張鵬英，常藕琴，石存斌 ，吳淑勤

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

?

3月齡草魚種免疫器官組織學(xué)及其免疫后免疫基因的轉(zhuǎn)錄差異

張鵬英1，2，常藕琴1，石存斌1，吳淑勤1

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

為研究處于同一時(shí)期但養(yǎng)殖條件不同的草魚(Ctenopharyngodonidellus)魚體規(guī)格與發(fā)育狀態(tài)間是否具有一致性，觀察壓塘3月齡草魚與普通3月齡草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟的顯微結(jié)構(gòu)，并對壓塘3月齡草魚與普通3月齡草魚進(jìn)行腹腔注射疫苗處理，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測免疫7 d后、14 d后各期草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟中IgM與MHCⅠ的表達(dá)量。結(jié)果顯示，壓塘3月齡草魚各組織發(fā)育較普通3月齡草魚遲緩。壓塘3月齡草魚與普通3月齡草魚在免疫后，頭腎、中腎、腸道與脾臟中IgM和MHCⅠ的表達(dá)量均有上升，且IgM與MHCⅠ的相對表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在普通3月齡草魚免疫14 d后的中腎中(IgM為74.51倍；MHCⅠ為56.02倍。結(jié)果表明，草魚出血病活疫苗可以增強(qiáng)草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟中IgM和MHCⅠ的表達(dá)，且在3月齡時(shí)期進(jìn)行注射免疫效果最佳。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)；免疫器官組織學(xué)；疫苗免疫；IgM；MHCⅠ

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是中國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，但在養(yǎng)殖過程中的“四病”(赤皮病、爛鰓病、腸炎病、出血病)一直制約著草魚養(yǎng)殖的發(fā)展[1]。其中草魚出血病是流行地區(qū)最廣、季節(jié)最長、危害最大的一種流行病，該病由草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus， GCRV)引起，是魚種培育階段的最大病害[2]。利用免疫手段提高魚類獲得性免疫力可以防治魚類疾病[3]，預(yù)防草魚出血病最有效的方法是接種疫苗[4]，實(shí)踐表明，草魚經(jīng)免疫后成活率大大提高，目前中國每年有數(shù)十億草魚苗種受益于疫苗免疫[5]。魚類疫苗的免疫接種方法有注射、浸泡、口服和基因槍接種4 種方式，其中注射免疫能使魚類免疫接種取得較好效果[6]。有研究表明，草魚出血病疫苗能夠在一定時(shí)間內(nèi)起到抗感染的免疫效果[7]。通常情況下，魚種在培育到一定規(guī)格后，會(huì)進(jìn)行分塘養(yǎng)殖以降低養(yǎng)殖密度，促進(jìn)魚種生長。然而近年來，許多養(yǎng)殖戶為了追求經(jīng)濟(jì)效益，將部分魚種壓塘養(yǎng)殖以錯(cuò)峰銷售。壓塘魚由于養(yǎng)殖密度過大，投喂飼料不足等問題，比正常養(yǎng)殖魚的生長發(fā)育遲緩。養(yǎng)殖過程中一般3月齡魚進(jìn)行免疫對魚病有較好的預(yù)防效果。壓塘和正常養(yǎng)殖3月齡魚頭腎、中腎、腸道、脾臟等免疫組織結(jié)構(gòu)及免疫相關(guān)因子間是否存在差異，可否同期免疫，尚未見相關(guān)資料和報(bào)道。本研究使用組織切片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對壓塘和正常養(yǎng)殖3月齡魚免疫器官組織學(xué)和免疫相關(guān)基因進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探討草魚出血病活疫苗在草魚出血病的防治中的使用時(shí)間與免疫組織結(jié)構(gòu)成熟度和免疫時(shí)機(jī)的關(guān)系，為免疫器官發(fā)育和免疫組織學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料，為草魚疫苗更好地發(fā)揮作用提供科學(xué)依據(jù)，對疫苗應(yīng)用、免疫防治具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚均來自廣東省清遠(yuǎn)市百容水產(chǎn)良種有限公司，壓塘3月齡草魚體長( 4.6±0.6) cm，體質(zhì)量(1.0±0.5) g，普通3月齡草魚體長(15.4±0.9) cm，體質(zhì)量( 47.4±18.1) g。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit 、熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq II 和RNAiso Plus均購自TaKaRa 公司、RNAhold 購自北京全氏金生物公司，熒光定量PCR 儀為美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品、臺(tái)式冷凍離心機(jī)為上海人和科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，注射用疫苗草魚出血病減毒活疫苗(GCHV-892株)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所疫苗工程中心饋贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

組織取樣 取壓塘3月齡草魚和普通3月齡草魚的頭腎、中腎、腸道(腸后段)和脾臟組織。組織大小和形狀允許的，以1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm的規(guī)格取材，體積過小的則整體取出。取材完成后立即置于Bouin′s液中進(jìn)行固定，24 h后將組織塊置于70 %酒精中。

常規(guī)石蠟切片制作 固定完成后，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋后，3 μm縱向連續(xù)切片，切片烘干后進(jìn)行H.E 染色，中性樹膠封片。然后將切片置于LEICA DM750 型顯微鏡下觀察，LEICA ICC50 HD 型攝像頭下拍照。

草魚的免疫 選取健康的壓塘3月齡草魚與普通3月齡草魚各30條進(jìn)行疫苗腹腔注射。壓塘3月齡草魚每尾注射100 μL、普通3月齡草魚每尾注射150 μL。

常規(guī)石蠟切片制作 組織用Bouin′s液固定完成后，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋后，3 μm縱向連續(xù)切片，切片烘干后進(jìn)行H.E 染色，中性樹膠封片。然后將切片置于LEICA DM750 型顯微鏡下觀察，LEICA ICC50 HD 型攝像頭下拍照。

總RNA 的提取以及cDNA制備 免疫7 d和14 d后，各組實(shí)驗(yàn)魚分別取適量的頭腎、中腎、腸道和脾臟組織，按Trizol法提取總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和完整性，用微量分光光度計(jì)測定RNA 樣品的濃度。再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit說明書將總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于熒光定量PCR擴(kuò)增模板。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì) 在NCBI 上查找草魚β-actin、IgM和MHCⅠ的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如表1 所示。

表1 β-actin、IgM和MHCⅠ基因引物

草魚IgM和MHCⅠ基因組織表達(dá)分析 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 作模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。按照熒光定量試劑盒步驟在ABI 7500 ( Applied Biosystems) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行熒光定量PCR 檢測，反應(yīng)體系：SYBRPremix ExTaqTM Ⅱ( 2×) 5 μL，ROX Reference Dye II(50×) 0.2 μL，10 μmol /L 的上下游引物各0.2 μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.4 μL，反應(yīng)總體積為10 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 預(yù)變性30 s，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)， 60 ℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，以確保特異性擴(kuò)增。采用2- ΔΔCt法計(jì)算樣品中IgM和MHCⅠ基因mRNA 的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

2.1.1 頭腎的觀察

壓塘3月齡草魚頭腎中可觀察到分化明顯且不規(guī)則分布的粒細(xì)胞和大量淋巴細(xì)胞，同時(shí)還能觀察到相間分布的微靜脈和血竇。淋巴細(xì)胞不規(guī)則分布，仍有腎小管結(jié)構(gòu)(見圖版Ⅰ-1)。普通3月齡草魚頭腎中未見腎小管，頭腎實(shí)質(zhì)中無腎單位，淋巴細(xì)胞有聚集分布現(xiàn)象，可觀察到動(dòng)脈、靜脈和豐富的血竇，竇腔較大，內(nèi)含大量血細(xì)胞，靜脈與竇腔相通。頭腎中還分散有腎上腺細(xì)胞群。此時(shí)的頭腎區(qū)域間界限明顯，可觀察到淋巴細(xì)胞聚集區(qū)和腎上腺內(nèi)分泌組織區(qū)(見圖版Ⅰ-2)。

2.1.2 中腎的觀察

壓塘3月齡草魚中腎可觀察到腎小管間有淋巴組織分布，這些淋巴組織主要由淋巴細(xì)胞、黑色素巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞和各種粒細(xì)胞組成?？勺R(shí)別出近端小管與遠(yuǎn)端小管。近端小管長且彎曲，管壁細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核呈柱狀或梭形，強(qiáng)嗜堿性，管腔內(nèi)有濃密的嗜酸性刷狀緣，對管腔有閉鎖作用；遠(yuǎn)端管多呈圓形，管壁細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核呈橢圓形，嗜堿性，管腔內(nèi)光滑無刷狀緣(見圖版Ⅰ-3)。普通3月齡草魚的中腎可觀察到大量的淋巴組織與腎小管相間分布，這些淋巴組織中已可分辨出大淋巴細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞。同時(shí)黑色素巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞和各種粒細(xì)胞數(shù)量也較多，腎小管管徑已明顯擴(kuò)大，管壁細(xì)胞的核質(zhì)比已顯著減小，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性明顯。近端小管與遠(yuǎn)端小管管腔也有擴(kuò)大，近端小管管腔內(nèi)刷狀緣對管腔的閉鎖程度較壓塘3月齡草魚近端小管小，為亞成熟腎小管。此時(shí)，部分腎單位開始出現(xiàn)和成體相同的細(xì)胞形態(tài)。未見腎小球(見圖版Ⅰ-4)。

2.1.3 腸道的觀察

壓塘3月齡草魚腸腔內(nèi)黏膜褶高約占腸腔半徑的1/2，排列不緊密;腸腔內(nèi)黏膜層較薄，由單層柱狀上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞組成，上皮細(xì)胞間有H.E深染為紫藍(lán)色的黏液細(xì)胞分布，細(xì)胞核橢圓形，中位或基位；黏膜下層由比較疏松的結(jié)締組織組成;外被平滑肌構(gòu)成的肌肉層。腸道固有層中含有大量的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，沿黏膜褶彎曲方向聚集(見圖版Ⅰ-5)。普通3月齡草魚腸腔內(nèi)黏膜皺褶豐富，腔內(nèi)黏膜層變厚，腸上皮為單層柱狀上皮，細(xì)胞高柱狀，上皮細(xì)胞間有黏液細(xì)胞，高柱狀的上皮細(xì)胞游離面有密集排列的微絨毛組成的紋狀緣。腸道黏膜組織中的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，散布于黏膜褶中(見圖版Ⅰ-6)。

2.1.4 脾臟的觀察

壓塘3月齡草魚脾臟有集中分布在中部的黑色素巨噬細(xì)胞中心結(jié)構(gòu)，血管橫跨整個(gè)脾臟，位于脾臟的中央，管外有大量嗜堿性細(xì)胞分布。微血管發(fā)達(dá)，有大量紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞相間分布，還可觀察到少量巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)(見圖版Ⅰ-7)。普通3月齡草魚脾臟中部分黑色素巨噬細(xì)胞中心結(jié)構(gòu)已經(jīng)擴(kuò)大區(qū)域，約比壓塘3月齡的大一倍，脾臟主要由淋巴組織組成，分白髓、紅髓2 個(gè)主要部分。紅髓和白髓混合排列，兩者無明顯界限。白髓主要由較為密集的淋巴細(xì)胞組成；紅髓由血細(xì)胞含量較多的脾索及大小形狀不規(guī)則的脾竇組成(見圖版Ⅰ-8)。

圖1 各時(shí)期IgM與MHCⅠ在不同組織中的相對表達(dá)量

壓塘3月齡草魚免疫7 d后IgM(a)和MHCⅠ(b)在各組織中的表達(dá)量；壓塘3月齡草魚免疫14 d后IgM(c)和MHCⅠ(d)在各組織中的表達(dá)量；普通3月齡草魚免疫7 d后IgM(e)和MHCⅠ(f)在各組織中的表達(dá)量；普通3月齡草魚免疫14 d后IgM(g)和MHCⅠ(h)在各組織中的表達(dá)量(“*”表示差異顯著，“**”表示差異極顯著)

圖2 不同時(shí)期各組織中IgM與MHCⅠ的相對表達(dá)量

i.不同時(shí)期各組織IgM相對表達(dá)量;j.不同時(shí)期各組織MHCⅠ相對表達(dá)量(Ⅰ7代表壓塘3月齡草魚免疫7 d后，Ⅰ14代表壓塘3月齡草魚免疫14 d后，Ⅲ7代表普通3月齡草魚免疫7 d后，Ⅲ14代表普通3月齡草魚免疫14 d后)

2.2 草魚IgM、MHCⅠ 基因的相對表達(dá)量

免疫后IgM與MHCⅠ的相對表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在普通3月齡草魚免疫14 d后的中腎中(IgM為74.51倍(P<0.01)，MHCⅠ為56.02倍(P<0.01))。壓塘3月齡草魚在免疫7 d后，注射組的IgM和MHCⅠ在頭腎、中腎、腸道和脾臟中的表達(dá)量均高于對照組。免疫14 d后，注射組IgM的相對表達(dá)量在中腎中顯著高于對照組(1.48倍，P<0.05)，在頭腎、腸道和脾臟中的相對表達(dá)量均低于對照組，但P值大于0.05不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；注射組MHCⅠ在頭腎、中腎、腸道和脾臟中的相對表達(dá)量均高于對照組。普通3月齡草魚在免疫7 d后，注射組的IgM在頭腎、中腎、腸道和脾臟中的相對表達(dá)量均高于對照組;注射組MHCⅠ的相對表達(dá)量在頭腎、中腎和脾臟中均高于對照組，在腸道中的相對表達(dá)量低于對照組。免疫14 d后，注射組IgM的相對表達(dá)量在頭腎、中腎、腸道和脾臟中均高于對照組，注射組MHCⅠ在頭腎、中腎和脾臟中的相對表達(dá)量均高于對照組，在腸道中的相對表達(dá)量低于對照組(圖1、圖2)。

3 討論

本研究對壓塘3月齡草魚和普通3月齡草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟進(jìn)行了組織學(xué)觀察，結(jié)果顯示壓塘3月齡草魚頭腎中仍有腎小管結(jié)構(gòu)，處于混合型腎臟及分泌組織階段；普通3月齡草魚頭腎中有大量淋巴細(xì)胞分布，未見腎小管，此結(jié)果與雷雪彬等[8]的發(fā)現(xiàn)一致。岳興建等[9]在南方鲇上發(fā)現(xiàn)3月齡時(shí)，部分腎單位出現(xiàn)和成體相同的細(xì)胞形態(tài)。貝氏高原鰍中腎基本發(fā)育成熟是在出膜后80～135 d[10]。該實(shí)驗(yàn)觀察到的壓塘3月齡草魚中腎單位多處于亞成熟狀態(tài)；普通3月齡草魚中腎已開始出現(xiàn)與成體相同的細(xì)胞形態(tài)。腸道是魚類主要的消化器官和內(nèi)分泌器官，同時(shí)也是最大的黏膜組織。壓塘3月齡草魚腸道中可觀察到大量粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；普通3月齡草魚腸道粘膜組織中觀察到的免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，有研究[11-13]表明，黏膜組織中的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞能接受外界抗原的刺激，引起局部免疫反應(yīng)，在機(jī)體的免疫中起著重要的作用，這些可以有效誘發(fā)參與免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞主要在中后腸分布[14]。壓塘3月齡草魚脾臟沒有分化為明顯的紅髓和白髓，有大量淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞分散在紅細(xì)胞之間，具有一定免疫功能；普通3月齡草魚脾臟中黑色素巨噬細(xì)胞中心結(jié)構(gòu)團(tuán)面積較大，有界限不明的紅髓和白髓混合排列，此時(shí)脾臟具成熟的組織結(jié)構(gòu)。組織學(xué)結(jié)果分析顯示：壓塘3月齡草魚頭腎、中腎、腸道和脾臟發(fā)育遲緩，處于未成熟狀態(tài)；普通3月齡草魚的頭腎、中腎、腸道和脾臟功能已趨于成熟。

IgM 是B淋巴細(xì)胞最早產(chǎn)生的免疫球蛋白，也是B 淋巴細(xì)胞分化過程中的主要表面標(biāo)志[15]同時(shí)也是體液免疫最重要的指標(biāo)之一，它可以中和血液循環(huán)中的病原[16]，或捕獲脾邊緣區(qū)的病原體，并增強(qiáng)抗原的免疫原性，以及對B 細(xì)胞進(jìn)行增強(qiáng)活化[17]。目前，已有多種疫苗被證明能夠顯著性提高魚體的IgM ，并使魚體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[7]。主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)能夠識(shí)別、清除外來和內(nèi)在抗原，在免疫學(xué)上具有極為重要的意義[18]。魚類MHC主要包括MHCⅠ類和MHCⅡ類基因，其中MHCⅠ類分子主要參與內(nèi)源性抗原的遞呈[19]。本實(shí)驗(yàn)對這兩個(gè)時(shí)期的草魚進(jìn)行草魚出血病活疫苗(GCHV-892株) 腹腔注射，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了IgM與MHCⅠ在免疫7 d與14 d后的頭腎、中腎、腸道和脾臟中的相對表達(dá)量。IgM與MHCⅠ的相對表達(dá)量峰值出現(xiàn)在普通3月齡草魚免疫14 d后的中腎中。普通3月齡草魚免疫后頭腎、中腎和脾臟中IgM的相對表達(dá)量均明顯高于壓塘3月齡草魚，但在腸道中的表達(dá)量差異不明顯，推測可能與本實(shí)驗(yàn)采用的注射免疫方式有關(guān)。Strand等[20]認(rèn)為，腸道后半部分的上皮細(xì)胞可以通過內(nèi)吞方式攝取并轉(zhuǎn)移大分子抗原，轉(zhuǎn)送到腸道固有層的巨嗜細(xì)胞和血液循環(huán)系統(tǒng)中。故口服免疫方式可能對腸道中IgM作用更明顯，但具體影響機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。壓塘3月齡草魚免疫后的兩周時(shí)間內(nèi)，MHCⅠ除在頭腎中的相對表達(dá)量增幅變大，中腎、腸道和脾臟中的MHCⅠ相對表達(dá)量的增幅都有所下降。而普通3月齡草魚在免疫后的兩周時(shí)間內(nèi)，各組織中的MHCⅠ相對表達(dá)量的增幅都有升高。故接種疫苗后，正常養(yǎng)殖的普通魚能夠比高密低投的壓塘魚更好地引起相關(guān)因子有效的免疫應(yīng)答。宋曉青等[21]在針對牙鲆的研究中發(fā)現(xiàn)，草魚和牙鲆在免疫后其脾臟和頭腎中MHCⅠ都上調(diào)表達(dá)。奕志娟等[22]發(fā)現(xiàn)不同劑量的疫苗對脾臟中MHCⅠmRNA表達(dá)的影響均為先上調(diào)后下降的趨勢，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。其可能的應(yīng)答機(jī)制為免疫細(xì)胞廣泛存在的模式識(shí)別受體信號(hào)通路逐級傳遞抗原信息，迅速引起相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄[21]，說明疫苗免疫增強(qiáng)了機(jī)體呈遞抗原的能力。

葉華等[23]根據(jù)齊口裂腹魚較強(qiáng)細(xì)胞免疫出現(xiàn)的時(shí)間段，建議在齊口裂腹魚養(yǎng)殖過程中，在由嗜水氣單胞菌引起的疾病流行爆發(fā)季節(jié)到來之前的7～14 d，進(jìn)行滅活菌苗注射以增強(qiáng)免疫力。蘇友祿等[24]認(rèn)為在免疫系統(tǒng)發(fā)育完善前注射疫苗會(huì)引起對此種抗原的耐受，因而其建議針對軍曹魚系統(tǒng)免疫的疫苗接種時(shí)間不應(yīng)在24 dph以前，又或許在44 dph后接種疫苗效果更好。本實(shí)驗(yàn)在組織結(jié)構(gòu)和免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的數(shù)據(jù)都支持草魚在正常發(fā)育3月齡時(shí)期免疫效果更好，而壓塘3月齡草魚由于各免疫器官發(fā)育尚未成熟，免疫效果不佳。綜上所述，本研究觀察了壓塘3月齡草魚和普通3月齡草魚部分免疫器官組織的顯微結(jié)構(gòu)，并觀察了草魚出血病減毒活疫苗免疫注射后，草魚主要免疫相關(guān)基因IgM與MHCⅠ的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在草魚免疫組織結(jié)構(gòu)發(fā)育完善的正常養(yǎng)殖3月齡時(shí)期進(jìn)行疫苗注射免疫效果更好，而壓塘3月齡草魚由于養(yǎng)殖密度過大，投喂飼料不足等問題生長發(fā)育遲緩，免疫效果不佳。本研究結(jié)果為生產(chǎn)實(shí)踐提供了科學(xué)可靠的基礎(chǔ)資料，對草魚出血病的免疫防治具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

[1]肖 魚.草魚病毒性出血病的預(yù)防和治療[J].中國水產(chǎn),1994,(3):28-29.

[2]Angel A A,Rockemann D D,Hetrick F M.Identification of grass carp hemorrhage virus as a new genogroup of aquareovirus[J].J Gen Virol,1999,80:2399-2402.

[3]許淑英,李煥林,鄧國成,等.草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)弱毒疫苗的最小免疫量、免疫期和保存期[J].淡水漁業(yè),1998,28(3):3-5.

[4]羅毅志,楊廣智,葉雪平.草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗及病毒株冷凍干燥保存法的研究[J].淡水漁業(yè),1997,27(1):11-12.

[5]Jiang Y L.Hemorrhagic disease of grass carp:Status of outbreaks,diagnosis,surveillance,and research[J].Isr J Aqu-Bamidgeh,2009,61(3):188-192.

[6]Press C M,Lillehaug A.Vaccination in European salmonid aquaculture:a review of practices and prospects[J].Brit Veterin J,1995,151(1):45-69.

[7]張建強(qiáng),夏迎秋,吳圣楠,等.注射草魚出血病疫苗對草魚3 種血清蛋白指標(biāo)的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(2):390-394.

[8]雷雪彬,常藕琴,石存斌,等.草魚頭腎發(fā)生組織學(xué)與免疫組織化學(xué)觀察[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2013,37(6):840-850.

[9]岳興建,張耀光,謝碧文,等.南方鲇中腎的發(fā)生及腎單位的發(fā)育[J].水生生物學(xué)報(bào),2008,32(3):365-372.

[10]溫龍嵐,姚艷紅,王志堅(jiān).貝氏高原鰍腎臟發(fā)育研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,34 (3):179-183.

[11]Ferguson H W,Morrison D,Ostland V E,et al.Responses of mucus-producing cells in gill disease of rainbow trout(Oncorhynchusmykiss)[J].J Comp Pathol,1992,106(3):255-265.

[12]Xu D H,Klesius P H.Protective effect of cutaneous antibody produced by channel catfish,Ictalurus punctatus(Rafinesque),immune toIchthyophthiriusmultifiliisFouquet on cohabited non-immune catfish[J].J Fish Dis,2003,26(5):287-291.

[13]Merino-contreras M L,Guzman-murillo M A,Ruiz-bustos E,et al.Mucosal immune response of spotted sand bassParalabraxmaculatofasciatus(Steindachner,1868)orally immunised with an extracellular lectin ofAeromonasveronii[J].Fish Shellfish Immunol,2001,11:115-126.

[14]McMillan D N,Secombes C J.Isolation of rainbow trout(Oncorhynchusmykiss)intestinal intraepithelial lymphocytes(IEL) and measurement of their cytotoxic activity[J].Fish Shellfish Immunol,1997,7:527-541.

[15]侯月娥,馮 娟,楊清華,等.魚類免疫球蛋白的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2010,(9):37-39.

[16]Lange S,Gudmundsdottir B K,Magnadottir B,et al.Humoral immune parameters of cultured Atlantic halibut (HippoglossushippoglossusL.)[J].Fish Shellfish Immunol,2001,11(6):523-535.

[17]Ochsenbein A F,Fehr T,Lutz C,et al.Control of early viral and bacterial distribution and disease by natural antibodies[J].Science,1999,286(5447):2156-2159.

[18]楊 玲,孟慶磊,張龍崗,等.草魚MHC classⅠ基因多態(tài)性及其與魚體抗柱形病能力關(guān)系分析[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,17(10):42-50.

[19]徐志本,余為一,仲大蓮,等.雞MHC Ⅱβ 鏈基因的克隆和表達(dá)及其抗體制備[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,33(11):51-55.

[20]Strand H K,DalmoR A.Absorption of immunomodulating B(1,3)2 glucan in yolk sac larvae of Atlantic halibut,Hippoglossushippoglossus(L.)[J].J Fish Dis,1997,20:41-49.

[21]宋曉青,邢 婧,戰(zhàn)文斌.牙鲆經(jīng)注射和浸泡免疫鰻弧菌滅活疫苗后7種免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2014,21(4):747-758.

[22]奕志娟,郝貴杰,袁雪梅,等.草魚出血病滅活疫苗上調(diào)草魚脾細(xì)胞主要免疫分子的表達(dá)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2015,31(5):177-181.

[23]葉 華,何麗君,程輝輝,等.注射嗜水氣單胞菌滅活菌的齊口裂腹魚外周血免疫指標(biāo)的變化[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,36(5):28-35.

[24]蘇友祿,馮 娟,郭志勛,等.軍曹魚淋巴器官發(fā)育的形態(tài)學(xué)研究[J].海洋水產(chǎn)研究,2008,29(4):7-14.

(責(zé)任編輯：張紅林)

歡迎訂閱2017年度《水產(chǎn)科技情報(bào)》雜志

ISSN 1001-1994 CN 31-1250

●中國期刊方陣雙效期刊 ●華東地區(qū)優(yōu)秀期刊 ●上海市優(yōu)秀科技期刊

《水產(chǎn)科技情報(bào)》是由上海市水產(chǎn)研究所、上海市水產(chǎn)學(xué)會(huì)主辦的水產(chǎn)技術(shù)類雜志，被《中文核心期刊要目總覽》(1992、2004、2008、2011年版)收錄，是中國期刊方陣雙效期刊、華東地區(qū)優(yōu)秀期刊、上海市優(yōu)秀科技期刊。本刊堅(jiān)持“以技術(shù)性為主，兼容學(xué)術(shù)性、普及性和動(dòng)態(tài)、信息性”的辦刊方針以及“立足上海、服務(wù)全國、面向市場，積極參與國際間漁業(yè)科技和信息交流”的辦刊目標(biāo)，注重學(xué)科的前瞻性，技術(shù)的先進(jìn)性，動(dòng)態(tài)信息的及時(shí)性，市場的導(dǎo)向性以及文字的可讀性，把普及與提高結(jié)合起來，較好地適應(yīng)了水產(chǎn)界多層次讀者的需求，發(fā)行面遍及全國(包括港臺(tái)地區(qū))，并涉足東南亞地區(qū)。主要欄目：綜述、海水養(yǎng)殖、淡水養(yǎng)殖、水產(chǎn)飼料、病害防治、漁業(yè)環(huán)境、專題講座(以特種水產(chǎn)養(yǎng)殖為主)、觀賞魚和水族生態(tài)、漁業(yè)簡訊等。本刊為雙月刊，逢單月20號(hào)出版，國際標(biāo)準(zhǔn)大16開。讀者可向當(dāng)?shù)剜]局辦理訂閱手續(xù)，也可直接匯款至編輯部訂閱。歡迎來電來函垂詢。本刊承接各類漁業(yè)商品廣告，封頁涂塑，彩版采用進(jìn)口銅版紙印刷，并有彩色、雙色、單色插頁，設(shè)計(jì)獨(dú)到，制作精良，收費(fèi)合理，歡迎廣大廠商惠顧。

郵 發(fā) 代 號(hào)：4-204 每冊定價(jià)：6.00元 全年訂費(fèi)：36.00元

編輯部地址：上海市佳木斯路265號(hào) 上海市水產(chǎn)研究所 郵 編：200433

電 話：021-65483215-636，65489796(直線) 聯(lián)系人：劉 琴

傳 真：021-65508504

E-mail：fishmaga@163.com，fishmaga@126.com

網(wǎng) 址：http://www.shfishery.net

圖版Ⅰ 草魚不同時(shí)期各組織的顯微觀察

1.壓塘3月齡草魚頭腎，標(biāo)尺:200 μm。2.普通3月齡草魚頭腎，標(biāo)尺:50 μm。3.壓塘3月齡草魚中腎，標(biāo)尺:200 μm。4.普通3月齡草魚中腎,標(biāo)尺:200 μm。5.壓塘3月齡草魚腸道，標(biāo)尺:50 μm。6.普通3月齡草魚腸道，標(biāo)尺:50 μm。7.壓塘3月齡草魚脾臟，標(biāo)尺:200 μm。8.普通3月齡草魚脾臟，標(biāo)尺:200 μm。

C.PD 腎小管；P 近端小管；DS 遠(yuǎn)端小管；MU 中腎單位；MC 肌層；MF 黏膜皺襞。)

The histology of immune organs of 3-month-old grass carp and transcriptional differences of immune genes after immunization

ZHANG Peng-ying1,2,CHANG Ou-qin1,SHI Cun-bin1,WU Shu-qin1

(1.KeyLabofAquaticAnimalImmuneTechnologyofGuangdongProvince,KeyLabofFisheryDrugDevelopmentofMinistryofAgriculture/PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510380,China;2.CollegeofFisheryandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

In order to study the consistency between the degree of maturation and the body sizes of the grass carpCtenopharyngodonidellusin different breeding conditions,the experiment observed the microstructure of head kidney,kidney,intestine and spleen in high-density and low-feeding 3-month-old grass carp and common 3-month-old grass carp,and intraperitoneal injection of vaccine treatment was conducted in the two groups of grass carp.Head kidneys,kidneys,intestines and spleens were sampled on days 7 and 14 days after injection,and the expression levels of IgM and MHCⅠmRNAs in these organs were detected through the real-time fluorescence quantitative PCR(RT-PCR).The results showed that the development of different organs was slow in high-density,low-feeding 3-month-old grass carp,and the head kidneys,kidneys,intestines and spleens of common 3-month-old grass carp almost attained maturity.After immunization,the expression levels of IgM and MHCⅠmRNAs in these organs of high-density,low-feeding 3-month-old grass carp were significantly increased.The highest expression of IgM and MHCⅠ appeared in the kidney of common 3-month-old grass carp immunized 14 days (IgM for 74.51 times,MHC class Ⅰ for 56.02 times).Results showed that grass carp hemorrhage live vaccine can enhance the expression of IgM and MHCⅠ in head kidney,kidney,intestine and spleen of grass carp,and the age of 3 months period were the best immunization time.

grass carp;histology of immune organs;vaccine immunization;IgM;MHCⅠ

2016-04-13；

2016-05-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金“大宗淡水魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系”(CARS-46)；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃：淡水養(yǎng)殖魚類病害免疫防控關(guān)鍵技術(shù)研究與產(chǎn)品開發(fā)(2012BAD25B00)

張鵬英(1989- )，女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物疾病防治。E-mail:504937622@qq.com

吳淑勤。E-mail:wushuqin001@21cn.com；常藕琴，E-mail:changouqin@163.com

S942.5

A

1000-6907-(2016)06-0064-08