趙小霞，邱麗君，宣成睿，孫鵬，周楊，周玥，楊麗敏,

螺旋藻藻藍蛋白亞基的提取和免疫活性研究

趙小霞1，邱麗君1，宣成睿2，孫鵬2，周楊3，周玥3，楊麗敏2,3

目的:探討螺旋藻藻藍蛋白亞基的提取和免疫活性。方法:低溫破壁，離心獲取上清，經(jīng)粗纖維膜過濾后，采用SephadexG-50凝膠過濾提取藻藍蛋白亞基，SDS-PAGE檢測蛋白純度和分子量,經(jīng)紅外光譜技術(shù)和紫外/可見光分光光度計掃描圖譜，檢測其在波長620 nm和280 nm處的吸光度,進一步觀察提取物對小鼠脾臟淋巴細胞的作用。結(jié)果:低溫水提和凝膠過濾層析提取1號和2號提取物,分別為墨綠色和藍色水溶性室溫儲存性狀穩(wěn)定的干粉。1號和2號提取物SDS-PAGE檢測均見一條分子量約17 kDa的蛋白條帶。紅外光譜技術(shù)掃描圖譜可見在1600～1800 cm-1的波長范圍，螺旋藻原粉在1656 cm-1處可見1個吸收峰，1號提取物在1655 cm-1、1633 cm-1、1594 cm-1處可見3個吸收峰，2號提取物在1631 cm-1和1602 cm-1處可見2個吸收峰，殘渣在1658 cm-1處可見1個吸收峰。紫外/可見光分光光度計檢測1號提取物在232.0 nm和617.0 nm波長處有吸收峰，2號提取物在263.5 nm和619.5 nm波長處有吸收峰，1號提取物純度A620/A280為0.78，得率15%，2號提取物純度A620/ A280為0.85，得率20%。提取物能夠促進小鼠脾臟淋巴細胞增殖。結(jié)論:低溫提取藻藍蛋白亞基且具有增強免疫活性。

低溫提?。辉逅{蛋白亞基；免疫活性

螺旋藻是一種絲狀多細胞螺旋形原核藻類生物,含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、葉綠素、B-胡蘿卜素及多糖類物質(zhì),是人類理想的食物及藥物資源。藻藍蛋白是螺旋藻中的重要活性物質(zhì)，其中藻藍蛋白作為天然捕光色素蛋白僅存在于藍藻等少數(shù)藻類中,是一種少見的天然藍色素，具有提高機體免疫力[1-2]、抗氧化[3]、抗炎癥和抑菌[4]、抗癌[5]、預防糖尿病[6]、清除自由基等生理活性，可制成生化藥品，而且可作為天然色素和營養(yǎng)蛋白用于食品和化妝品行業(yè)，利用藻藍蛋白具有強烈熒光的特點,還可將其制備成熒光探針,用于臨床檢驗。藻藍蛋白由α和β兩種亞基組成,天然狀態(tài)下以(αβ)3或(αβ)6等雜聚體形式存在。研究發(fā)現(xiàn)亞基分子量小，細胞滲透性好，具有良好的抗腫瘤活性[7]。

藻藍蛋白的提取方法包括離子交換色譜法、凝膠過濾層析、硫酸銨梯度鹽析、羥基磷灰石、利凡諾沉淀法、膨化床吸附法等方法[8-10]，不同的提取方法對藻藍蛋白的規(guī)?；a(chǎn)、總得率、純度、蛋白活性等均有影響。在藻藍蛋白提取的基礎上進一步采用SepharoseG 75FF層析或SephadexG-75凝膠柱等處理獲取，進而通過β亞基自然降減的方式獲取α亞基[11-12]。本研究擬采用低溫破壁，離心獲取上清，凝膠過濾層析，提取藻藍蛋白α和β亞基的粗提物，并進一步探討其是否有活性，旨在為藻藍蛋白的高價值資源化利用提供新途徑。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑螺旋藻粉購于福建福清市新大澤螺旋藻有限公司；胰酶、Acrylamide、Tris-Cl、TEMED、Con A、MTT購于Sigma公司；APS、SDS、溴酚蘭、β-巰基乙醇、甘油購于上海生工；SephadexG-50購于Amersham公司。

1.1.2儀器GZX-9070MBE電熱恒溫鼓風干燥箱購于上海博訊；LGJ-18冷凍干燥機購于北京松原興華；DZG-303A離子純水機購于美國摩爾；YDL5M離心機購于湘儀離心機廠；TU-1901紫外/可見分光光度計購于北京普析通用有限責任公司；電泳儀和電泳槽購于北京六一公司；酶標儀購于美國thermo公司。

1.2方法

1.2.1藻藍蛋白亞基的提取和純化蒸餾水溶解螺旋藻粉1 kg，放置于-30～-35℃的冰箱中過夜，自然解凍后破碎離心，10 000 r/min，10 min，分離上清液，留取上清，去掉沉渣，經(jīng)粗纖維膜過濾后，采用SephadexG-50凝膠過濾提取藻藍蛋白亞基，進而通過冷凍干燥得到干粉。

1.2.2光譜特征測定將提取物在清華大學分析中心采用紅外光譜技術(shù)進行成分測定，紫外/可見分光光度計對提取物進行掃描。

1.2.3SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-10%PAGE）配制12%分離膠和4%濃縮膠，加樣，樣品中加入等體積的2×Loading buffer，100℃煮沸5 min變性，10 000 r/min，4℃離心1 min，用加樣器吸取各管中的全部上清液加入上樣孔中，恒壓130 V進行電泳，溴酚藍指示直至電泳至凝膠的底部。將凝膠取出用考馬斯亮藍R-250染色30 min，然后搖床脫色至條帶清晰，拍照。

1.2.4純度和得率分析紫外/可見分光光度計測定樣品溶液在620 nm和280 nm處的吸光度，根據(jù)下式計算藻藍蛋白亞基的純度:

螺旋藻提取物純度=A620/A280

螺旋藻提取物得率=藻藍蛋白凍干粉質(zhì)量/螺旋藻原料質(zhì)量×100%

式中:A280和A620分別為波長280 nm和620 nm處的吸光度。

1.2.5提取物對小鼠脾臟單個核細胞的作用脫頸椎處死小鼠，無菌取脾，200目鋼網(wǎng)研磨制成脾細胞懸液，70%Percoll分離單個核細胞，2000 r/min，20 min，吸取灰白層細胞，IMDM洗二次，0.04%臺酚蘭染色計數(shù)，細胞存活率＞90%，調(diào)細胞濃度5×106/mL備用。分別設陰性對照組、Con A陽性對照組、1號提取物、2號提取物實驗組，陰性對照組不加任何刺激物，陽性對照組由5 μg/mL Con A刺激，提取物配置后濾過除菌，實驗組分別由0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/ mL提取物刺激，96孔板培養(yǎng)，三復孔，每孔脾細胞5×105個，總體系200 μL，培養(yǎng)至44 h，摻入MTT，每孔10 μL，4 h后酶標儀測定570 nm A值，結(jié)果用刺激指數(shù)SI表示，刺激指數(shù)SI＝實驗孔A值/對照孔A值。

2　結(jié)果

2.1藻藍蛋白亞基提取物的性狀和分子量采用低溫提取和凝膠過濾層析的方法從螺旋藻粉中提取蛋白，共獲得2部分提取物，分別稱為1號提取物，2號提取物。結(jié)果見圖1，分別為螺旋藻原粉（A）、1號提取物（B）、2號提取物（C）、提取后的殘渣（D），顏色依次為深墨綠色、墨綠色、藍色、黑色,常規(guī)室溫儲存。SDS-PAGE結(jié)果見圖2，1號提取物和2號提取物均見一條分子量約17 kDa的蛋白條帶。

圖1　螺旋藻提取物圖片

圖2 螺旋藻提取物SDS-PAGE電泳掃描圖

2.2螺旋藻提取物光譜掃描采用紅外光譜技術(shù)掃描提取物圖譜（圖3），結(jié)果可見在1600～1800 cm-1的波長范圍，螺旋藻原粉在1656 cm-1處可見1個吸收峰，1號提取物圖譜在1655 cm-1、1633 cm-1、1594 cm-1處可見3個吸收峰，2號提取物圖譜在1631和1602 cm-1處可見2個吸收峰，殘渣圖譜在1658 cm-1處可見1個吸收峰。分別取上述2種提取液，稀釋到合適的倍數(shù)，采用紫外/可見分光光度計在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行波長掃描，結(jié)果見圖4，1號提取物在232.0 nm和617.0 nm波長處有吸收峰，2號提取物在263.5 nm和619.5 nm波長處有吸收峰，1號提取物純度A620/A280為0.78，得率15%，2號提取物純度A620/A280為0.85，得率20%。

2.3提取物誘導小鼠脾臟淋巴細胞增殖為檢測提取的蛋白質(zhì)是否具有活性，采用觀察提取物對小鼠脾臟單個核細胞的作用。不同濃度提取物的刺激結(jié)果可見，陽性對照Con A組SI值為1.84±0.07，實驗組各組小鼠脾臟單個核細胞增殖明顯(P＜0.05或P＜0.01)。提示藻藍蛋白亞基提取物具有促進小鼠脾臟淋巴細胞增殖的作用。見表1。

3　討論

藻膽蛋白主要存在于藍藻、紅藻、隱藻和少數(shù)一些甲藻中,其主要功能是作為光合作用的捕光色素復合體。己知的藻膽蛋白主要可以分為四大類,即藻紅蛋白、藻藍蛋白、藻紅藍蛋白和別藻藍蛋白。藻藍蛋白是一種主要的藻膽蛋白,其提取主要包括破壁和細胞裂解、分離、純化、干燥、產(chǎn)物的特性描述[7]。破壁的物理方法主要有超聲法、負壓空化法、滲透壓沖擊法、凍融法，化學方法主要使用酸、堿、洗滌劑、酶等。不同方法對螺旋藻細胞壁的破壞程度不同，藻藍蛋白溶出量各異，研究報道超聲波破壁技術(shù)處理物料破壁率高，目的物質(zhì)提取效果好，且藻藍蛋白提取率高[10]，但是蛋白的提取工藝中，不僅要提取得率較高的蛋白，而且要保持蛋白的活性，文獻報道，超聲波是機械振動能量的傳播，在這樣激烈振動聲場中,會導致生物體系的功能或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。強超聲波輻照生物體可發(fā)生超聲空化效應,使生物體內(nèi)局部溫度升高至幾千度,將會使蛋白結(jié)構(gòu)受到改變和破壞?？紤]蛋白得率和蛋白活性的保持，以及化學試劑的干擾，所以本研究采用凍融法低溫提取蛋白質(zhì)。蛋白提取物的進一步純化目前有幾種方法，離子交換色譜法、凝膠過濾層析、硫酸銨梯度鹽析、羥基磷灰石、利凡諾沉淀法、膨化床吸附法等方法[8-10]，采用硫酸銨鹽析結(jié)合疏水層析技術(shù)分離純化螺旋藻中的藻藍蛋白，而高鹽可能會導致蛋白的變性。羥基磷灰石分離，操作復雜且成本較高。采用利凡諾沉淀法和膨化床吸附法得到的藻藍蛋白，總得率高，但純度較低，仍需進一步純化。Patil等[13]設計了一個簡單而高效的操作方法,該方法包括兩個步驟:雙水相萃取和離子交換層析，但是在操作中也添加了化學試劑。本研究采用常用分離方法離心沉淀去渣，然后采用凝膠過濾層析方法分離不同分子量的蛋白質(zhì)。紅外光譜技術(shù)測定螺旋藻原粉、1號提取物、2號提取物、殘渣的紅外圖譜對比可見，其在不同波長區(qū)間內(nèi)存在不同程度的差異1600～1800 cm-1波長范圍附近的吸收峰提示存在蛋白質(zhì)，結(jié)果可見螺旋藻原粉與提取物吸收峰在此范圍內(nèi)可見差異，且提取物波數(shù)范圍下的峰面積明顯大于螺旋藻原粉，提示蛋白含量高。研究報道，藻藍蛋白的α亞基和β亞基的分子量分別18.4 kDa和21.3 kDa[14]，也有報道分子量分別15.4 kDa和17.3 kDa[10]，也有報道為16 kDa和17 kDa[15]，而本研究獲得的1號提取物和2號提取物都僅有一條帶，且分子量均約17 kDa，這與文獻報道[15]的α亞基和β亞基的分子量分別16 kDa和17 kDa的大小相一致，但本研究1號提取物和2號提取物SDS-PAGE結(jié)果是分子量同樣大小的一條條帶，這與文獻報道[15]的藻藍蛋白有兩個亞基，SDS-PAGE結(jié)果會有兩條條帶的結(jié)果不符，可能在本研究中分別提取了藻藍蛋白的兩個亞基。文獻報道主要幾種藻膽蛋白的吸收光譜是不同的,進一步采用紫外/可見光分光光度計掃描提取物的圖譜發(fā)現(xiàn)1號提取物在617.0 nm波長處有最大吸收峰，2號提取物在619.5 nm波長處有最大吸收峰,這與文獻報道的藻藍蛋白在615 nm-620 nm波長處有最大吸收峰相一致[7,16]，文獻報道[17]可見區(qū)藻藍蛋白的最大吸收峰為620 nm，而且在600 nm處還有一個明顯的肩峰，α亞基最大吸收峰為624 nm，β亞基最大吸收峰為610 nm，吸收峰與蛋白的提取工藝、純度、測試時溶液的PH值等都有關(guān)系，這一數(shù)值并非絕對的，而是一個波動范圍，結(jié)果提示本研究1號提取物和2號提取物分別為藻藍蛋白的兩個亞基。藻藍蛋白純度是以A620/A280的吸收率來評定的,食品級的純度是0.7，反應級是3.9，而高于4.0的就是分析級的。本研究中1號提取物純度A620/ A280為0.78，得率15%，2號提取物純度A620/A280為0.85，得率20%。，本研究提取了食品級的藻藍蛋白亞基。進一步探討其免疫活性發(fā)現(xiàn)提取物誘導小鼠脾臟淋巴細胞增殖?？傊?，本提取工藝采用低溫水提和凝膠過濾層析的方法，未添加任何化學試劑，提取了藻藍蛋白亞基，且提取物具有活性。本課題組將進一步純化藻藍蛋白亞基的提取物，并探討1號提取物和2號提取物分別屬于哪個亞基及其生物活性，為藻藍蛋白亞基的提取及應用提供實驗數(shù)據(jù)。

圖3　螺旋藻提取物紅外光掃描圖譜

圖4　螺旋藻提取物紫外/可見光掃描圖譜

表1　螺旋藻亞基提取物對小鼠脾臟單個核細胞的作用

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（收稿：2016-02-06修回：2016-03-28）

（責任編輯劉洪斌）

Extract of Phycocyanin Subunits and Immunological Activity

ZHAO Xiao-Xia,QIU Li-Jun,XUAN Cheng-Rui,et al.Department of Clinical Laboratory,Tianjin Fourth Central Hospital,Tianjin(300140),China

ObjectiveTo explore the crude extract technology for phycocyanin subunits from spirulina and the immunological activity.MethodsSpirulina powder were wall-broken at low temperature,and phycocya?nin was extracted by thick fibrous membrane from the centrifugal supernatant,then purified by SephadexG-50 gel chromatography.The purity and molecular weight were tested by SDS-PAGE,the absorbance at the wave?length of 620 nm and 280 nm were detected by infrared spectroscopy and UV/visible spectrophotometer scan? ning spectrum.And then the effect of phycocyanin subunits extract on the mouse spleen lymphocytes was observed.ResultsThe extracts of phycocya?nin subunits,No.1 and No.2 were dark green and blue dry powder respectively.They were water-solu?ble，and storage-stable at room temperature storage.In SDS-PAGE,both the extracts had a protein bands with molecular weights of 17kDa.In the infrared spectro?gram,spirulina powder showed 1 absorption peak at 1656 cm-1wavelength,No.1 extract showed 3 absorption peaks at 1655 cm-1,1633 cm-1,and 1594 cm-1,No.2 extract showed 2 absorption peaks at 1631 cm-1and 1602 cm-1,and in the residue had 1 absorption peaks at 1658 cm-1.In UV-vis，the absorption peaks of No.1 extract were at 263.5nm、619.5 nm wavelength,and of No.2 extract,were at the 263.5 nm and 619.5 nm.The puritys of No.1 extract and No.2 extract(A620/A280)waere 0.78 and 0.85,and the recoverys of No.1 extract and No.2 extract were 15%and 20%respectively.Phycocyanin subunit extracts promoted the proliferation of the mouse spleen lymphocytes.ConclusionThe crude extracts of phycocyanin subunits from spirulina by low tempera?ture have immunological activity.

Low temperature extract;phycocyanin subunit extract;immunological activity

R631

A

1007-6948(2016)02-0156-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.02.013

1.天津市第四中心醫(yī)院檢驗科（天津 300140）

2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學病原生物研究中心（呼和浩特 010110）

3.內(nèi)蒙古燚陽生物科技有限公司（呼和浩特010059）

楊麗敏,E-mail:yanglm18@163.com