劉躍鈞，張 媛，蔣燕鋒，劉京晶

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水323000）

黃精種質(zhì)資源遺傳多樣性研究

劉躍鈞1,2，張 媛1，蔣燕鋒2，劉京晶1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水323000）

為揭示中藥材黃精種質(zhì)資源的遺傳多樣性及種源間親緣關(guān)系，建立了目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記（SCoT）方法，采用非加權(quán)平均距離法（UPGMA）和主坐標(biāo)分析（PCoA）等方法對19份不同種源的黃精Polygonatum材料進行分析。從待選的29個引物中篩選出15個SCoT引物用于擴增基因組DNA，總共得到500個條帶，平均每個引物產(chǎn)生33.3個條帶，其中多態(tài)性條帶498個，多態(tài)性比率為99.6%，19個黃精種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.554 0～0.734 0。結(jié)果表明：不同種源的黃精種質(zhì)有較豐富的遺傳多樣性，SCoT分子標(biāo)記可以為黃精的分類及鑒別提供一定的依據(jù)，為中藥黃精優(yōu)良品種的培育及資源可持續(xù)利用提供研究基礎(chǔ)。圖3表3參20

中草藥學(xué)；黃精；SCoT；種質(zhì)資源；聚類分析；遺傳多樣性

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同種源的黃精供試品來自浙江、安徽、湖北、遼寧、云南等地（表1），于浙江省麗水市蓮塘區(qū)林業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源圃栽植1.5 a，2014年7月采集正常生長的嫩葉，于－20℃冰箱保存。經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)斯金平教授鑒定，1～8，10～18號為多花黃精，9號為黃精，19號為滇黃精。

表1 供試的19份黃精種源Table 1 List of the 19 Polygonatum provenances

1.2 儀器與試劑

移液槍（Eppendorf公司）；冷凍離心機（Hitachi公司）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（Biometra公司）；紫外分光光度計（NanoDrop 1000）；水平電泳槽（北京市六一儀器廠）；瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)（BIO RAD公司）。Taq DNA聚合酶、三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）等基因組DNA提取相關(guān)試劑和DNA marker DL 5 000均購自寶生物工程（大連）有限公司，SCoT引物根據(jù)Collard和Mackill［8,19］公布的引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取 采用改進的十六烷基三甲基溴化胺（cetyl triethyl ammonium bromide，CTAB）法提取供試材料的基因組DNA。具體如下：黃精葉片經(jīng)蒸餾水洗凈后用吸水紙吸干，剪碎，在加有一定量聚乙烯吡咯烷酮（pvp）的研缽內(nèi)用液氮冷卻碾碎成細粉后，取適量粉樣迅速置于2.0 mL的離心管內(nèi)，加入65℃預(yù)熱的CTAB緩沖液1.0 mL，搖勻后置于65℃水浴90 min，期間輕柔攪動5～6次，冷卻至室溫，16 000 r·min－1離心10 min，吸取上清液至另一2.0 mL的離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1）萃取液，輕輕顛倒混勻室溫，10 000 r·min－1離心10 min，小心吸取上清液至另一離心管中，重復(fù)

上述步驟2～3次，直至兩相間的蛋白質(zhì)除盡，吸取上清液至另一新的1.5 mL離心管中，加入2/3倍體積預(yù)冷的異丙醇，－20℃放置30 min，12 000 r·min－1離心10 min，棄去上清液，沉淀用體積分數(shù)為70%乙醇1.0 mL漂洗2次，室溫風(fēng)干，用30 μL TE緩沖液（含核糖核酸酶RnaseA）溶解DNA。用質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度后，加雙蒸水稀釋至10.0 mg·L－1，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SCoT分析 SCoT引物采用COLLARD等［12］開發(fā)的引物，共37條，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。選取地理距離較遠的6個DNA模版進行引物篩選，根據(jù)電泳圖譜初步篩選出29條條帶多且易于區(qū)分的引物。用19個供試材料的DNA樣品從初選的引物中經(jīng)過PCR進行復(fù)選，最終挑選出易于區(qū)分、重復(fù)性高的15條引物來統(tǒng)計多態(tài)性。篩選出的引物及退火溫度見表2。SCoT-PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，內(nèi)含1×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）緩沖液，2.00 mmol·L－1鎂離子（Mg2＋），0.15 mmol·L－1脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP），0.40 μmol·L－1引物，10.00 ng模板，1×16.67 nkat TaqDNA聚合酶（1 U＝16.67 nkat）。擴增程序為預(yù)變性94℃，3 min；變性94℃，50 s，退火50 s，延伸72℃，100 s，共40個循環(huán)；再延伸72℃，5 min；最后4℃保存。各取PCR擴增產(chǎn)物5 μL，加1 μL 6×DNA上樣緩沖液混勻后，在質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，緩沖系統(tǒng)為1×TAE，電壓150 V當(dāng)溴酚藍指示劑距離瓊脂糖凝膠前沿約2～3 cm時停止電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、照相并記錄。

表2 篩選出的SCoT引物序列及退火溫度Table 2 Sequence of reliable SCoT primers and the annealing temperature

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，對清晰且易于辨認的條帶根據(jù)其遷移率及有無，統(tǒng)計所有的二元數(shù)據(jù)，有帶（顯性）記為1，無帶（隱性）記為0，從而形成SCoT標(biāo)記的0，1二維數(shù)字矩陣。利用POPGENE 32軟件計算19份黃精種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離，利用NTsys-pc 2.1計算各黃精種源間Nei’s遺傳相似性系數(shù)，按非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）建立各樣品間親緣關(guān)系的聚類圖。用NTsys-pc 2.1軟件將遺傳相似系數(shù)進行Dcenter數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，求其特征量和特征向量，生成主坐標(biāo)三維圖，進行主坐標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精DNA提取結(jié)果分析

采集黃精新鮮葉片結(jié)合改良的CTAB法提取的基因組DNA純度較好，在電泳圖上看出：沒有蛋白質(zhì)和核糖核酸（RNA）的污染，沒有拖尾和降解的現(xiàn)象，紫外分光光度法檢測的DNA質(zhì)量濃度為100.00～900.00 mg·L－1，D（260）/D（280）的比值為1.8～2.0，符合后續(xù)PCR的要求。

2.2 SCoT-PCR擴增分析

15個SCoT引物進行19個黃精樣品擴增總共得到500個條帶，平均每個引物產(chǎn)生33.3個條帶，其中多態(tài)性條帶498個，多態(tài)性比率為99.6%。條帶大小為250～3 000 bp不等（圖1）。

2.3 聚類分析

擴增結(jié)果用NTsys-pc 2.1軟件進行聚類分析得圖2。在遺傳系數(shù)為0.6的水平上，供試樣品被分成兩大類（Ⅰ和Ⅱ），其中Ⅰ類又分為5組：①組包含6份材料，除5號來源于浙江金華，其他都來源于浙

江麗水，這些黃精親緣性最近；②組均來源于浙江麗水；來自湖北赤壁的10號、來自安徽青陽的15號、來自浙江杭州的16號和來自浙江湖州的17號聚為③組，其中16號和17號相似性系數(shù)最高，達到了0.73，位于整個聚類圖的最基部；來自浙江紹興的18號和來自云南漾濞的19號（滇黃精）聚為④組；⑤組包括4個種源地的黃精，11號與12號比較接近，13號與14號比較接近。Ⅱ類僅包括1組，采集于遼寧的9號（黃精）單獨聚為一類，與其他供試樣品的親緣關(guān)系最遠。

圖1 19份黃精材料的SP3引物SCoT-PCR擴增結(jié)果Figure 1 SCoT-PCR amplification results in 19 Polygonatum samples by primer SP3

圖2 19份黃精種質(zhì)的SCoT聚類圖Figure 2 UPGMA dendrogram of 19 Polygonatum germplasms based on SCoT marker

2.4 遺傳距離與遺傳相似性分析

遺傳距離是顯性基因頻率的函數(shù)，能判斷種源間遺傳關(guān)系的遠近。通過種源間的遺傳相似度和遺傳距離（表3），可以定量分析種源之間的相似性。從SCoT的分析結(jié)果來看，19個黃精種質(zhì)的遺傳相似性范圍為0.554 0～0.734 0，遺傳距離范圍為0.309 2～0.590 6；其中16號浙江杭州的多花黃精與17號浙江湖州的多花黃精遺傳距離最近，相似度最高；9號遼寧的黃精與18號浙江紹興的多花黃精遺傳距離最遠，相似度最低。

2.5 主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）

利用19份黃精種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)進行主坐標(biāo)分析，繪制三維散點圖（圖3）。位置近表示親緣關(guān)系比較接近，位置遠表示親緣關(guān)系比較遠。從主坐標(biāo)圖可以看出：19份種質(zhì)被分為6組，第1組為1號、2號、3號、4號、5號、6號，來源于浙江麗水與浙江金華的黃精種質(zhì)，位于主坐標(biāo)軸的最右側(cè)。第2組為7號、8號，分別來源于浙江麗水縉云和浙江麗水景寧的黃精種質(zhì)；第3組為10號、15號、16號、17號，分別來源于湖北赤壁、安徽青陽、浙江杭州、浙江湖州的黃精種質(zhì)；第4組為18號和19號，分別來源于浙江紹興和云南漾濞；第5組為11號、12號、13號、14號，分別來源于浙江麗水、

浙江衢州、浙江臺州、浙江溫州；第6組為9號，來源于遼寧的黃精種質(zhì)。其中第6組與第1組、第5組距離相對較遠，與第5組相對來說最近。比較主坐標(biāo)分析結(jié)果與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果可以看出2種方法反映出的遺傳關(guān)系基本一致，但主坐標(biāo)分析可以從不同方向不同層面更加直觀地顯示各種質(zhì)間的關(guān)系。

表3 19份黃精種質(zhì)的遺傳相似度與遺傳距離Table 3 Genetic similarity and distance of 19 Polygonatum germplasms

3 討論

圖3 19份黃精種質(zhì)的SCoT標(biāo)記主坐標(biāo)分析圖Figure 3 PCoA of 19 Polygonatum germplasms based on SCoT marker

黃精為多基原藥用植物，由于各類群間性狀交叉，地理分布區(qū)重疊，黃精屬的分類一直存在爭議，種間分類仍不明確。BAKER［1］根據(jù)葉序?qū)ⅫS精屬分為互生葉類（Alternifolia），輪生葉類（Verticillata）和對

生葉類（Oppositifolia），但從中國的大量資料來看，葉序這個性狀并不十分穩(wěn)定，在同一個種內(nèi)就有變化。研究結(jié)果表明：9號來自遼寧的黃精為輪生葉，葉片呈線性，根莖形態(tài)也與其他黃精有明顯的區(qū)別，單獨聚為一類，與其他的藥用黃精的相似性僅為0.6；這也可能與地理距離較遠有一定的關(guān)系。19號來自云南的滇黃精為輪生葉序，親緣關(guān)系與互生葉序的多花黃精無明顯差異；聚類分析顯示與18號來自浙江紹興的多花黃精相似性較高，聚為一類，這也印證了吳世安等［20］認為黃精屬仍處在比較活躍的分化期的觀點，需要用其他的方法進一步的研究。在分子水平對黃精開展的相關(guān)研究很少，僅有ISSR，RAPD，RFLP分子標(biāo)記研究黃精的系統(tǒng)位置和鑒定的報道［4－5,20］。著者建立SCoT分子標(biāo)記方法并應(yīng)用于黃精的遺傳多樣性研究，為黃精的種源鑒定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

對多態(tài)性條帶分析表明：15個SCoT引物進行19個黃精樣品擴增總共得到500個條帶，平均每個引物產(chǎn)生33.3個條帶，其中多態(tài)性條帶498個，多態(tài)性比率為99.6%，從中可以看出：黃精種質(zhì)的遺傳多樣性豐富。樣品間UPGMA聚類分析的相似系數(shù)范圍為0.600 0～0.730 0，也可以得出黃精種質(zhì)存在較豐富的遺傳多樣性，親緣關(guān)系較遠。來自湖北赤壁的10號、來自安徽青陽的15號與浙江杭州的16號、浙江湖州的17號，這些地理距離較遠的黃精聚為一類，表明基于SCoT標(biāo)記的黃精聚類分析沒有地理相關(guān)性，其原因可能與黃精的適宜栽植地區(qū)廣泛，遺傳變異較大有關(guān)系。

要全面了解黃精類群的分類及變異規(guī)律，還需要進一步收集種源，建立更為有效的分子標(biāo)記或新方法對黃精遺傳多樣性的變異大小、時空分布等從遺傳學(xué)基礎(chǔ)上進行系統(tǒng)的剖析，才能真正揭示該類群的遺傳多樣性，為合理地制訂引種馴化及良種遺傳改良策略提供理論支持，為黃精藥材的規(guī)范化栽培提供佐證，為保護資源并可持續(xù)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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Genetic diversity of Polygonatum germplasm

LIU Yuejun1,2,ZHANG Yuan1,JIANG Yanfeng2,LIU Jingjing1
（1.The Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Lishui Institute of Forestry Sciences,Lishui 323000,Zhejiang,China）

To explore the genetic diversity and relationship of germplasm resources of polygonati rhizoma（derived from Polygonatum cyrtonema and P.sibiricum）,the Start Codon Targeted（SCoT）molecular marker technique was established,and the unweighted pair-group method with arithmetic means （UPGMA）and principal coordinates analysis （PCoA）were used to study the genetic diversity of 19 Polygonatum provenances followed by a cluster analysis.Fifteen SCoT primers were eventually screened from 29 primers and then used to amplify the genome DNAs.Results showed a total of 500 SCoT loci were produced with 33.3 SCoT loci per primer including 498 polymorphic loci having a polymorphism rate of 99.6%.The genetic similarity coefficients were between 0.554 0-0.734 0,and the cluster analysis showed that Polygonatum germplasm from different sources had abundant genetic diversity.Thus,SCoT molecular markers could provide some basis for classification and identification of Polygonatum with this research laying a foundation for quicker breeding of varieties and sustainable use of Polygonatum resources.［Ch,3 fig.3 tab.20 ref.］

Chinese herbology;Polygonatum;ScoT;germplasm resources;cluster analysis;genetic diversity

S759.82

A

2095-0756（2016）06-1085-07

2015-05-27；

2016-02-21

浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目（2012C22096）

劉躍鈞，教授級高級工程師，從事藥食兩用植物開發(fā)利用研究。E-mail：77735245@qq.com。通信

作者：劉京晶，講師，博士，從事中藥材質(zhì)量評價及品種選育研究。E-mail：jing_jing_6@163.com

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.023

黃精屬Polygonatum是百合科Liliaceae的多年生草本植物，廣布于北溫帶。《中國植物志》記載全世界約有黃精屬植物40種，中國有31種［1］。中藥材黃精來源于黃精Polygonatum sibiricum，多花黃精P. cyrtonema或滇黃精P.kingianum的干燥根莖，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎等傳統(tǒng)功效［2］。黃精藥食同源，用途非常廣泛，可作為臨床配方、中成藥生產(chǎn)、保健食品配伍及藥膳原料使用。由于市場需求量的增加、資源蘊藏量的減少等原因，黃精價格逐漸上漲，但其引種馴化、豐產(chǎn)栽培技術(shù)的研究與應(yīng)用

尚處于初級階段，市場上藥材仍主要來源于野生［3］。近年來，黃精屬植物在分子生物學(xué)方面的研究主要圍繞屬下物種的鑒定，周曄等［4］采用簡單重復(fù)序列區(qū)間分子標(biāo)記（inter-simple sequence repeat，ISSR）鑒定黃精與卷葉黃精Polygonatum cirrhifolium，周曄等［5－6］、朱艷等［7］采用隨機擴增多態(tài)性DNA分子標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RADP）鑒定黃精屬部分藥用植物。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記（start codon targeted polymorphism，SCoT）是一種基于單引物擴增反應(yīng)的新型DNA分子標(biāo)記，具有引物通用性高、實驗操作方便、重復(fù)性好、多態(tài)性高、可獲豐富的遺傳信息、能產(chǎn)生與性狀聯(lián)系的標(biāo)記等優(yōu)點，有效補充了ISSR和RAPD的不足［8］。SCoT分子標(biāo)記已經(jīng)被成功應(yīng)用于多種農(nóng)作物、花卉等遺傳多樣性研究，如水稻Oryza sativa，花生Arachis hypogaea，柑橘Citrus reticulata，龍眼Dimocarpus longan，甘蔗Saccharum officinarum，牡丹Paeonia suffruticosa，石蒜Lycoris radiate，菊花Chrysanthemum morifolium等［8－15］，近幾年，藥用植物玄參Scrophularia ningpoensis，桃兒七Sinopodophyllum emodi，鐵皮石斛Dendrobium officinale等也開展了相關(guān)研究［16－18］，但在中藥黃精基原植物的遺傳多樣性以及種質(zhì)鑒定等方面未見報道。本研究通過種質(zhì)資源收集與評價，為黃精的種源篩選、品種選育及中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）栽培提供研究基礎(chǔ)，為黃精資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。