腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與大腸腫瘤的相關(guān)性

付文政，張春澤，賈巖峰

·作者須知·

腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與大腸腫瘤的相關(guān)性

付文政，張春澤，賈巖峰

目的：研究腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與大腸腫瘤的相關(guān)性。方法：選取2014年1月—2015年6月年收治的大腸癌患者31例、大腸腺瘤患者31例及同期健康體檢者（對照組）31例，收集3組糞便標(biāo)本，提取糞便DNA，采用熒光定量PCR對DNA指紋圖譜進(jìn)行測序，比較3組腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果：3組樣本共獲得254 271條高質(zhì)量序列，3組細(xì)菌多樣性指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對照組擬桿菌屬、羅氏菌屬、酸桿菌屬、真桿菌屬、變形菌屬所占比例分別為21.00%,4.10%,2.14%,0.61%, 0.49%高于大腸癌組的14.00%,1.56%,0.79%,0.11%,0.12%和大腸腺瘤組的16.03%,1.62%,0.82%,0.12%,0.14%。大腸癌組紫單胞菌屬、埃希桿菌、腸球菌屬、鏈球菌屬、消化鏈球菌屬所占比例分別為1.75%,2.45%,2.34%,1.19%,0.71%;大腸腺瘤組分別為1.62%,2.32%,2.12%,1.09%,0.69%,均高于對照組的0.09%,0.87%,0.10%,0.45%,0.01%。大腸癌組擬桿菌屬、羅氏菌屬所占比例低于大腸腺瘤組，腸球菌屬、鏈球菌屬所占比例高于大腸腺瘤組熒光定量PCR檢測顯示對照組擬桿菌占總菌相對含量、丁酸鹽產(chǎn)生菌占總菌相對含量為（17.38±3.04）%、（4.38±1.03）%分別高于大腸癌組的（10.85±2.54）%、（1.41±0.89）%與大腸腺瘤組的（12.37±2.05）%、（2.07±1.02）%，大腸癌組含量則少于大腸腺瘤組（P＜0.05）。結(jié)論：人體腸道內(nèi)擬桿菌屬、丁酸鹽產(chǎn)生菌及鏈球菌等條件致病菌的結(jié)構(gòu)失衡，與大腸腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。

腸道菌群；大腸癌；大腸腺瘤；大腸腫瘤

大腸腫瘤是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，患病死亡率在我國居第5位。大腸內(nèi)細(xì)菌眾多，與人類形成一種共生關(guān)系。近年研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)細(xì)菌感染與大腸腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。國外研究證實(shí)，鏈球菌、敗毒梭菌感染可誘發(fā)大腸癌，而腐蝕檸檬酸桿菌感染對大腸腫瘤的發(fā)展起促進(jìn)作用[2]。為了研究腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與大腸腫瘤的相關(guān)性，我們于2014年1月—2015年6月分別對大腸癌、大腸腺瘤及健康體檢者糞便標(biāo)本中的菌群進(jìn)行基因測序，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取大腸癌、大腸腺瘤患者各31例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，并經(jīng)腸鏡及病理學(xué)檢查確診。⑵基本狀況良好，無心、肝、腎及血液系統(tǒng)疾病。⑶未經(jīng)過輔助放化療及手術(shù)治療。⑷簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴病理診斷為非腺瘤性息肉、家族性腺瘤病。⑵近1個月服用過質(zhì)子泵抑制劑、鉍劑、H2受體拮抗劑、抗生素等藥物。⑶妊娠或哺乳期婦女。大腸癌組男21例，女10例；年齡38～65歲，平均（53.5±10.3）歲。大腸腺瘤組男20例，女11例；年齡34～67歲，平均（52.2±11.3）歲。選取同期健康體檢者31例設(shè)為對照組，男21例，女10例；年齡38～66歲，平均（53.8±10.1）歲。3組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2標(biāo)本采集收集大腸癌組、大腸腺瘤組及對照組新鮮大便3 g，存放于高壓滅菌Eppendorff離心管中，-80℃冰箱中冷凍。取0.5 g加入0.1 mol/LPBS 10 mL，振蕩混勻。3000 r/min離心處理5 min,取上清液。重復(fù)操作3次，取1 mL上清液，加入1.5 mL Eppendorff離心管中。12 000 r/min離心處理10 min，棄上清，留沉淀。在沉淀中再加入1 mL上述上清液，重復(fù)操作4次，收集沉淀，置于-20℃冰箱。

1.3DNA提取將收集的沉淀采用磁珠擊打破碎細(xì)胞結(jié)合酚氯仿抽提純化法[4]提取DNA。取50 μL DNA樣品以50 μL TEbuffer做零線對照，采用FLA-5100熒光檢測儀（日本生產(chǎn)）測定。用質(zhì)量體積比為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小及完整性，電泳完成后在紫外線燈下觀察，顯示熒光條帶則表明有DNA存在。

1.416SrRNA基因V3高變區(qū)片段擴(kuò)增和454測序

以DNA樣本為模板進(jìn)行16SrRNA基因V3高變區(qū)片段擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用細(xì)菌通用引物27f(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)和 1492r(5'-GGTT ACC TTG TTAC GAC TT)[5]進(jìn)行DNA指紋圖譜分析。

16SrRNA基因V3高變區(qū)片段擴(kuò)增產(chǎn)物用于454測序分析，引物參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)，PCR反應(yīng)條件嚴(yán)格按照說明書操作。

1.5多變量統(tǒng)計(jì)分析對于454測序得到的OTU豐度矩陣，采用各片段或各OTU在樣本中的豐度為變量，研究樣本的空間分布及與樣本間的關(guān)系。采用主成分分析（PCA）對樣本分布進(jìn)行無偏見觀察，體現(xiàn)數(shù)據(jù)內(nèi)部固有結(jié)構(gòu)；再采用基于UniFrac計(jì)算的主坐標(biāo)分析法（PCoA）對OTU豐度矩陣進(jìn)行分析。對于PCA、PCoA的分析結(jié)果進(jìn)一步做多變量方差分析（MANOVA）以研究不同組樣本之間的差異。PCA和MANOVA分析由Matlab軟件完成，UniFrac分析由在線工具完成。

隨后引入環(huán)境因子對樣本進(jìn)行約束以研究不同疾病狀態(tài)對腸道菌群的影響。以全部OTU在各個樣本中的豐度為變量，以全樣×本部變量豐度的矩陣為研究對象，采用冗余分析（RDA）分析樣本之間的差異。RDA分析中，樣本在排序途中的坐標(biāo)是由環(huán)境因子（解釋變量）的線性組合決定的。RDA分析由Canoco軟件完成。

1.6實(shí)時熒光定量PCR采用MJopticon2型實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增分析儀（美國生產(chǎn)）檢測全部樣品中的細(xì)菌總量、擬桿菌屬細(xì)菌及丁酸鹽產(chǎn)生菌數(shù)量，細(xì)菌總量與擬桿菌屬細(xì)菌數(shù)量由對應(yīng)的16S rRNA基因拷貝數(shù)表示，丁酸鹽產(chǎn)生菌的數(shù)量由丁酰-輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因A拷貝數(shù)表示。細(xì)菌總量引物參考文獻(xiàn)[6]，擬桿菌屬細(xì)菌引物參考文獻(xiàn)[7]，丁酸鹽產(chǎn)生菌引物參考文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)，PCR反應(yīng)條件嚴(yán)格按照說明書操作。用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品重復(fù)做3次反應(yīng)，用于檢測樣品的重復(fù)2次反應(yīng)，PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率由PCR自帶軟件進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，熒光定量PCR結(jié)果采用 LightCycler480數(shù)據(jù)分析軟件測得，計(jì)量資料用(±s)表示，采用F或t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，對樣本序列采用Shannon-wiener多樣性指數(shù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1測序結(jié)果我們提取的部分樣本的基因組DNA電泳圖見下圖1。3組93例樣本共檢測出254 271條高質(zhì)量序列，大腸癌組檢出84 720條序列，大腸腺瘤組檢出86 854條序列，對照組檢出82 697條序列。3組檢出的序列長度170～230 bp。大腸癌組Shannon-wiener多樣性指數(shù)為3.64±0.51，大腸腺瘤組為3.58±0.47，對照組為3.62±0.45。3組細(xì)菌多樣性指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.76，P＞0.05）。

圖1　提取部分樣本的基因組DNA電泳圖

2.2不同菌屬占腸道菌群序列數(shù)比例我們以上述DNA樣本為模板，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因V3高變區(qū)片段，部分樣本電泳結(jié)果見下圖2。對照組擬桿菌屬、羅氏菌屬、酸桿菌屬、真桿菌屬、變形菌屬所占比例高于大腸癌組、大腸腺瘤組（P＜0.05)；大腸癌組、大腸腺瘤組紫單胞菌屬、埃希桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、消化鏈球菌屬所占比例高于對照組(P＜0.05)；大腸癌組、大腸腺瘤組酸桿菌屬、真桿菌屬、變形菌屬、紫單胞菌屬、埃希桿菌屬、消化鏈球菌屬所占比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），大腸癌組擬桿菌屬、羅氏菌屬所占比例低于大腸腺瘤組（P＜0.05），腸球菌屬、鏈球菌屬所占比例高于大腸腺瘤組（P＜0.05），見表1。

圖2　部分樣本PCR擴(kuò)增16SrRNA基因V3高變區(qū)片段結(jié)果電泳圖

2.3熒光定量PCR檢測熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物溶解曲線見下圖3。檢測結(jié)果顯示，3組每ngDNA中總菌16S rRNA基因拷貝數(shù)對數(shù)值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），對照組擬桿菌屬細(xì)菌數(shù)目、丁酸鹽產(chǎn)生菌數(shù)目高于大腸癌組與大腸腺瘤組（P＜0.05）；大腸癌組擬桿菌屬細(xì)菌數(shù)目、丁酸鹽產(chǎn)生菌數(shù)目均少于大腸腺瘤組（P＜0.05），見表2。

圖3　部分樣本Real-Time PCR的擴(kuò)增曲線（A）和產(chǎn)物溶解曲線（B）

3　討論

人類大腸內(nèi)細(xì)菌眾多，尤其是在大便內(nèi)。經(jīng)過代謝交換與食物代謝等方式，腸道內(nèi)的細(xì)菌與宿主具有緊密的代謝合作關(guān)系。一旦腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡，則會導(dǎo)致代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)疾病。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，患有克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎的成人，與患有過敏性腸炎、乳糜腹瀉的嬰幼兒，腸道菌群結(jié)構(gòu)相對健康人群的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了整體失衡現(xiàn)象。這一結(jié)構(gòu)失衡主要表現(xiàn)為有害菌的增多和有益菌的減少。近年研究發(fā)現(xiàn)，部分有害菌對腸道不同階段的腫瘤產(chǎn)生促進(jìn)作用,尤其在慢性感染階段,正常組織會受到有害菌釋放的毒性因子的影響。劉小滿等[10]進(jìn)行的動物研究發(fā)現(xiàn)，腐蝕檸檬酸桿菌感染大鼠可引發(fā)結(jié)腸增生樣改變，這種改變最終會導(dǎo)致結(jié)腸癌。Tahara等[2]在對人體鏈球菌屬抗體的檢查中發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌、大腸腺瘤患者鳥禽類鏈球菌抗體濃度顯著高于健康人群。由此提示，腸道部分菌群的結(jié)構(gòu)變化與大腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究采用16S rRNA基因克隆文庫的方法與454測序方法比較大腸癌、大腸腺瘤患者與健康人群腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，進(jìn)一步研究腸道菌群結(jié)構(gòu)與大腸腫瘤的關(guān)系。3組糞便標(biāo)本檢出的高質(zhì)量序列數(shù)無差異，且細(xì)菌多樣性指數(shù)比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。熒光定量PCR結(jié)果顯示，3組每ngDNA中總菌16S rRNA基因拷貝數(shù)對數(shù)值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。由此可知，大腸腫瘤患者，腸道菌群結(jié)構(gòu)改變并不是有益菌的絕對滅失與有害菌的絕對增長，而是有益菌的減少和有害菌的增加。這與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[1,3]基本相符。

對3組糞便標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)大腸腫瘤患者腸道菌群變化最顯著的特征，是擬桿菌屬與丁酸鹽產(chǎn)生菌的減少。3組每ngDNA中總菌16S rRNA基因拷貝數(shù)對數(shù)值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但對照組擬桿菌屬細(xì)菌數(shù)目、丁酸鹽產(chǎn)生菌數(shù)目高于大腸癌組與大腸腺瘤組（P＜0.05）。擬桿菌屬對宿主代謝、營養(yǎng)和健康都發(fā)揮重要作用。吳瑞麗等[11]對潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行ERIC-PCR指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者擬桿菌屬數(shù)目為（2.90±1.95）×103，而對照組為（4.13±2.62）×103。本研究中，大腸癌組、大腸腺瘤組擬桿菌屬序列所占比例低于對照組（P＜0.05）,且大腸癌組擬桿菌屬序列所占的比例低于大腸腺瘤組（P＜0.05）。由此提示，大腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能與擬桿菌屬減少有關(guān)。而與擬桿菌屬同屬于擬桿菌門的紫單胞菌屬，卻對大腸的疾病產(chǎn)生不同的影響。Yamamoto等[7]進(jìn)行的動物研究發(fā)現(xiàn)，一種能產(chǎn)腸毒素的紫單胞菌，在小鼠腸道內(nèi)定植可引發(fā)腸道組織損傷，誘導(dǎo)白介素-17的產(chǎn)生，并激活轉(zhuǎn)錄因子3，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的形成。本研究中，大腸癌組、大腸腺瘤組紫單胞菌序列所占比例顯著高于對照組（P＜0.01)，但大腸癌組、大腸腺瘤組紫單胞菌序列所占比例差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其原因有待進(jìn)一步研究。

表1　3組不同菌屬占腸道菌群序列數(shù)比例（n，%）

表2　3組擬桿菌屬細(xì)菌、丁酸鹽產(chǎn)生菌數(shù)目比較(±s)

表2　3組擬桿菌屬細(xì)菌、丁酸鹽產(chǎn)生菌數(shù)目比較(±s)

注：大腸癌組與對照組比較，aP＜0.05；與大腸腺瘤組比較，bP＜0.05

每ngDNA中總菌16S rRNA基因拷貝數(shù)對數(shù)值每ngDNA中擬桿菌16S rRNA基因拷貝數(shù)對數(shù)值每ngDNA丁酰-輔酶A基因拷貝數(shù)對數(shù)值擬桿菌占總菌相對含量（%）丁酸鹽產(chǎn)生菌占總菌相對含量（%）大腸癌組7.76±2.13 6.14±1.56 5.34±2.06 10.85±2.54a、b 1.41±0.89a、b大腸腺瘤組7.92±2.43 6.42±1.65 5.52±1.75 12.37±2.05a 2.07±1.02a對照組8.15±2.04 7.39±1.34 6.88±1.48 17.38±3.04 4.38±1.03 F值1.03 3.78 3.69 12.34 6.45 P值＞0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

丁酸鹽產(chǎn)生菌對于腸道健康具有重要意義，能為細(xì)胞呼吸提供能量，保持腸道上皮完整性，調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答[8]。丁酸鹽產(chǎn)生菌的代表菌種是羅氏菌屬。本研究中，大腸癌組、大腸腺瘤組羅氏菌屬序列數(shù)所占比例低于對照組（P＜0.05)，且大腸癌組羅氏菌屬序列所占比例低于大腸腺瘤組（P＜0.05）。與我們研究結(jié)果相似的是，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在腸道疾病患者腸道菌群中也發(fā)生丁酸鹽產(chǎn)生菌減少現(xiàn)象。J Abell等[12]發(fā)現(xiàn)，在炎癥性腸炎、克羅恩病、大腸癌患者腸道菌群中，一些丁酸鹽產(chǎn)生菌如羅氏菌屬、直腸真桿菌減少。Kawano等[13]研究還發(fā)現(xiàn)，部分因服用抗生素所引發(fā)的腸炎、腹瀉的患者腸道菌群中，羅氏菌群完全消失。由此可知，大腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能與部分丁酸鹽產(chǎn)生菌減少有關(guān)。

臨床對于細(xì)菌在大腸腫瘤發(fā)病過程中的影響存在“致癌作用假說”，其機(jī)制包括條件致病菌導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，進(jìn)而產(chǎn)生導(dǎo)致突變的毒性作用而誘發(fā)腫瘤。國內(nèi)外研究也發(fā)現(xiàn)，多數(shù)大腸癌、大腸腺瘤的發(fā)生、發(fā)展都伴隨有腸道炎癥的發(fā)生。埃希桿菌、腸球菌屬、鏈球菌屬等是臨床常見的條件致病菌[14-15]。本研究中，大腸癌組、大腸腺瘤組埃希桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬序列數(shù)所占比例高于對照組(P＜0.05)，且大腸癌組腸球菌屬、鏈球菌屬序列數(shù)所占比例高于大腸腺瘤組（P＜0.05）。董開芯等[1]進(jìn)行的動物研究發(fā)現(xiàn)，腸球菌與鏈球菌都能通過促進(jìn)白介素8分泌及細(xì)胞分裂來加速癌前病變的進(jìn)程。Tahara等[2]進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)也表明，鏈球菌屬細(xì)胞壁所分泌的抗原能通過過量表達(dá)環(huán)加氧酶2而促進(jìn)人體結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞系的癌變。由此可知，大腸腫瘤的發(fā)生與腸道內(nèi)條件致病菌的增加有關(guān)。

總之，人體腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)失衡與大腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；擬桿菌屬、丁酸鹽產(chǎn)生菌及鏈球菌等條件致病菌的結(jié)構(gòu)變化，是大腸腫瘤發(fā)生的警示。對這類人群通過針對性的腸道菌群結(jié)構(gòu)優(yōu)化，減輕菌群變化對宿主的影響，將有助于減少大腸腫瘤的發(fā)生。

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（收稿：2015-10-06修回：2016-02-10）

（責(zé)任編輯劉洪斌屈振亮）

Relationship of Microbial Community Structure in Intestine with Colorectal Cancer

FU Wen-zheng, ZHANG Chun-ze,JIA Yan-fengDeptment of Anorectal Surgery,Tianjin Peoples′Hospital,Tianjin(300121), China

ObjectiveTo study the relationship ofmicrobial community structure in the intestine with colorectal cancer.MethodsStool specimens were collected in 31 patients with colorectal cancer and 31 pa?tients with colorectal adenoma and 31 cases of healthy volunteers from Janurary 2014 to June 2015.Fecal DNA was extracted with fluorescence quantitative PCR for sequencing DNA fingerprinting to compare differences in gut microflora among the three groups.ResultsTotally 254 271 high quality arrays were obtained from the 3 specimen groups,and no statistical differences were found among the 3 groups of multiple polyindices(P＞0.05). Proportions of bacteroides genus,Roche genus,acid bacillus,bacillus genera and deformation bacteria in control group were respectively 21.00%,4.10%,2.14%,0.61%and 0.49%,higher than those in colorectal cancer group (14.00%,1.56%,0.79%,0.11%,0.12%and 16.03%)and in coloretal adenomas group(16.03%,1.62%,0.82%, 0.12%,0.14%).Proportions of purple aneromonas spp,escherichia coli,enterococcus,streptococcus and pepto?streptococcus in colorectal cancer group were 1.75%,2.45%,2.34%,1.19%and 0.17%respectively.But for colorectal adenomas group,proportions of these bacteria were 1.62%,2.32%,2.12%,1.09%and 0.69%,respec?tively.Proportions of these bacteria in above two group were higher than those in control group(they were 0.09%,0.87%,0.10%,0.45%and 0.01%,respectively).Proportions of bacteroides and Roche genus in colorectal group were lower than those in colorectal adenomas group,but for proportions of enterococcus and streptococcus, higher than those in colorectal group.Fluorescence quantitative PCR detection showed that bacteroides relative content and butyric acid salt producing bacteria relative content in control group were(17.38±3.04)%and (4.38±1.03)%,higher than those in colorectal cancer group[(10.85±2.54)%,(1.41±0.89)%]and colorectal ade?nomas group[(12.37±2.05)%,(2.07±1.02)%].ConclusionStructural imbalance of gut bacteroides,butyr?ate-producing bacteria and opportunistic pathogens Streptococcus is closely related to the occurrence of colorec? tal cancer.

Intestinal flora;colorectal cancer; colorectal adenoma;colon tumor

R735.3+4

A

1007-6948(2016)02-0120-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.02.004

天津市衛(wèi)生計(jì)生委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（10KG206）

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付文政，Email:doctor.fwz@gmail.com