李苗 付冰冰 吳霞 胡澤昆 孫曉鵬

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·臨床研究論著·

系統(tǒng)性紅斑狼瘡與腸道菌群的相關(guān)研究

李苗 付冰冰 吳霞 胡澤昆 孫曉鵬

目的 探討SLE與腸道菌群、炎癥因子及疾病活動(dòng)度之間的關(guān)系，以及經(jīng)糖皮質(zhì)激素(激素)聯(lián)合羥氯喹治療后三者的變化及其治療作用機(jī)制。方法 選擇25名健康體檢者(正常對(duì)照組)及30例初診SLE患者(SLE組)，后者接受為期3個(gè)月的激素聯(lián)合羥氯喹治療，分別收集正常對(duì)照組及SLE組患者治療前后的糞便標(biāo)本，應(yīng)用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)大腸埃希菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌定量，同時(shí)應(yīng)用ELISA法對(duì)外周血中IL-17、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)， 并行SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)評(píng)價(jià)SLE患者的病情活動(dòng)程度。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，治療前SLE患者大腸埃希菌數(shù)較多(P<0.01)，雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)較少(P均<0.01)；外周血中IL-17水平較高(P<0.05)，且與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.699，P<0.05)；TGF-β水平下降(P<0.05)，且與乳酸桿菌的數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.416，P<0.05)。與治療前相比，激素聯(lián)合羥氯喹治療3個(gè)月后 SLE患者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)減少(P均<0.05)，大腸埃希菌數(shù)無(wú)明顯變化(P>0.05)；SLE患者SLEDAI評(píng)分降低(P<0.05)，血清IL-17水平下降(P<0.01)、但仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)，TGF-β水平升高(P<0.01)、但仍低于正常對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 SLE患者存在較明顯的腸道菌群失調(diào)狀態(tài)。激素聯(lián)合羥氯喹治療可改善SLE患者的病情，但同時(shí)可能會(huì)進(jìn)一步加重腸道菌群失調(diào)狀態(tài)。IL-17及TGF-β等炎癥因子可能參與SLE的發(fā)病及治療作用機(jī)制。SLE狀態(tài)下，乳酸桿菌與TGF-β可能有關(guān)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； 腸道菌群；糖皮質(zhì)激素；羥氯喹；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

Glucocorticoid; Hydroxychloroquine; Real-time PCR

SLE是一種累及全身多系統(tǒng)多臟器的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，一直是當(dāng)前風(fēng)濕病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[1-3]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及其下游表達(dá)的相關(guān)炎癥細(xì)胞因子IL-17、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)在SLE發(fā)病過(guò)程中尤為重要[4]。腸道黏膜免疫反應(yīng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其主要依靠黏膜內(nèi)T、B細(xì)胞及分泌至腸腔中的sIgA等共同完成局部免疫功能[5]。腸道菌群作為黏膜免疫重要參與者，通過(guò)影響?zhàn)つっ庖咧刑囟ǖ难装Y因子發(fā)揮對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的整體調(diào)節(jié)作用。糖皮質(zhì)激素(激素)及免疫抑制劑是目前治療SLE的一線藥物，可有效改善SLE患者的病情。本研究采用自身對(duì)照的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，應(yīng)用SYBR Green I熒光定量PCR及ELISA對(duì)SLE患者在治療前后的腸道菌群及外周血炎癥因子進(jìn)行定量，旨在分析在疾病狀態(tài)下及治療后各研究指標(biāo)的差異，闡明腸道菌群與IL-17、TGF-β等炎癥細(xì)胞因子在SLE的發(fā)病機(jī)制、疾病進(jìn)展及治療中的作用。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選取2014年1月至2014年12月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診及住院部初診SLE患者30例為SLE組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～55歲；②符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1982年診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為SLE。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近4周內(nèi)曾應(yīng)用抗生素或微生物制劑；②近期有腸道手術(shù)史；③藥物依從性差及不配合患者。其中男2例、女28例，年齡19～54歲、中位年齡26歲。另選擇同期在我院行健康體檢的25名健康人為正常對(duì)照組，該25人與30例SLE患者的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究的各個(gè)程序均符合醫(yī)院倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有入組者均簽署知情同意書。

二、治療方法

所選取的初診患者均根據(jù)2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)SLE診斷及治療指南規(guī)范治療：聯(lián)合使用激素和羥氯喹，劑量為潑尼松0.5～1 mg/(kg·d),或甲潑尼龍40～60 mg/d，持續(xù)應(yīng)用1周，之后依據(jù)患者病情調(diào)整劑量，同時(shí)使用羥氯喹0.2～0.4 g/d。

三、檢測(cè)方法

1. 主要試劑及儀器

主要試劑包括日本Takara 2倍濃縮的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的預(yù)混和溶液，Taq DNA 聚合酶，普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒，糞便基因組DNA提取試劑盒。主要儀器有美國(guó)Bio-Rad核酸蛋白檢測(cè)儀，德國(guó)Biometra溫度梯度PCR儀，北京六一電腦三恒多用電泳儀，上海領(lǐng)成Tocan凝膠成像分析儀，美國(guó)ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

2. 糞便標(biāo)本采集及檢測(cè)

分別收集正常對(duì)照組和SLE組患者在治療前及治療3個(gè)月的糞便標(biāo)本，40 min內(nèi)保存于-80℃冰箱。稱取中段200 mg便樣，嚴(yán)格按照糞便基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明操作，對(duì)所提取DNA進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)，OD260/OD280均在1.8～2.0，多管分裝并置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。取上述提取DNA產(chǎn)物應(yīng)用SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)糞便標(biāo)本中的大腸埃希菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌定量。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)引物序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見表1，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25 μl：上、下游引物各1 μl，5 U/L Taq聚合酶0.2 μl，模板DNA 2 μl，MgCl24 μl， 重蒸水16.8 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃15 s，退火30 s(大腸埃希菌60℃、雙歧桿菌52℃、乳酸桿菌54℃)，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃復(fù)性10 min。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時(shí)間50 min。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束以后，應(yīng)用Tocan凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)各電泳條帶進(jìn)行攝像。另外，將普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，嚴(yán)格按照普通PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒操作說(shuō)明對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將回收后的產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和A值，換算成各標(biāo)準(zhǔn)品1 μl的拷貝數(shù)。將各標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列梯度稀釋，設(shè)置5個(gè)濃度梯度點(diǎn)，進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系20 μl：2倍濃縮的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的預(yù)混和溶液 10 μl、上、下游引物25 mmol/L各0.8 μl、ROX 0.4 μl，標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板1.5 μl，重蒸水6.5 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后95℃復(fù)性15 s。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物從60～95℃以0.5℃間隔逐漸加熱，繪制熔解標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到各待測(cè)樣品中大腸埃希菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的拷貝數(shù)。

表1 各腸道菌群16SrDNA引物序列

3. 血清IL-17和TGF-β水平檢測(cè)

分別于正常對(duì)照組入組時(shí)和SLE組患者治療前及治療3個(gè)月的清晨采集其外周肘靜脈血，低速離心分離血清，采用ELISA法檢測(cè)正常對(duì)照組及SLE患者治療前、后血清中IL-17、TGF-β水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

四、臨床資料的采集及SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)評(píng)分

分別于治療前、治療3個(gè)月，對(duì)SLE組患者進(jìn)行病史采集、體格檢查及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，并進(jìn)行SLEDAI評(píng)分，了解患者病情活動(dòng)情況。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR引物的特異性，以500 bp標(biāo)記物為標(biāo)尺，從圖1中普通PCR產(chǎn)物可見明亮的特異性條帶，無(wú)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增，說(shuō)明引物特異性好。

二、擴(kuò)增曲線

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，兩者形成S型擴(kuò)增曲線，熒光強(qiáng)度隨模板循環(huán)數(shù)的增加而增加，經(jīng)過(guò)指數(shù)擴(kuò)增期、線性擴(kuò)增期之后到達(dá)平臺(tái)期，各腸道菌群的擴(kuò)增曲線見圖2。

圖1 引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

M：標(biāo)記物；1：大腸埃希菌(190 bp)；2：乳酸桿菌(232 bp)；3：雙歧桿菌(198 bp)

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線

以各標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，由軟件自動(dòng)繪制出各標(biāo)準(zhǔn)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系可以計(jì)算出待測(cè)樣本中各個(gè)細(xì)菌的拷貝數(shù)。大腸埃希菌屬：Y=-3.603X+42.377，r= 0.999；雙歧桿菌屬：Y=-8.846X+46.678，r= 0.999；乳酸桿菌屬：Y=-3.310X+36.446，r=0.998；r值均大于0.990，見圖3。

圖2 SLE患者糞便標(biāo)本的腸道菌群擴(kuò)增曲線

A：大腸埃希菌擴(kuò)增曲線；B：雙歧桿菌擴(kuò)增曲線；C：乳酸桿菌擴(kuò)增曲線

圖3 SLE患者糞便標(biāo)本的腸道菌群標(biāo)準(zhǔn)曲線

A：大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線；C：乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線

四、熔解曲線

SYBR Green染料是一種非特異的染料，可嵌合于雙鏈DNA的小溝，只有雙鏈DNA才會(huì)發(fā)出熒光，在延伸結(jié)束階段采集熒光信號(hào)，熔解曲線是對(duì)PCR引物特異性進(jìn)一步驗(yàn)證，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物是否為所需要目的產(chǎn)物，本研究3種細(xì)菌的熔解曲線均為單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物，且無(wú)非特異性擴(kuò)增，見圖4。

圖4 SLE患者糞便標(biāo)本的腸道菌群熔解曲線

A：大腸埃希菌熔解曲線；B：雙歧桿菌熔解曲線；C：乳酸桿菌熔解曲線

五、腸道菌群定量結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析正常對(duì)照組及SLE患者在治療前后腸道內(nèi)大腸埃希菌、雙歧桿菌以及乳酸桿菌3種細(xì)菌數(shù)的變化。與正常對(duì)照組相比，治療前SLE患者腸道內(nèi)大腸埃希菌數(shù)較多(P<0.01)；雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)較少(P<0.01)。應(yīng)用激素及羥氯喹治療后，SLE患者腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)比治療前減少(P均<0.05)，大腸埃希菌數(shù)無(wú)變化(P>0.05)，見表1、2。

表1 SLE組與正常對(duì)照組的3種腸道菌群數(shù)量比較 lg copies/g

注：與正常對(duì)照組比較，SLE組治療前t大腸埃希菌=2.552、t雙歧桿菌=3.461、t乳酸桿菌=2.322，aP<0.05、bP<0.01；與SLE組治療前比較，SLE組治療后t大腸埃希菌=1.540、t雙歧桿菌=6.783、t乳酸桿菌=9.264，cP<0.01

六、外周血IL-17、TGF-β水平及SLEDAI評(píng)分結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，SLE組患者血清中IL-17水平增高(P<0.05)，且與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.699，P<0.05)，見圖5A；TGF-β水平下降(P<0.05)，且與乳酸桿菌數(shù)呈正相關(guān)(r=0.416，P<0.05)，見圖5B。經(jīng)激素及羥氯喹治療后，SLE組患者血清中IL-17水平下降(P<0.01)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)；TGF-β水平升高(P<0.01)，但仍低于正常對(duì)照組(P<0.01)。SLE患者治療后，SLEDAI評(píng)分明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 SLE組與正常對(duì)照組的外周血IL-17、TGF-β及SLEDAI比較

注：與正常對(duì)照組比較，SLE組治療前tIL-17=10.831、tTGF-β=9.759，SLE組治療后tIL-17=8.492、tTGF-β=2.461，aP<0.01、bP<0.05；與SLE組治療前比較，SLE組治療后tIL-17=6.562、tTGF-β=-9.450、tSLEDAI=4.071，cP<0.01

圖5 IL-17與SLEDAI評(píng)分及TGF-β與乳酸桿菌數(shù)的相關(guān)性分析

A：IL-17與SLEDAI的相關(guān)性分析；B：TGF-β與乳酸桿菌數(shù)的相關(guān)性分析

討 論

IL-17本質(zhì)是一種含155個(gè)氨基酸的糖蛋白，可通過(guò)刺激中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞，誘導(dǎo)趨化因子(如MCP-1)與細(xì)胞因子(如IL-6、TNF-α)，促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生，加重局部炎癥和對(duì)組織的損傷。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在新發(fā)SLE、兒童SLE、青少年SLE以及發(fā)病的孕婦中均呈增高的趨勢(shì)[7-9]。此外，在SLE患者外周血中Th17水平及在活化的外周血單個(gè)核細(xì)胞中mRNA的表達(dá)也有增加[10]。本研究通過(guò)ELISA法檢測(cè)IL-17水平發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血IL-17水平高于正常對(duì)照組，且與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)果一致，表明在SLE患者體內(nèi)IL-17水平呈增高趨勢(shì)，推測(cè)可能為SLE患者體內(nèi)存在IFN-α- B細(xì)胞刺激因子(BLyS)-IL-17軸，通過(guò)激活BLyS，促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，產(chǎn)生大量自身抗體并促進(jìn)Th17細(xì)胞分泌IL-17，促發(fā)機(jī)體持續(xù)性炎癥反應(yīng)，同時(shí)大量自身抗體形成的免疫復(fù)合物還可通過(guò)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)促進(jìn)IFN-α的形成，加重SLE炎癥狀態(tài)[11]。另有研究表明，IL-17與IL-6存在強(qiáng)相關(guān)，且IL-17/1L-6更能反映疾病活動(dòng)程度，IL-17主要由初始CD4+T細(xì)胞在IL-6及TGF-β作用下分化的Th17細(xì)胞直接分泌，高水平的IL-6可進(jìn)一步促進(jìn)IL-17的表達(dá)，上調(diào)炎癥反應(yīng)[12]。由此可推測(cè)，IL-17可通過(guò)驅(qū)動(dòng)不同的免疫途徑，影響SLE的發(fā)病進(jìn)展，另有研究發(fā)現(xiàn)，血清巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子水平亦與狼瘡疾病活動(dòng)性有關(guān)[13]。

TGF-β家族由一類結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長(zhǎng)因子亞家族組成, TGF-β對(duì)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生免疫抑制功能，對(duì)維持機(jī)體免疫耐受發(fā)揮重要作用[14]。本研究顯示，初治SLE患者與正常對(duì)照組相比，TGF-β水平下降，與李志等[15]研究結(jié)果相符。目前已有相關(guān)研究證實(shí)，SLE患者體內(nèi)多態(tài)性啟動(dòng)因子C-509T可能會(huì)增強(qiáng) SLE的遺傳易感性，其可對(duì)TGF-β基因產(chǎn)生影響，降低TGF-β的表達(dá)[16]。同時(shí)當(dāng)內(nèi)環(huán)境中僅有TGF-β存在時(shí)，初始CD4+T細(xì)胞分化為Treg，而不會(huì)分化為Th17，從而發(fā)揮免疫抑制作用，有效抑制免疫活性細(xì)胞的增殖和分化，當(dāng)IL-6大量存在時(shí)，抑制Treg細(xì)胞的增殖，與TGF-β共同誘導(dǎo)Th17的分化，分泌IL-17介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)。在SLE狀態(tài)下Th17的過(guò)度分化使IL-17、IL-23等促炎細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)，TGF-β不能發(fā)揮原有的免疫抑制功能，從而打破了兩者之間正常的免疫平衡狀態(tài)，導(dǎo)致SLE的發(fā)病[17]。

腸道菌群是存在于人體胃腸道內(nèi)的正常微生物群，不僅參與構(gòu)成腸道的生物屏障，還可參與人體多種病理生理性代謝過(guò)程。本研究顯示，與正常對(duì)照組相比，SLE患者腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌數(shù)明顯減少，大腸埃希菌數(shù)量明顯增多。大腸埃希菌為條件致病菌[18]。當(dāng)腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌數(shù)減少時(shí)，其競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用減弱，大腸埃希菌等條件致病菌處于生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，因此當(dāng)SLE患者腸道內(nèi)有益菌和條件致病菌之間的平衡打破，就會(huì)造成腸道菌群失調(diào)，機(jī)體免疫功能障礙，導(dǎo)致SLE等多種自身免疫性疾病的發(fā)生[19-20]。本研究結(jié)果顯示，乳酸桿菌數(shù)與外周血TGF-β水平呈正相關(guān)，但兩者相關(guān)程度較弱，多項(xiàng)研究已表明，腸道菌群可調(diào)節(jié)體內(nèi)多種炎癥細(xì)胞因子，雙歧桿菌是腸道內(nèi)數(shù)量最多的益生菌，可促進(jìn)B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和IL-10、TGF-β的分泌[21]。 乳酸桿菌則可對(duì)TNF-α和IL-6產(chǎn)生刺激作用[22]。Kosiewicz等[23]證明乳酸桿菌可以通過(guò)機(jī)體內(nèi)黏膜免疫反應(yīng)促進(jìn)TGF-β的分泌，提高Treg細(xì)胞的水平，由此可見，腸道菌群在機(jī)體促炎及抗炎過(guò)程均發(fā)揮作用，在SLE狀態(tài)下 TGF-β與乳酸桿菌之間可能有關(guān)，但兩者的關(guān)系受體內(nèi)其他菌群、細(xì)胞因子及治療過(guò)程中藥物的影響，因此兩者之間更深層次的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

激素和羥氯喹是目前治療SLE的基礎(chǔ)藥物。研究發(fā)現(xiàn)，激素進(jìn)入靶細(xì)胞胞漿后可與胞漿內(nèi)的特異性受體結(jié)合，調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄活性，可抑制淋巴細(xì)胞中活化蛋白-1(AP-1)及核因子-κB等轉(zhuǎn)錄因子，從而下調(diào)編碼炎癥性細(xì)胞因子的基因表達(dá)，發(fā)揮抗炎及免疫抑制作用。羥氯喹則可通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞的趨化和浸潤(rùn)，從而發(fā)揮有效抗炎作用，該過(guò)程涉及TNF-ɑ、IL-1和 IL-6等炎癥因子。本研究顯示，SLE患者經(jīng)激素聯(lián)合羥氯喹治療3個(gè)月后的SLEDAI評(píng)分降低，外周血中IL-17水平下降，但仍高于正常對(duì)照組，TGF-β的表達(dá)水平明顯提高，但仍低于正常對(duì)照組，以上結(jié)果表明激素聯(lián)合羥氯喹可有效改善患者的病情，且IL-17、TGF-β等炎癥因子在SLE的發(fā)病及治療機(jī)制中發(fā)揮重要作用，激素和羥氯喹可分別通過(guò)抑制B細(xì)胞的分化及下游炎癥細(xì)胞因子的形成，改善Treg細(xì)胞的功能，抑制機(jī)體炎癥狀態(tài)。本研究顯示，SLE患者治療后，雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量減少，大腸埃希菌的數(shù)量無(wú)變化，提示SLE患者應(yīng)用激素和羥氯喹治療，雖然在短期內(nèi)可明顯控制病情，但長(zhǎng)期應(yīng)用可能會(huì)使腸道菌群失調(diào)狀態(tài)進(jìn)一步加重，目前有關(guān)羥氯喹是否具有抗菌作用一直備受爭(zhēng)議。早在上世紀(jì)七十年代，有關(guān)學(xué)者就提出在體外環(huán)境下，羥氯喹等抗瘧藥可抑制大腸埃希菌、藤黃微球菌DNA聚合酶的形成，數(shù)十年后Wolf等[24]則發(fā)現(xiàn)，奎寧沒有表現(xiàn)出對(duì)大腸埃希菌的抗菌活性。Huang等[25]觀察無(wú)菌小鼠及黏蛋白基因2(Muc2)敲除的小鼠模型，當(dāng)注射地塞米松4周后，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)黏蛋白表達(dá)下降。推測(cè)其機(jī)制可能是應(yīng)用激素及羥氯喹治療后，抑制自身抗體產(chǎn)生，從而減輕自身炎癥狀態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，并對(duì)腸黏膜相關(guān)組織內(nèi)黏膜免疫產(chǎn)生影響，進(jìn)一步影響腸道菌群的免疫耐受機(jī)制，導(dǎo)致腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，本研究在自身對(duì)照基礎(chǔ)上研究?jī)烧咧g的潛在聯(lián)系，證實(shí)了在SLE病理性自身免疫炎癥及治療作用下腸道菌群存在失調(diào)狀態(tài)。

綜上所述，本研究通過(guò)熒光定量PCR及ELISA的方法, 對(duì)SLE患者腸道中大腸埃希菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌以及外周血IL-17、TGF-β進(jìn)行精確定量，結(jié)果提示IL-17、TGF-β等炎癥因子以及腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能均可能參與SLE的發(fā)病及其治療變化機(jī)制，本研究有望在SLE的發(fā)病機(jī)制、靶點(diǎn)治療及減少藥物不良反應(yīng)方面提供新的思路。

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(本文編輯：林燕薇)

Correlation between systemic lupus erythematosus and gut microbiota

LiMiao,FuBingbing,WuXia,HuZekun,SunXiaopeng.

DepartmentofRheumatology,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154000,China

,SunXiaopeng,E-mail:SXP_JMS7097@163.com

Objective To analyze the relationship among systemic lupus erythematosus (SLE), gut microbiota, inflammatory cytokines and disease activity, and to explore the effect and potential mechanism of glucocorticoid combined with hydroxychloroquine therapy on their relationship. Methods Twenty five healthy individuals (control group) and 30 patients with new-onset SLE (SLE group) were recruited in this study. Patients in the SLE group received combined therapy of glucocorticoid and hydroxychloroquine for three months. Fecal samples were obtained before and after corresponding treatment in two groups. SYBR Green I real-time PCR was performed to measure the quantity of the Escherichia coli, Baeteroides and Lactobacillus. The expression levels of IL-17 and TGF-β in peripheral blood were detected by ELISA. The disease activity of SLE patients was evaluated by SLE disease activity index (SLEDAI). Results Compared with the control group, the copies of Escherichia coli in SLE patients were significantly increased, whereas the quantity of Baeteroides and Lactobacillus was significantly decreased (allP<0.01). The level of serum IL-17 was significantly up-regulated (P<0.05), and positively correlated with SLEDAI score (r=0.699,P<0.05). The level of serum TGF-β was significantly down-regulated (P<0.05), and positively correlated with the copies of Lactobacillus (r=0.416,P<0.05). After 3-month corticosteroid combined with hydroxychloroquine therapy, the quantity of Baeteroides and Lactobacillus was further reduced (bothP<0.05), while no significant change was observed in the copies of Escherichia coli (P>0.05). In SLE patients, SLEDAI score was reduced (P<0.05) and the level of serum IL-17 was down-regulated (P<0.01), still significantly higher than that in the control group (P<0.01). The level of serum TGF-β was up-regulated (P<0.01), still lower compared with that in the control group (P<0.05). Conclusions SLE patients present with evident state of intestinal dysbacteriosis. Combined therapy of glucocorticoid and hydroxychloroquine can significantly alleviate the severity of SLE, whereas may further aggravate the state of intestinal dysbacteriosis. The inflammatory cytokines of IL-17 and TGF-β may be involved in the pathogenesis and therapeutic mechanism of SLE. Lactobacillus is probably correlated with TGF-β in SLE patients.

Systemic lupus erythematosus; Gut microbiota;

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.11.004

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(LZR2014_019)

154000 佳木斯，佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

，孫曉鵬， E-mail：SXP_JMS7097@163.com

2016-05-06)