樹突狀細(xì)胞疫苗聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療用于預(yù)防結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床療效觀察

牛靜秀，張利紅，李佳麗，朱　慧，龐　雁，李維廉

樹突狀細(xì)胞疫苗聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療用于預(yù)防結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床療效觀察

牛靜秀1，張利紅2，李佳麗1，朱慧1，龐雁1，李維廉1

目的：評(píng)價(jià)樹突狀細(xì)胞(DC)疫苗聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)用于預(yù)防結(jié)直腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的臨床療效。方法：74例大腸癌術(shù)后患者分為兩組，接受自體免疫細(xì)胞治療設(shè)為I組（24例）；未接受自體免疫細(xì)胞治療為NI組（50例）。記錄I組患者遲發(fā)型過敏皮膚測(cè)試（DTH）和發(fā)熱反應(yīng)情況，并對(duì)兩組患者接受治療前后生活質(zhì)量、無(wú)病生存期（DFS）進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果：24例I組患者中，DTH陽(yáng)性為12/24（50.00%），發(fā)熱反應(yīng)為15/24（62.50%）；卡氏評(píng)分病人生存質(zhì)量改善的在I組為8/24（33.33%）,相比較于NI組（19/50，18.00%）顯著提高（χ2=7.063P=0.029）；Kaplan-Meier法生存期觀察兩組之間DFS，I組比NI組延長(zhǎng)98 d（χ2=4.304P=0.038）結(jié)論：自體免疫細(xì)胞治療早期結(jié)直腸癌,可以提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)復(fù)發(fā)時(shí)間。

結(jié)直腸癌；無(wú)病生存期；樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞

結(jié)腸直腸癌（colorectal cancer,CRC）是世界上最常見的癌癥之一，近年來(lái)呈不斷上升趨勢(shì)，手術(shù)，化療，放療為標(biāo)準(zhǔn)的臨床治療方法[1]。早期CRC患者中，術(shù)后進(jìn)行輔助化療和放療是首選的治療策略，然而，嚴(yán)重的治療副作用及耐藥常常導(dǎo)致治療方案的中斷。自體免疫細(xì)胞治療是一種新興的治療方法[2-3]，因其毒副作用小，具有全身殺傷腫瘤細(xì)胞的作用而受到越來(lái)越多的腫瘤患者的青睞。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)疫苗聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer，CIK)方案是自體免疫細(xì)胞治療的重要部分，治療通過建立一個(gè)有效和特異性免疫反應(yīng)，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)最大限度地減少毒性，是預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的最有效的手段[4]。

本研究采用回顧性分析的方法，觀察其對(duì)患者生活質(zhì)量、疾病預(yù)后及對(duì)以影像學(xué)表現(xiàn)確定患者無(wú)病生存率（disease-free survival,DFS）作為終點(diǎn)指標(biāo)，評(píng)價(jià)DC-CIK治療早期術(shù)后結(jié)直腸癌的臨床療效。

1　資料與方法

1.1一般資料從2012年1月1日—2014年1月1日期間在本院接受CRC根治性手術(shù)治療的患者，建立病例檔案，進(jìn)行DFS的隨訪與研究。隨訪開始于術(shù)后3周?；颊呙堪肽曜鲆淮闻枨籆T檢查，第一次CT檢查發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶被認(rèn)為有腫瘤復(fù)發(fā)，該次CT檢查距離手術(shù)的時(shí)間定義為DFS。74例CRC術(shù)后患者被納入研究，男性47例，女性27例；平均年齡（62.88±11.04）歲（范圍38～81歲）。原發(fā)腫瘤部位結(jié)腸27例和直腸47例。分化程度：高分化：14例，中分化38例，低分化22例。Dukes分期B期25例，C期49例。P＞0.05，隨機(jī)分組均衡，兩組間具有可比性(見表1)。

表1　病人的一般資料

1.2入組條件 （1）CRC手術(shù)患者，術(shù)后予輔助化療的B期和C期患者。（2）心、肝、腎功能和骨髓造血系統(tǒng)及凝血系統(tǒng)功能基本正常。（3）年齡在18歲～90歲(含18，90歲)，男女不限。（4）既往未做過DC-CIK治療。（5）病人愿意接受本方案治療，自愿簽署知情同意書，能按醫(yī)囑堅(jiān)持用藥，依從性好者，能接受醫(yī)生的隨訪。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1分組方法本研究為臨床回顧性對(duì)照隊(duì)列研究。病例為我院同期住院的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的CRC術(shù)后病人，截止于2015年1月1日，共計(jì)復(fù)發(fā)74例，按照隨訪期間是否接受DC-CIK自體免疫細(xì)胞治療分為實(shí)驗(yàn)組（I組）和對(duì)照組（NI組）。

I組：接受單純自體免疫細(xì)胞治療，入選病例總計(jì)24例。NI組：未接受自體免疫細(xì)胞治療，入選病例總計(jì)50例。

1.3.2儀器和耗材B600-A型低速離心機(jī)，白洋離心機(jī)廠；高速冷凍離心機(jī)5810R，德國(guó)effendorf；血細(xì)胞分離機(jī)，德國(guó)Fresenius；CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、生物安全柜、-80℃超低溫冰箱，美國(guó)Thermo；生物倒置顯微鏡，德國(guó)leica。

1.3.3細(xì)胞制備[5-6]取大腸癌細(xì)胞系Sw480，經(jīng)過機(jī)械分離得到的單細(xì)胞懸浮液，在心電圖的監(jiān)測(cè)下，在超聲和離心（600 g，30 min）后，上清液用作致敏DCs和DTH測(cè)試。使用KABI系統(tǒng)獲得單核細(xì)胞，并對(duì)去除白細(xì)胞的單細(xì)胞進(jìn)行濃縮分離和培養(yǎng)。非貼壁細(xì)胞在添加有IFNγ、CD3單克隆抗體、IL-2、IL-1和自體血清的環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)10 d，形成CIK細(xì)胞。貼壁細(xì)胞在添加有GM-CSF、IL-4、腫瘤裂解液和TNF的環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)7 d，得到DC疫苗。細(xì)菌，真菌檢測(cè)，內(nèi)毒素檢測(cè)合格后，備用。

1.3.4細(xì)胞治療方案[7]采用DC-CIK聯(lián)合自體免疫細(xì)胞治療方案，詳見表2。

1.4療效評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1遲發(fā)型過敏皮膚測(cè)試（delayed type hypersensitivity skin test,DTH）DTH是由致敏CD4 Th1和CD8CTL淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的，表現(xiàn)為以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞變性、壞死為特征的超敏反應(yīng)性炎癥。該反應(yīng)發(fā)生遲緩，一般在接觸抗原18～24 h后出現(xiàn)，48～72 h達(dá)高峰，是DC疫苗和聯(lián)合CIK細(xì)胞治療癌癥患者的免疫反應(yīng)臨床指標(biāo)。整個(gè)自體免疫細(xì)胞治療完成1周后將結(jié)腸癌細(xì)胞系裂解物(40 μg/0.1 mL)于患者前臂皮下注射進(jìn)行測(cè)試，觀察24 h內(nèi)患者皮丘清晰度直徑。DTH的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：強(qiáng)陽(yáng)性：48 h后＞10 mm；陽(yáng)性：5～10 mm；弱陽(yáng)性：2～5 mm；陰性：＜2 mm。

表2　細(xì)胞治療方案

1.4.2發(fā)熱反應(yīng)治療過程中發(fā)生的發(fā)熱反應(yīng)被分級(jí)詳細(xì)記錄。共分為四級(jí)：高熱、中熱、低熱、不發(fā)熱。

1.4.3生活質(zhì)量(KPS分級(jí))： 治療過程中，KPS變化劃分為三個(gè)等級(jí)：提高、穩(wěn)定、惡化，劃分標(biāo)準(zhǔn)如下：提高：治療后比治療前提高10分以上(包括10分)；穩(wěn)定：治療后比治療前提高10分以下；惡化：治療后比治療前下降10分(包括10分)。

1.4.4生存期觀察患者的DFS及不同時(shí)間復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5病人隨訪⑴對(duì)入組的CRC患者進(jìn)行了無(wú)進(jìn)展生存期的統(tǒng)計(jì)分析，隨訪開始于術(shù)后3周，2015年1月1日隨訪結(jié)束。每半年做一次盆腔CT檢查，第一次CT檢查發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶的被認(rèn)為有腫瘤復(fù)發(fā)。⑵DFS定義為術(shù)后第一次CT檢查發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶到手術(shù)日期的時(shí)間。⑶應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Kaplan-Meier法估算DFS曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法自行編制EPIDATA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)采集與記錄，通過數(shù)據(jù)導(dǎo)出，與SPSS19.0軟件對(duì)接，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，卡方檢驗(yàn)；組間計(jì)量資料采用方差分析。

2　結(jié)果

2.1免疫反應(yīng)(DTH結(jié)果)試驗(yàn)組DTH陰性率人數(shù)為12人，占總?cè)藬?shù)的50.00%，陽(yáng)性人數(shù)為12人，占總?cè)藬?shù)的50.00%(見表3)。

表3 試驗(yàn)組DTH的結(jié)果（n=24）

2.2發(fā)熱反應(yīng)I組患者主要的不良反應(yīng)為發(fā)熱，高熱4例，中熱7例，低熱4例，無(wú)發(fā)熱：9例，發(fā)熱比：62.50%。其中除1例外，發(fā)熱患者以物理降溫、口服解熱鎮(zhèn)痛類藥物處理后，均可退熱。1例高熱患者，肌肉注射地塞米松后24 h內(nèi)體溫也可恢復(fù)至正常水平(見表4)。

表4　I組發(fā)熱反應(yīng)結(jié)果（n=24）

2.3生活質(zhì)量KPS評(píng)分KPS評(píng)分I組和NI組分別在入組時(shí)和出組時(shí)按照KPS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。I組與NI組組間比較：χ2=7.063，P=0.029，說(shuō)明單純自體免疫細(xì)胞治療治療KPS評(píng)分優(yōu)于未進(jìn)行腫瘤對(duì)癥治療的患者(見表5)。

表5　I組與NI組KPS評(píng)分比較

2.4生存期96例CRC患者術(shù)后CT隨訪，I組（298 d）與NI組（200 d）相比DFS延長(zhǎng)98 d（χ2= 4.304,P=0.038）且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖1）。

3　討論

隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程技術(shù)等專業(yè)的迅速發(fā)展，惡性腫瘤的免疫治療迎來(lái)了新的轉(zhuǎn)機(jī)。DC-CIK腫瘤免疫治療在相關(guān)領(lǐng)域的地位與角色越來(lái)越受到重視。DC-CIK自體免疫細(xì)胞治療是一種新興的安全的治療腫瘤的手段[8]。DC-CIK細(xì)胞療法能激活病人自身的免疫系統(tǒng)從而對(duì)抗癌癥、提高機(jī)體免疫能力、改善生活質(zhì)量、延緩腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展時(shí)間[9-10]。自體細(xì)胞免疫療法，是一種個(gè)體化治療方法，利用病人自身的抗腫瘤免疫細(xì)胞去殺傷腫瘤細(xì)胞。DC是一種起抗原呈遞作用的免疫細(xì)胞，能激活CD4+輔助T淋巴細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。以DC為基礎(chǔ)的自體細(xì)胞免疫治療方法，可以捕獲、放大，并遞呈腫瘤特異性抗原，產(chǎn)生具有殺傷腫瘤細(xì)胞能力的T淋巴細(xì)胞[11]。DC疫苗治療作為腫瘤的主動(dòng)免疫治療方法，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于多種惡性腫瘤的臨床治療。而CIK細(xì)胞是一類異質(zhì)性細(xì)胞既表達(dá)T細(xì)胞免疫表型的CD3也表達(dá)NK細(xì)胞免疫表型的CD56，作為被動(dòng)免疫治療方法，CIK細(xì)胞在臨床研究中表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒素活性，在DC誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫中起到非常重要的作用。實(shí)際上，晚期腫瘤患者通常隨著腫瘤的進(jìn)展以及放化療的的毒副作用的不斷積累，病人的身體狀況會(huì)不斷惡化，單獨(dú)的DC很難在病人身體中誘導(dǎo)出足夠的殺傷性免疫細(xì)胞。

圖5　I組比NI組DFS曲線比較

DTH是體內(nèi)評(píng)價(jià)患者免疫功能的經(jīng)典方法，該方法簡(jiǎn)單易行、花費(fèi)少且效率高，現(xiàn)已成為評(píng)價(jià)自體免疫細(xì)胞治療的公認(rèn)方法[7]。DTH的陽(yáng)性表明DC疫苗與CIK細(xì)胞回輸?shù)饺梭w后激活了患者的免疫系統(tǒng)，24例早期大腸癌復(fù)發(fā)患者DC疫苗聯(lián)合CIK細(xì)胞治療在全部治療結(jié)束后一周進(jìn)行DTH皮膚測(cè)試顯示，50.00%的患者可見在治療中免疫反應(yīng)被激活。隨著機(jī)體免疫水平的提高，能帶來(lái)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷，表現(xiàn)出病人的生活質(zhì)量有所改善，本文結(jié)果顯示74例病人中試驗(yàn)組I與對(duì)照組NI相比較，兩組穩(wěn)定或改善的人數(shù)比例分別為83.33%和70.00%，組間比較：χ2=7.063，P=0.029，P＜0.05，說(shuō)明自體免疫細(xì)胞治療組KPS評(píng)分優(yōu)于未進(jìn)行腫瘤對(duì)癥治療的患者。

DCs與CIK聯(lián)合治療癌癥的最大的特點(diǎn)是在治療過程中沒有放療或化療中出現(xiàn)的骨髓抑制。惡心嘔吐等嚴(yán)重副作用[12-13]。臨床中以發(fā)熱和皮疹較為多見，本試驗(yàn)中，24例患者治療過程中均無(wú)皮疹現(xiàn)象出現(xiàn)，但發(fā)熱率達(dá)62.50%。其中除1例外，發(fā)熱患者以物理降溫、口服解熱鎮(zhèn)痛類藥物處理后，均可退熱。1例高熱患者，肌肉注射地塞米松后24 h內(nèi)體溫也可恢復(fù)至正常水平。因此，該治療方案通常有著病人很好的配合度，展示了良好的臨床應(yīng)用價(jià)值[14-15]。

此外，大腸癌早期患者術(shù)后行DC-CIK自體免疫細(xì)胞治療可延長(zhǎng)復(fù)發(fā)周期，兩組平均復(fù)發(fā)時(shí)間分別為298 d與200 d，試驗(yàn)組DFS延長(zhǎng)98 d，組間比較，χ2=4.304，P=0.038，P＜0.05，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，DC疫苗與CIK細(xì)胞注射到人體后，可以激活患者自身的免疫系統(tǒng)治療腫瘤。自體免疫細(xì)胞治療安全并有很好的患者依從性。本研究有待進(jìn)一步擴(kuò)增病例數(shù)，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，力求大樣本，多中心，國(guó)際化。

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（收稿：2014-12-20修回：2015-10-26）

（責(zé)任編輯張淑坤屈振亮）

Clinical Effects of Immunotherapy with Dendritic Cell Vaccine and Ctokine-induced Killer Cells in Pre?vention of Recurrence and Metastasis for post-Surgery Colorectal Cancer Patients

NIU Jing-xiu,ZHANG Lihong,LI Jia-li,et al.Tianjin Union Medicine Centre,Tianjin(300121),China

ObjectiveTo evaluate the clinical effects of immunotherapy with dendritic cells(DC)and cyto?kine-induced Killer(CIK)cells on prevention of recurrence and metastasis in post-surgery patients with colorec?tal cancer(CRC).MethodsA total of 74 post-surgery patients with CRC were randomly divided into two groups.24 cases who2=7.063P=0.029）.DFS in group I(298 days)was longer than DFS in group NI(200 days,χ2= 4.304P=0.038).ConclusionImmunotherapy with DC and CIK maybe improve QOL and prolong DFS in post-surgery CRC.

immunotherapy with DC and CIK were defined as group I,50 cases who did not

the immunotherapy were defined as group NI.Delayed type hypersensitivity(DTH)skin test results and fever were abserved in Group I.Quality of life(QOL)and disease-free survival(DFS)were analyzed in both groups.ResultsPositive rates of DTH and fever were 12/24（50.00%）and 8/24（33.33%）respectively in group I.Quality of life(QOL)by Karnofsky in group I was 8/24（33.33%）which was higher than that in group NI（19/ 50，18.00%,χ

Colorectal cancer；disease-free sur?vival；dendritic cells；cytokine-induced killer cells

R735.3

A

1007-6948(2016)02-0112-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.02.002

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（12ZCDZSY17100）

1.天津市人民醫(yī)院腫瘤科（天津 300121）

2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院（天津 300073）

李維廉，E-mail:liweiliancn@126.com