曾俊棋，岳萬福

（浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江　杭州　311300）

Zeng Junqi,Yue Wanfu*

(Col lege of Animal Science and Technology,Zhej iang Agricul ture&Forest University,Zhej iang　Hangzhou 311300)

豬源大腸桿菌耐藥性與毒力的研究

曾俊棋，岳萬福?

（浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江杭州311300）

為了有效預(yù)防豬腸道疾病的大面積感染，本試驗(yàn)針對(duì)豬源大腸桿菌耐藥性與毒力開展研究。結(jié)果表明，被測(cè)大腸桿菌菌株對(duì)卡那霉素、阿莫西林、青霉素等抗生素具有耐藥性，對(duì)鏈霉素、磷霉素等抗生素具有敏感性，其對(duì)卡那霉素與青霉素的最小抑菌濃度較高，但對(duì)于氟苯尼考、慶大霉素、強(qiáng)力霉素與四環(huán)素，大腸桿菌菌株的最小抑菌濃度差異較明顯。EDL933大腸桿菌菌株中Stx2基因成功轉(zhuǎn)移到PS1、PS2、PS3大腸桿菌菌株的基因組中，并在相應(yīng)菌株中得到表達(dá)，產(chǎn)生毒力蛋白，表明EDL933大腸桿菌菌株的Stx2毒力基因會(huì)發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移，以期為豬腸道疾病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

豬；大腸桿菌；耐藥性；毒力

Zeng Junqi,Yue Wanfu*

(Col lege of Animal Science and Technology,Zhej iang Agricul ture&Forest University,Zhej iangHangzhou 311300)

畜禽大腸桿菌病已成為危害養(yǎng)殖業(yè)的最普遍發(fā)生且防治最棘手的疾病之一，如產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia col i，STEC）能產(chǎn)生強(qiáng)烈毒素，嚴(yán)重危害畜禽健康，已成為全球性公共衛(wèi)生問題的焦點(diǎn)，導(dǎo)致畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失日趨嚴(yán)重[1-2]。雖然抗生素的應(yīng)用對(duì)畜禽致病性大腸桿菌起到了一定的抑制作用，但抗生素的濫用卻導(dǎo)致了大腸桿菌耐藥性的擴(kuò)散，這使得畜禽疾病的防治更為困難[3]。大腸桿菌的耐藥性分為固有耐藥和獲得耐藥[4]。固有耐藥是由細(xì)菌染色體基因決定，而獲得耐藥是指細(xì)菌在接觸抗生素后，通過改變代謝途徑使自身不被抗菌藥物殺滅的抵抗力，獲得耐藥可通過耐藥基因的傳代、轉(zhuǎn)移、傳播、擴(kuò)散、變異形成高度和多重耐藥[5-6]。大腸桿菌在大量使用非必要抗生素的環(huán)境下，易產(chǎn)生耐藥性，并且其耐藥性會(huì)隨時(shí)間推移大幅度上升，最終導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)[7]。大腸桿菌可通過噬菌體、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等遺傳因子，使耐藥基因、毒力基因水平轉(zhuǎn)移至其他菌株[8]。本試驗(yàn)對(duì)豬場(chǎng)大腸桿菌耐藥性和毒力展開研究，旨在闡明抗生素可促進(jìn)大腸桿菌耐藥性的形成、大腸桿菌毒力基因水平轉(zhuǎn)移的可能性，以期為豬腸道疾病的防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥品和試劑試驗(yàn)用抗生素，藥敏試紙，置于-20℃冰箱中備用。模式菌株EDL933，MG1655為微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種。Kovacs試劑、甲基紅試劑、Luria-Ber tani（LB）培養(yǎng)基、三糖鐵和麥康凱等培養(yǎng)基所用原料均購(gòu)自上海生工生物公司。PCR試劑盒、DL2000Marker、LBKan50、O157∶H7大腸桿菌血清試劑盒、DIG核酸檢測(cè)試劑盒、ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1大腸桿菌的分離在杭州市6個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)采集豬糞樣。取6支5 mL滅菌離心管，編號(hào)1～6，用滅菌小鑰匙刮取豬大腸內(nèi)少許糞便，裝入標(biāo)記好的離心管中并立刻蓋上。采集的樣本經(jīng)PBS稀釋后分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，然后各挑取15個(gè)單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，于麥康凱固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，進(jìn)行菌株篩選。取篩選獲得的具大腸桿菌性狀的LB液體培養(yǎng)基中的菌液，穿刺并劃線接種于三糖鐵斜面培養(yǎng)基作進(jìn)一步觀察。挑取經(jīng)篩選獲得的菌株各3個(gè)，分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2藥敏試驗(yàn)采用紙碟法。先制備LB固體培養(yǎng)基平皿，在平皿上均勻涂布菌液。隨后，在該平皿上分別放置含供試抗生素的藥敏紙片。培養(yǎng)皿先正著放在溫箱中培養(yǎng)4 h后，倒置培養(yǎng)20 h，測(cè)量抑菌圈的大小，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，該試驗(yàn)每個(gè)菌株，每種抗生素設(shè)3次重復(fù)，5個(gè)平行。卡那霉素、阿莫西林、鏈霉素、磷霉素、青霉素、氟苯尼考、慶大霉素、強(qiáng)力霉素與四環(huán)素等抗生素均購(gòu)自南京都萊生物公司。

1.2.3最小抑菌濃度（M IC）測(cè)定分別取LB液體培養(yǎng)基中500μL各菌液于含4.5 mL LB液體培養(yǎng)基試管中混勻，將要檢測(cè)的6種抗生素都配成2 560μg/mL濃度，備用。取96孔培養(yǎng)板，第2～11孔加入用LB液體培養(yǎng)基稀釋好的菌液0.1 mL。然后于第1孔加入抗生素溶液0.2 mL，混合后吸0.1 mL加入第2孔中，用同樣的方法稀釋至第11孔，棄去0.1 mL。各孔中藥物濃度分別為2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/mL。以第一孔作為對(duì)照組。37℃培養(yǎng)24 h，以目測(cè)法觀察渾濁度，找出第一個(gè)澄清的菌液孔，確定為最低抑菌濃度，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4大腸桿菌毒力基因Stx2的檢測(cè)取6個(gè)采樣點(diǎn)分離鑒定后的大腸桿菌，取單個(gè)菌落接種于3 mL的LB液體培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h。熱毒力基因Stx2基因的上游引物：AATAGTATACGGACAGCGAT，下游引物：TCTGACATTCTGGTTGACGC。取0.5μL DNA作為10μL PCR擴(kuò)增體系的模板，包含1μL的dNTP、0.5μL的上下游引物、0.2μL的Taq聚合酶、1μL的10×PCR Buf fer與6.3μL的滅菌蒸餾水，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性（94℃、10 min）、變性（94℃、30 s）、退火（56℃、30 s）、延伸（72℃、40 s），循環(huán)數(shù)為30次，72℃最后延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用EB染色后在2%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，置于紫外檢測(cè)儀下觀察。

1.2.5菌落原位雜交篩選轉(zhuǎn)化形成的Stx2系大腸桿菌將EDL933大腸桿菌和含有慶大霉素的MG1655大腸桿菌在37℃下聯(lián)合培養(yǎng)24 h；加入慶大霉素80μg/mL進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)新轉(zhuǎn)移得到的STEC大腸桿菌進(jìn)行原位雜交，并且用DIG標(biāo)簽標(biāo)記Stx2基因進(jìn)行原位雜交，將MG1655和經(jīng)過10倍稀釋過的O157大腸桿菌一起放于80μg/mL慶大霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)；將培養(yǎng)出的200～250個(gè)菌落，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜；隨后將硝酸纖維素濾膜移至LB-慶大霉素培養(yǎng)基上，在37℃的條件下培養(yǎng)3 h；培養(yǎng)過后，將已干燥的硝酸纖維素濾膜浸于10%的SDS溶液中，然后進(jìn)行變性溶解和失性溶解，再用2倍的SSC溶液沖洗[17]。將硝酸纖維素濾膜在80℃的條件下烘烤2 h，將交叉結(jié)合的DNA與DIG標(biāo)簽進(jìn)行雜交結(jié)合；帶有Stx2基因的菌落，被DIG核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)出來。從培養(yǎng)基中篩選出了3組被標(biāo)記出的菌落，分別編號(hào)PS1、PS2、PS3。

1.2.6PCR證實(shí)新轉(zhuǎn)化形成的出血性大腸桿菌將有甘油冷凍保存的O157∶H7、MG1655大腸桿菌以及可能存在含有Stx2基因的陽(yáng)性菌株，通過置于LB液體培養(yǎng)基在37℃、通風(fēng)的條件下，過夜培養(yǎng)復(fù)壯。其中，EDL933設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照，而MG1655設(shè)為陰性對(duì)照。取200μL的上述過夜培養(yǎng)物在10 000 r/min的條件下離心3 min，然后重新懸浮在200μL無菌水中煮沸15 min。最后從各個(gè)菌液中初步提取DNA，取1μL DNA作為25μL PCR擴(kuò)增體系的模板；而25μL PCR反應(yīng)體系還包含200μM的dNTP、200 nM的各游引物和一個(gè)單位的Taq聚合酶。其中Stx2基因的上游引物序列為：GGCACTGTCTGAAACTGCTCC，下游引物序列為：TCGCCAGTTATCTGACATTCTG，目標(biāo)序列長(zhǎng)度為255 bp， PCR反應(yīng)產(chǎn)物用EB染色后在2%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.7ELISA檢測(cè)Stx2產(chǎn)物通過ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)新轉(zhuǎn)化形成的STEC毒性大腸桿菌（PS1、PS2、PS3）的毒力蛋白產(chǎn)物志賀毒素進(jìn)行檢測(cè)，以及對(duì)PS1、PS2、PS3進(jìn)行檢驗(yàn)，并設(shè)立EDL933為陽(yáng)性對(duì)照、MG1655為陰性對(duì)照，從而判斷PS1、PS2、PS3的Stx2毒力蛋白產(chǎn)生情況。ELISA的檢測(cè)要點(diǎn)為：標(biāo)本的采取和保存；試劑的準(zhǔn)備；加樣；保溫；洗滌；顯色和比色；定性測(cè)定。

1.2.8血清型鑒定將由甘油冷凍保存的O157∶H7、MG1655大腸桿菌以及新轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的STEC大腸桿菌，置于LB培養(yǎng)基上，在37℃、透氣的條件下培養(yǎng)復(fù)壯。過夜培養(yǎng)后，在100℃的沸水中沸煮30 min，然后用O157∶H7大腸桿菌血清試驗(yàn)盒來檢測(cè)O157血清類型。

1.2.9EDL933、MG1655與PS1-3包含O 157抗原基因的PCR檢測(cè)對(duì)EDL955大腸桿菌、MG1655大腸桿菌以及PS1、PS2、PS3大腸桿菌，按O157標(biāo)志性抗原基因的上游引物序列：CGGACATCCATGTGATATGG，下游引物序列：TTGCCTATGTACAGCTAATCC設(shè)計(jì)引物，序列長(zhǎng)度為259 bp，用于檢測(cè)大腸桿菌中O157抗原基因的存在情況，通過PCR擴(kuò)增，之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以及溴化乙錠染色，最后再紫外檢測(cè)儀下觀察并拍照記錄。

2　結(jié)果與分析

2.1大腸桿菌的分離將從豬糞便中分離的致病性大腸桿菌，置于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液呈混濁狀，試管的液面管壁上有菌環(huán)和白色沉淀物；在LB固體培養(yǎng)基上可觀察到灰白色、半透明、表面隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的圓形菌落，直徑約1～3 mm；在麥康凱培養(yǎng)基上挑取粉紅色的菌落，經(jīng)三糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選出黃色的菌落。六株大腸桿菌分離菌分別通過吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)，鑒定均為大腸桿菌菌株。

2.2藥敏試驗(yàn)由圖1分析得出，所選取的6組大腸桿菌（每組5個(gè)菌）對(duì)卡那霉素，阿莫西林、青霉素等抗生素具有耐藥性；對(duì)鏈霉素，磷霉素等抗生素具有敏感性。

2.3最小抑菌濃度測(cè)定由表1可知，6個(gè)采樣點(diǎn)的大腸桿菌對(duì)卡那霉素、青霉素都有很高的最小抑菌濃度，但是對(duì)于氟苯尼考、慶大霉素、強(qiáng)力霉素和四環(huán)素，來自杭州6個(gè)不同豬場(chǎng)的大腸桿菌菌株的最小抑菌濃度表現(xiàn)出較大的差異。

表1　六種抗生素對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度Table1 The m inima l inhibitory concentration to E.co li o f six antibiotics μg/m L

圖1　藥敏試紙?jiān)囼?yàn)結(jié)果Fig.1　Drug sensitivity test result

2.4毒力基因S S t t x x22的檢測(cè)由圖2可知，用Stx2、Sta、Stb等基因引物分別對(duì)六個(gè)豬場(chǎng)分離到的大腸桿菌進(jìn)行PCR測(cè)定，其中Stx2基因的序列長(zhǎng)度為563 bp；其中有豬場(chǎng)分離得到的大腸桿菌PCR檢測(cè)到了Stx2毒力基因。

圖2　常規(guī)PCR檢測(cè)豬場(chǎng)大腸桿菌Stx2圖譜Fig.2　The Stx2 map detected by PCR of E.coli in pig farm in Quzhou

圖3　DIG標(biāo)簽原位雜交Fig.3　DIG label in situ hybridization

2.5EDL933毒性大腸桿菌與MG1655無毒性大腸桿菌聯(lián)合培養(yǎng)由圖3可知，將EDL933毒性大腸桿菌與MG1655無毒性大腸桿菌聯(lián)合培養(yǎng)，并將這兩個(gè)菌種篩選分離后；用DIG標(biāo)簽進(jìn)行原位雜交得到結(jié)果，黑點(diǎn)為被DIG標(biāo)簽所標(biāo)記出的菌落（水平轉(zhuǎn)移率約為0.87%）；從培養(yǎng)基中篩選出了3個(gè)被標(biāo)記出的菌落，分別編號(hào)PS1、PS2、PS3。

圖4　EDL933毒性大腸桿菌、MG1655無毒性大腸桿菌與PS1-PS3大腸桿菌的Stx2基因Fig.4　The Stx2 o f EDL933,MG1655 and PS1-PS3 detected by PCR

圖5　ELISA試驗(yàn)結(jié)果Fig.5　The ELISA results

圖6　凝集反應(yīng)結(jié)果Fig.6　The resu lts of agg lutination test

圖7　常規(guī)PCR檢測(cè)EDL933、MG1655以及PS1-3大腸桿菌中O157抗原基因Fig.7　The O157 antigen gene o f EDL933,MG1655 and PS1-3 E.co li detected by PCR

2.6EDL933、MG1655與PS1--PS3毒力基因的檢測(cè)由圖4可知，經(jīng)過DIG標(biāo)簽標(biāo)記篩選得到的PS1、PS2、PS3三個(gè)菌落的大腸桿菌與EDL933毒力大腸桿菌都含有Stx2毒力基因。說明Stx2毒力基因水平轉(zhuǎn)移至MG1655無毒性大腸桿菌。

2.7ELISA試驗(yàn)由圖5可知，EDL933毒性大腸桿菌及PS1、PS2、PS3大腸桿菌均可產(chǎn)生Stx2毒力蛋白，ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果顯示黃色，表明抗原Stx2基因表達(dá)產(chǎn)生的毒力蛋白。證實(shí)EDL933大腸桿菌中Stx2基因成功轉(zhuǎn)移到PS1、PS2、PS3大腸桿菌的基因組中，并在相應(yīng)菌株中表達(dá)后產(chǎn)生毒力蛋白。

2.8凝集反應(yīng)鑒定由圖6可知，用O157∶H7專用檢測(cè)試劑盒，對(duì)O157基因進(jìn)行凝集反應(yīng)試驗(yàn)，表明EDL933毒性大腸桿菌發(fā)生凝集反應(yīng)，而PS1、PS2、PS3大腸桿菌以及MG1655大腸桿菌未發(fā)生凝集反應(yīng)；證明EDL933大腸桿菌含有O157抗原基因，而PS1、PS2、PS3大腸桿菌和MG1655大腸桿菌不含有O157抗原基因。說明PS1、PS2、PS3大腸桿菌中的Stx2毒力基因是由EDL933大腸桿菌轉(zhuǎn)入得到的。

2.9EDL933、MG1655以及PS1、PS2、PS3大腸桿菌的O157抗原基因檢測(cè)由圖7可知，用O157抗原基因的特異性引物，對(duì)EDL933、MG1655以及PS1、PS2、PS3大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)觀察試驗(yàn)結(jié)果，只有EDL933大腸桿菌中含有O157抗原基因, MG1665大腸桿菌及PS1、PS2、PS3大腸桿菌中均不含O157抗原基因。結(jié)合圖6可知，PS1、PS2、PS3大腸桿菌中所具有毒力基因是通過轉(zhuǎn)移得到的，并非本身含有的；PS1、PS2、PS3大腸桿菌是通過Stx2毒力基因水平轉(zhuǎn)移得到的新形成的STEC毒性大腸桿菌。

3　討論

大腸桿菌耐藥性不僅嚴(yán)重阻礙豬腸道疾病的防控與治療，而且可通過食物鏈將耐藥基因傳遞給人類，危害人類健康[9]。通過基因的水平轉(zhuǎn)移，獲得外源性基因是加快臨床耐藥菌株產(chǎn)生與擴(kuò)散的重要原因，SOS介導(dǎo)的誘導(dǎo)毒素合成也使含Stx基因的前噬菌體解離增加，SOS誘導(dǎo)的抗生素的臨床應(yīng)用可能與STEC疾病相關(guān)[10]。有豬場(chǎng)的大腸桿菌攜帶Stx2基因，可能是引起豬場(chǎng)仔豬腹瀉的病原體之一，大腸桿菌攜帶的Stx2基因具有水平轉(zhuǎn)移的能力，可導(dǎo)致正常的大腸桿菌也攜帶此毒力基因，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成STEC。在豬場(chǎng)腸道病菌防控方面，首先應(yīng)改變豬飼料的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，如玉米秸桿發(fā)酵飼料及有益微生物復(fù)合劑，利用微生物間的拮抗作用，提高豬體的免疫能力[11]。其次在豬飼料中應(yīng)加入既具有促進(jìn)豬生長(zhǎng)，又能夠取代抗生素的微生態(tài)制劑、中草藥、酶制劑等飼料添加劑，減少抗生素的使用量，有效降低大腸桿菌耐藥性的積累[12]；最后建立耐藥性的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，根據(jù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)指導(dǎo)獸醫(yī)臨床合理使用抗生素，采取聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方法，停止使用那些耐藥水平很高的抗生素，使致病性大腸桿菌的耐藥水平下降[13]，同時(shí)注意改善豬場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生，對(duì)病死豬及其糞便進(jìn)行無害化處理，防止腸道病菌擴(kuò)散。

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Study on drug resistance and virulence ofporcine originated Escherichia colistrains

In order to prevent widespread infection of swine intestinal disease ef fectively, Drug resistance and virulence of porcine originated Escherichia col i st rains was studied in the experiment.Resul ts showed that Escherichia coli st rains were resistant to Kanamycin,amoxici ll in,penicil l in antibiotics,etc and sensitivity to st reptomycin,fosfomycin antibiotics,etc. The minimal inhibitory concentration(MIC)of Escherichia coli strains was higher between kanamycin and penici l l in,there were the obvious dif ferences for MIC of Escherichia col i st rains to benzene nicol,f luoride,gentamycin,doxycycl ine and tet racycline.Stx2 gene of Escherichia coli strains EDL933 was successful ly t ransfer red to genome of Escherichia coli st rains PS1,PS2 and PS3 and it expressed in the corresponding st rain,then producing toxic proteins.It reveals that virulence genes of Escherichia col i st rains EDL933 could undergo horizontal transfer,so as to provide scienti f ic basis for intestinal disease prevention and cont rol of swine.

Swine;Escherichia col i;Drug resistance;Virulence

S858.31

B

1672-9692(2016)01-0038-07

2015-11-07

曾俊棋（1990-），男，碩士，從事動(dòng)物藥理學(xué)研究。

岳萬福（1967-），男，博士，副教授，從事動(dòng)物藥理學(xué)研究。

浙江農(nóng)林大學(xué)校科研發(fā)展基金（2011FR009）資助。