié)果可以從分子生物學(xué)上對此病毒進行鑒定。

2.2.1 試驗試劑與儀器 （1）主要試劑：健康豬的經(jīng)脈血液，采自附近豬場；葡萄糖，氯化鈉，枸櫞酸鈉，枸櫞酸。（2）主要儀器：各型微量可調(diào)移液器，生物顯微鏡，；96孔培養(yǎng)板，WZ-2A微量振蕩器， DK-8D型電熱恒溫箱。（3）豬紅細胞懸液的制備：先于25ml注射器內(nèi)吸入阿氏液母液(萄糖2.059g、枸櫞酸鈉0.89g、枸櫞酸0.0559g、氯化鈉0.426g，加入蒸餾水溶解至1000ml，用115℃高壓滅菌20min，4℃存放)3～5ml，于健康豬耳緣靜脈或頸靜脈采血10～20ml，立即混勻，放4℃可存放7～10d。使用時，先用生理鹽水將保存的豬紅細胞離心沉淀3次，最后1次以3000r/min離心10min，棄上清，取次紅細胞1ml，加稀釋液100ml，再加入牛血清蛋白0.1g，即為1%的豬紅細胞懸液。

2.2.2 試驗方法 （1）細菌學(xué)鑒定：將同步接毒的細胞做成切片，在顯微鏡下進行觀察。（2）電鏡觀察：取代鑒定病毒培養(yǎng)物，用0.5%磷酸鎢溶液進行負染后，用電鏡觀察。（3）血凝試驗：犬細小病毒在一定條件下能凝集豬的紅細胞，可作為犬細小病毒初步鑒定的依據(jù)[5]。采用微量法在96孔V型板上進行，每排的第1孔至第12孔加入50μl生理鹽水，吸取純化的病毒抗原液50μl加入第1個孔，混勻后加入第2個孔，倍比稀釋11孔，從該孔棄去50μl，第12孔不加抗原作為陰性對照，最后每孔加入50μl1%的豬紅細胞懸液，震蕩混勻，做3個平行，重復(fù)2次。將V型板置于4℃冰箱中，一般作用30min，待紅細胞對照完全沉淀后讀取試驗結(jié)果。（4）分離毒的PCR擴增：①模板病毒的DNA抽提：用“小組織/細胞基因DNA抽提試劑”進行抽提，制作模板DNA。PCR②擴增：PCR反應(yīng)體系：10×buffer5μl、MgCL25μl、dNTP4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、Taq酶0.5μl、無菌蒸餾水31.5μl，總體積為50μl。用石蠟油覆蓋后進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件∶96℃ 3min、96℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 60s、30個循環(huán)；最后再72℃延伸10min。取10μl PCR產(chǎn)物加1μl電泳上樣緩沖液上樣，以70～80V/cm進行瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察結(jié)果。

2.2.3 結(jié)果 （1）電鏡形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：用病毒分離培養(yǎng)物的上清液作為電鏡負染觀察，結(jié)果可見有呈二十面體立體對稱大小約為20～24nm的病毒粒子出現(xiàn)。（2）血凝試驗結(jié)果：結(jié)果判定：“#”表示100%紅細胞被凝集“+++”表示75%紅細胞被凝集，“++”表示50%紅細胞被凝集，“+”表示25%紅細胞 被凝集。其血凝效價以能凝集100%紅細胞病毒的最高稀釋倍數(shù)表示。結(jié)果見附表。

附表 CPV對豬紅細胞血凝試驗(HA)結(jié)果

（3）PCR檢測結(jié)果：用兩對引物對分離的細小病毒毒株進行PCR擴增，P1和P2擴增得到846bp的片段，P3和P4擴增得到815bp的片段。

2.2.4 討論 HA的檢測結(jié)果與犬細小病毒的特性相符，能在4℃的條件下凝集豬的紅細胞，并且能被CPV陽性血清有規(guī)律的抑制。研究發(fā)現(xiàn)HA的凝集效價受PH值的影響，在pH為6.4～7.2之間較穩(wěn)定，并且在PH＜6.4的時候豬的紅細胞會發(fā)生自凝。每個樣品做3個平行2次重復(fù)，結(jié)果的重復(fù)性很好，說明該方法在實際的應(yīng)用中能經(jīng)濟、簡單、快捷、可靠的對CPV作出鑒定。在電鏡下觀察，可見大小均一、成聚集狀態(tài)的病毒粒子。病毒粒子有電子密度相差懸殊的空心和實心兩種形態(tài)存在，多為圓形，五囊膜，直徑在20～24nm。從而可從形態(tài)學(xué)上對CPV作以鑒定。

3 結(jié)論

通過同步接毒的方法經(jīng)貓?zhí)ツI細胞(F81)可增殖細小病毒。成功利用血凝試驗HA電鏡觀察、PCR擴增的方法對分離的毒株進行鑒定，為我國犬細小病毒病的流行病學(xué)提供了一定的參考資料。

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