貝伐珠單抗促進小鼠結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移的作用及可能機制

陳亞瓊，李媛媛，呂忠霖，陳國江，彭 暉，3

（1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210009；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室，北京100850；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所環(huán)境藥學(xué)研究室，天津300050）

貝伐珠單抗促進小鼠結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移的作用及可能機制

陳亞瓊1，李媛媛2，呂忠霖2，陳國江2，彭 暉1，3

（1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210009；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室，北京100850；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所環(huán)境藥學(xué)研究室，天津300050）

目的研究貝伐珠單抗治療與結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及機制。方法BALB/c-nu小鼠脾內(nèi)注射指數(shù)生長期的HCT116細胞，建立小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。16只模型小鼠分為貝伐珠單抗治療組和對照組，每組8只。治療組ip給予貝伐珠單抗5 mg·kg-1，對照組給予相同劑量的同型對照IgG，分別于建模前2 d及建模后2 d各給藥1次，之后每5 d給藥1次，連續(xù)給藥4周，共計給藥7次。給藥結(jié)束后處死小鼠，取出肝、肺器官，肉眼觀察肝、肺表面轉(zhuǎn)移灶；HE染色法觀察小鼠肝、肺組織轉(zhuǎn)移灶；定量RT-PCR檢測小鼠肺組織趨化因子受體4（CXCR）及其配體CXCL12 mRNA的表達。結(jié)直腸癌細胞HCT116體外與貝伐珠單抗5 mg·L-1共孵育24 h，Western蛋白印跡法和定量RT-PCR分別檢測血管內(nèi)皮生長因子受體1（VEGFR1）/CXCR4/CXCR7蛋白和CXCR3/4/7 mRNA的表達水平。結(jié)果肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，貝伐珠單抗治療組小鼠2/8出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，較對照組（6/8肝轉(zhuǎn)移）明顯減少（P＜0.05）；貝伐珠單抗治療組小鼠8/8出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，較對照組（2/8肺轉(zhuǎn)移）明顯增加（P＜0.05）；小鼠肺組織中鼠源CXCR4及人源CXCL12 mRNA表達顯著高于對照組（P＜0.05）。HCT116細胞體外經(jīng)貝伐珠單抗誘導(dǎo)后，VEGFR1蛋白，CXCR4/7 mRNA和蛋白表達顯著升高（P＜0.05），而CXCR3表達無明顯變化。結(jié)論貝伐珠單抗可能通過上調(diào)CXCR4及其配體CXCL12的表達促進結(jié)直腸癌的肺轉(zhuǎn)移。

貝伐珠單抗；結(jié)直腸癌；轉(zhuǎn)移；趨化因子受體

腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移與其自身的供血密切相關(guān)，抑制腫瘤血管形成能夠顯著抑制腫瘤生長并增加化療藥物向腫瘤內(nèi)部的輸送，提高化療效果。血管生成調(diào)節(jié)主要與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族尤其是VEGF-A有關(guān)［1］。VEGF及其受體（VEGF receptor，VEGFR）能夠誘導(dǎo)細胞增殖，促進新生血管的形成。正常生理水平的VEGF-A表達很低，但在代謝旺盛、供血豐富的組織中，由于血管生長的需要，血管內(nèi)皮細胞VEGF-A表達水平顯著升高。腫瘤的生長有賴于血管為其提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。因此，在多種腫瘤中，腫瘤細胞及血管內(nèi)皮細胞均存在較高水平的VEGF-A表達?？筕EGF治療能夠顯著抑制腫瘤血管的形成，減緩腫瘤的發(fā)展，以VEGF為靶點的抗腫瘤治療已經(jīng)成為多種腫瘤臨床治療，尤其是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（meta?static colorectalcancer，mCRC）治療的主要手段之一［2］。結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率均位于各類惡性腫瘤前列，阻礙結(jié)直腸癌治療的主要因素為結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移［3］。VEGF單克隆抗體貝伐珠單抗（bevacizumab）與常規(guī)化療藥聯(lián)合治療mCRC較單獨化療能夠顯著提高患者的耐受性和生存率［3］。也有報道稱，抗血管生成治療會促進部分患者腫瘤的遠端轉(zhuǎn)移［4］，如貝伐珠單抗會誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞的惡性表型［5］，誘導(dǎo)化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)。VEGF能夠通過結(jié)合VEGFR1誘導(dǎo)趨化因子受體4（chemokine receptor-4，CXCR4）的表達，調(diào)控腫瘤的趨向性轉(zhuǎn)移和侵襲。CXCR4與CXCR7主要通過與CXC配體12（CXC ligand 12，CXCL12）結(jié)合［6］，介導(dǎo)信號激活，而CXCR3與CXCR4共用部分趨化因子配體，且CXCR3與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)［7］。阻斷CXCR4及其配體CXCL12能夠抑制腫瘤血管形成和腫瘤細胞存活，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［8］。貝伐珠單抗與化療聯(lián)用對部分結(jié)直腸癌患者無效可能與貝伐珠單抗誘導(dǎo)CXCR4及其配體CXCL12上調(diào)后腫瘤代償性血管形成增加有關(guān)，這與高水平CXCL12與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的報道［9］一致。為了研究貝伐珠單抗與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，本課題組建立了小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型并對其進行了貝伐珠單抗治療，同時對相關(guān)指標(biāo)進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 細胞和動物

結(jié)直腸癌細胞HCT116購自美國模式菌種收集中心。SPF級BALB/c-nu小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，4周齡，購自斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，動物合格證號：11401500005896。小鼠飼養(yǎng)于北京國家藥物安全評價中心。

1.2 試劑和儀器

貝伐珠單抗（25 mg·mL-1，瑞士Roche制藥公司），IgG（5 mg·mL-1，美國Biolegend公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，元亨金馬公司），氯胺酮（ketamine）和賽拉嗪（xylazine）（福建吉田制藥有限公司），人VEGF-A ELISA試劑盒（美國eBioscience公司），2×Taq PCR Mix（天根生化科技有限公司），Trizol（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（英國新英格蘭Biolabs公司），SYBR?Green Real-time PCR Master Mix（日本TOYOBO公司），10%甲醛（廣州化學(xué)試劑廠），相應(yīng)引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成（表1）。二氧化碳孵箱、低溫離心機和酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司），普通PCR儀和iQ5實時定量-PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型的建立及貝伐珠單抗治療

收集指數(shù)生長期HCT116細胞，PBS洗2次，計數(shù)，用生理鹽水按照注射要求重懸細胞。每只裸鼠ip 40μL麻醉藥〔氯胺酮∶賽拉嗪∶生理鹽水=1.5∶2∶3（V/V/V），充分混合〕，完全麻醉后置手術(shù)臺上，75%乙醇消毒背部皮膚，剪開背部靠近脾處皮膚（避免出血），剪開腹膜，脾內(nèi)注射HCT116細胞（1× 106，100μL）。用帶線縫合針逐層縫合腹膜和皮膚。16只結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型小鼠分為2組，每組8只，實驗組ip給予貝伐珠單抗5 mg·kg-1，對照組ip給予貝伐珠單抗同型對照IgG 5 mg·kg-1，分別于建模前2 d和建模后2 d各給藥1次，之后每5 d給藥1次，連續(xù)給藥4周，共計給藥7次。給藥結(jié)束后處死小鼠，取肝組織和肺組織。

1.4 肝、肺器官表面肉眼觀察及組織病理檢查

給藥結(jié)束后處死小鼠，取出肝、肺器官，肉眼觀察肝、肺表面轉(zhuǎn)移灶；剝離小鼠肝、肺組織，剪取部分浸泡于10%甲醛中固定。按常規(guī)操作流程制作石蠟包埋的病理切片，HE染色，光鏡下觀察組織的病理變化。

1.5 實時定量PCR方法檢測肺組織人源CXCR4（hCXCR4）及其配體鼠源CXCL 12（mCXCL12）mRNA表達

剪取、稱量50 mg小鼠肺組織，放入勻漿器，加Trizol 1 mL研磨，室溫放置5 min，加三氯甲烷200μL，振蕩15 s，室溫放置10 min，12 000×g，4℃離心10 min，移取上層液體到新的EP管，加入500μL異丙醇，振蕩混勻，室溫放置10 min，12 000×g，4℃離心10 min，棄上清后加入1 mL 75%乙醇，振蕩混勻，7500×g，4℃離心5 min，棄上清。加入10μL水溶解，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為20μL：2×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液10μL；隨機引物1μL；逆轉(zhuǎn)錄酶混合液1μL；水加mRNA 8μL。使用定量RT-PCR儀進行檢測。反應(yīng)擴增體系為20μL，上下游引物各0.5μL；SYBR GREEN Mix 10μL；水8μL；cDNA 1μL。定量RT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，5 min；變性95℃10 s，退火60℃10 s，延伸72℃15 s，收集熒光，反應(yīng)40個循環(huán)；55℃開始每個循環(huán)上升0.5℃30 s，收集熔解曲線熒光，反應(yīng)71個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，通過熔解曲線檢測引物擴增的特異性，以GAPDH為內(nèi)參，通過公式2-△△Ct計算目的基因的相對表達水平。

Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.6 實時定量PCR方法檢測HCT116細胞CXCR3，CXCR4和CXCR7 mRNA表達

將HCT116細胞1×105接種于48孔板，400μL完全培養(yǎng)基體系培養(yǎng)，貝伐珠單抗（5 mg·L-1）刺激24 h，收細胞，600×g離心5 min，棄去上清，加1 mL Trizol吹勻。提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)條件同1.5。

1.7 Western蛋白印跡法檢測HCT116細胞VEGFR1，CXCR4和CXCR 7蛋白表達

將HCT116細胞1×106接種于12孔板，500μL完全培養(yǎng)基體系培養(yǎng)，貝伐珠單抗（5 mg·L-1）刺激24 h，收集細胞，600×g離心5 min，棄去上清，加100μL蛋白裂解液混勻，冰上裂解10 min，加5×上樣緩沖液25μL，沸水煮10 min。用Western蛋白印跡法檢測VEGFR1，CXCR4和CXCR 7蛋白表達。待測蛋白相對表達水平用待測蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH電泳條帶積分吸光度比值表示待測蛋白相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 貝伐珠單抗對小鼠結(jié)直腸癌肝、肺轉(zhuǎn)移的影響

給藥結(jié)束后處死小鼠，取肝、肺并肉眼觀察（圖略）發(fā)現(xiàn)，對照組和貝伐珠單抗治療組肝轉(zhuǎn)移小鼠分別為6/8和2/8，肺轉(zhuǎn)移小鼠分別為2/8和8/8；統(tǒng)計分析顯示，貝伐珠單抗治療組肝轉(zhuǎn)移小鼠明顯減少（X2=4.1，P＜0.05），肺轉(zhuǎn)移小鼠明顯增加（X2=6.67，P＜0.05）。肝組織病理觀察結(jié)果顯示，貝伐珠單抗治療組小鼠肝病變空灶減少（圖1A），肺病變空灶增加（圖1B）。表明貝伐珠單抗能夠抑制結(jié)直腸癌小鼠肝轉(zhuǎn)移灶的形成，促進肺轉(zhuǎn)移灶的形成。

Fig.1 Effect of bevacizumab treatment on liver（A）and lung（B）metastasis in metastatic colorectal cancer model mice（HE staining）.Colorectal liver metastases model was established by injection of HCT116 cells into the spleen of BALB/c-nu recipients.The mice in experimental group were administered ip with bevacizumab 5 mg·kg-1，and the mice in control group were given isotype IgG at the same dosage.The antibodies were administered on 2 d before and after initiation of model establishment respectively，then once every 5 d for 4 weeks，for a totalof7 times.The arrows show metastases.

2.2 貝伐珠單抗促進結(jié)直腸癌小鼠肺組織hCXCR4和配體mCXCL12 mRNA的表達

定量RT-PCR檢測結(jié)果（圖2）表明，與對照組比較，貝伐珠單抗治療組小鼠肺組織中hCXCR4和mCXCL12 mRNA表達顯著增加（P＜0.05），表明貝伐珠單抗治療后能夠促進結(jié)直腸癌模型小鼠肺組織hCXCR4和mCXCL12的表達。

Fig.2 Effect of bevacizumab treatment on mRNA expression of hCXCR4（A）and mCXCL12（B）in lung tissue of metastatic colorectal cancer model mice detected by quantitative RT- PCR.，n=8. *P＜0.05，compared with isotype IgG group.

2.3 貝伐珠單抗對HCT116細胞VEGFR1，CXCR3，CXCR4及CXCR7表達水平的影響

Western蛋白印跡法和定量RT-PCR結(jié)果顯示，貝伐珠單抗處理能夠明顯上調(diào)CXCR4和CXCR7 mRNA和蛋白表達，但不影響CXCR3 mRNA表達（圖3A和B）。此外，貝伐珠單抗處理能夠顯著上調(diào)HCT116細胞VEGFR1蛋白表達（圖3B）。

Fig.3 Effect of bevacizumab on CXCR3/4/7 mRNA expression（A）and CXCR4/7 and vascular endothelial gorwth factor receptor 1（VEGFR1）protein expression（B）in HCT116 cells detected by quantitative RT-PCR and Western blotting，respectively.HCT116 cells（1× 105）were treated with bevacizumab 5 mg·L-1for 24 h.，n=3. *P＜0.05，**P＜0.01，compared with isotype IgG group.

3 討論

腫瘤的生長需要血管輸送大量的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，因此腫瘤血管的生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，抑制腫瘤血管形成能夠切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，減緩腫瘤的發(fā)展。靶向VEGF抗腫瘤藥物的研發(fā)使腫瘤患者的生存期明顯延長，部分腫瘤患者長期接受抗VEGF/ VEGFR抗腫瘤藥物治療后，會出現(xiàn)不同程度的治療耐藥和復(fù)發(fā)［5］，這可能與促血管生成因子上調(diào)、腫瘤細胞遷移能力增加以及轉(zhuǎn)移灶的出現(xiàn)有關(guān)［8］。結(jié)直腸癌組織中粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的大量分泌，也是VEGF-A表達升高、腫瘤細胞遷移及侵襲能力增加的誘因之一［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用貝伐珠單抗進行抗VEGF治療確實能夠抑制腫瘤的肝轉(zhuǎn)移，但同時增加了癌細胞向肺部的遷移，這與之前的臨床觀察發(fā)現(xiàn)——長期給予抗VEGF治療后患者的治療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)、遠端轉(zhuǎn)移相一致［5］。究其原因，推測可能與腫瘤細胞上調(diào)趨化因子受體CXCR4和靶器官（肺）中相應(yīng)配體CXCL12表達升高有關(guān)。鑒于mCXCL12能夠與hCXCR4/7相結(jié)合，啟動下游信號［11］，認(rèn)為肺組織中的CXCL12能夠吸引表達CXCR4/7的結(jié)直腸癌細胞趨化至肺部，而且該效應(yīng)可能具有特異性。

為了進一步評價此效應(yīng)，本研究進行了體外實驗。將貝伐珠單抗5 mg·L-1加入HCT116細胞培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，貝伐珠單抗處理能夠明顯上調(diào)CXCR4和CXCR7 mRNA和蛋白表達，但不影響CXCR3 mRNA表達。此外，貝伐珠單抗處理能夠顯著上調(diào)HCT116細胞VEGFR1蛋白表達。為此推測，貝伐珠單抗抑制了VEGF-A與其受體VEGFR1/2的結(jié)合，導(dǎo)致VEGFR1的表達上調(diào)，從而間接增強了與其他配體——血小板源生長因子和VEGF-B的結(jié)合，啟動下游信號，促進CXCR4/7的表達。確切的作用機制尚需進一步研究。

總之，本研究初步驗證了貝伐珠單抗治療后促進結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移的副作用，提示聯(lián)合靶向CXCL12/ CXCR4的小分子化合物或單克隆抗體可能能夠抑制貝伐珠單抗引起的肺轉(zhuǎn)移，增強貝伐珠單抗的療效。

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Lung metastases of colorectalcancer boosted by bevacizumab in mice and possible mechanism

CHEN Ya-qiong1，LIYuan-yuan2，LYU Zhong-ling2，CHEN Guo-jiang2，PENGHui1，3
（1.College ofPharmacy，China PharmaceuticalUniversity，Nanjing 210009，China；2.Departmentof Immunology，Institute ofBasic MedicalSciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；3.DepartmentofEnvironmentand Pharmacy，Institute of Health and Environmental Medicine，Academy of Military MedicalSciences，Tianjin 300050，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of bevacizumab，an anti-human vascular endothelial growth factor monoclonal antibody，on pulmonary dissemination of colorectal cancer.METHODS A metastatic colorectal cancer mouse model was established.Mice were randomly divided into two groups（n=8）.The mice in experimentalgroup were administered ip with bevacizumab at the dosage of 5 mg·kg-1，and those in control group were given isotype IgG at the same dosage.The antibodies were administered on 2 d before initiation of model establishment and 2 d after that，then once every 5 d for 4 weeks，for a totalof 7 times.Liver and lung metastases were determined by histopathologicalexamination. The chemokine receptor C-X-C receptor 4（CXCR4）and its ligand C-X-C ligand 12（CXCL12）mRNA expression in the lung were detected by quantitative RT-PCR.Human colon cancer cells HCT116 were treated with bevacizumab（5 mg·L-1）for 24 h.The expression levels ofvascularendothelialgrowth factor receptor 1（VEGFR1）and CXCR4/7 protein as wellas CXCR3/4/7 mRNA were examined by Western blotting and quantitative RT-PCR respectively.RESULTS The number of mice（2/8）with liver metastases was reduced，while the number of mice（8/8）with lung metastases increased in experimental group compared with isotype IgG-treated group（6/8 and 2/8 respectively，P＜0.05）.The mRNA expression levelof CXCR4 and CXCL12 in lung tissue was significantly up-regulated in bevacizumab-treated group com?pared with controlgroup（P＜0.05）.The mRNA and protein expression levelof CXCR4 and CXCR7 was dramatically increased in HCT116 cells treated with bevacizumab（P＜0.05）.CONCLUSION Bevacizumab can potentially promote lung metastases of colorectalcancer，which may be related to up-regulation of CXCR4 and CXCL12 expression.

bevacizumab；colorectalcancer；metastases；chemokine receptor

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81173082）；National Natural Science Foundation of China（81272320）；National Natural Science Foundation of China（81472647）；Beijing Natural Science Foundation（7132151）；and Tianjin Key R&D and Frontier Technology Plan（15JCZDJC34700）

PENG Hui，E-mail：p_h2002@hotmail.com；CHEN Guo-jiang，E-mail：guogangch@yahoo.com

R971.1

A

1000-3002-（2016）05-0564-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.013

2015-10-22接受日期：2016-03-18）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學(xué)基金（81173082）；國家自然科學(xué)基金（81272320）；國家自然科學(xué)基金（81472647）；北京市自然科學(xué)基金（7132151）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃重點項目（15JCZDJC34700）

陳亞瓊，女，碩士研究生，主要從事抗腫瘤藥理學(xué)研究；彭暉，男，研究員，主要從事抗腫瘤藥理學(xué)研究；陳國江，男，副研究員，主要從事抗腫瘤免疫學(xué)研究。

彭暉，E-mail：p_h2002@hotmail.com；陳國江，E-mail：guogangch@yahoo.com