新型阻燃劑TCPP對斑馬魚的毒性研究

皮天星，蔡磊明，蔣金花，趙學平，王彥華，吳聲敢，蘇連水，湯濤

1. 新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境科學學院，烏魯木齊 830052 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所 浙江省植物有害生物防控重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室，杭州 310021

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新型阻燃劑TCPP對斑馬魚的毒性研究

皮天星1,2，蔡磊明2,*，蔣金花2，趙學平2，王彥華2，吳聲敢2，蘇連水2，湯濤2

1. 新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境科學學院，烏魯木齊 830052 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所 浙江省植物有害生物防控重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室，杭州 310021

為了明確新型阻燃劑磷酸三(2-氯丙基)酯(TCPP)的生態(tài)風險，本研究采用斑馬魚為模式生物，評價了TCPP對成魚和胚胎的毒性效應。急性毒性研究結(jié)果表明，TCPP對斑馬魚成魚的96 h致死中濃度(LC50)為47.06 mg·L-1，而對胚胎96 h-LC50為26.01 mg·L-1，且會影響胚胎的正常發(fā)育，導致孵化出的仔魚產(chǎn)生畸形。成魚14 d延長毒性試驗結(jié)果表明，TCPP對斑馬魚成魚的無可觀察效應濃度(NOEC)為1.00 mg·L-1，染毒暴露后肝臟和性腺指數(shù)隨TCPP濃度增加輕微下降，但肝臟中卵黃蛋白原(VTG)的含量和性腺中芳香化酶的活性隨TCPP濃度增加普遍升高。此外，TCPP的暴露還會導致斑馬魚腦垂體中合成促性腺激素的相關(guān)基因表達量增加。因此，TCPP對斑馬魚成魚和胚胎的急性毒性均為低毒級，但長期暴露會干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控功能，影響斑馬魚的正常發(fā)育。

磷酸三(2-氯丙基)酯(TCPP)；斑馬魚；發(fā)育毒性

Received 9 July 2015 accepted 25 December 2015

磷酸三(2-氯丙基)酯(tris(2-chloroisopropyl) phosphate, TCPP)是一種有機磷酸酯類阻燃劑(organophosphate flame retardants, OPFRs)。目前，OPFRs作為多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)的替代物被廣泛用于家具和汽車產(chǎn)品[1-2]。據(jù)估計，在1998、2002和2006年，僅美國OPFRs的產(chǎn)量就高達22 700 t[3]。截止1997年，世界范圍內(nèi)每年對TCPP的需求量超過40 000 t以上[4]。OPFRs化學性質(zhì)極為穩(wěn)定，無法通過污水處理廠的活性污泥去除[5]，因此在進入環(huán)境后能夠長期存在?，F(xiàn)有資料表明，在歐洲發(fā)達國家的地表水中，檢出TCPP的濃度在17～1 500 ng·L-1[6]。此外，在發(fā)展中國家中國的地表水中也能檢測到TCPP，Hu等[7]對沿海地區(qū)地表水的檢測結(jié)果表明，TCPP的濃度為84.12 ng·L-1。

隨著OPFRs在全球范圍內(nèi)使用量的不斷擴大，環(huán)境中TCPP的濃度也在急劇增加，因此這類化學品帶來的環(huán)境風險越來越受到人們的關(guān)注。研究表明，這類化合物可能會對野生動物甚至人類產(chǎn)生毒性[8]。Laura等[9]發(fā)現(xiàn)TCPP、TCEP(磷酸三氯乙酯)和TDCPP(磷酸三(2,3-二氯丙基)酯)都可能影響生物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并且提出它們的毒性作用可能由多種機制組成。此外，研究還表明TCPP、TCEP和TDCPP與已知或疑似神經(jīng)毒物(例如毒死蜱)的毒性效力相當或更高。由此可見，OPFRs的環(huán)境風險不容忽視。然而目前對OPFRs的環(huán)境及生態(tài)毒理學研究還處于起步階段，特別是針對水生脊椎動物的研究。作為TCPP的同系物，對TDCPP的研究有較為豐富的資料，低濃度的TDCPP可能會對魚類產(chǎn)生發(fā)育毒性，影響斑馬魚體節(jié)、快肌和軟骨的形成[10]。低濃度的TDCPP會影響斑馬魚的小丘腦-垂體-性腺軸，從而導致其繁殖能力大幅下降[11]。此外，TDCPP還對斑馬魚具有一定的發(fā)育毒性[12]，研究發(fā)現(xiàn)TDCPP會引起胚胎和仔魚體內(nèi)甲狀腺激素含量異常的現(xiàn)象，從而導致不正常的發(fā)育，這可能與TDCPP影響魚類下丘腦-垂體-甲狀腺軸的正常發(fā)育有關(guān)[13]。然而，鮮有對TCPP的生態(tài)毒理學研究，特別是對魚類的亞慢性毒性效應。

斑馬魚作為國際標準試驗動物，其具有體型小、性成熟快、易于飼養(yǎng)，在實驗室內(nèi)可全年連續(xù)產(chǎn)卵等特點[14]。因此，本研究選用標準試驗動物斑馬魚(Danio rerio)作為受試生物，研究TCPP對成魚和胚胎的急性毒性效應以及亞慢性毒性效應，比較斑馬魚在不同生命階段對TCPP的敏感程度，探索在非致命濃度下長期暴露對斑馬魚成魚健康產(chǎn)生的影響及其作用機理。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

斑馬魚(Danio rerio)種魚購買自武漢水生生物研究所，在本實驗室飼養(yǎng)超過2年，試驗中所用到的斑馬魚成魚和胚胎均為其后代。

急性毒性試驗均用3個月以上性成熟的健康斑馬魚成魚，體長在(2.0±0.5) cm，體重為(0.120±0.010) g，14 d延長毒性試驗使用5個月以上斑馬魚成魚，體長在(5.5±0.4) cm，雌魚體重為(0.95 ±0.7) g，雄魚體重為(0.61±0.5) g。試驗溫度控制在(23.0±1.0) ℃，光黑暗比為12 h:12 h。試驗用水為經(jīng)活性炭凈化的曝氣自來水，水中溶解氧要維持在飽和溶解度80%以上，pH控制在(7.5±1.5)，水中硬度在(85±10) mg CaCO3·L-1。成魚在急性毒性正式試驗開始前1天停止喂食。胚胎試驗使用試驗當天收集的透明健康胚胎。

磷酸三(2-氯丙基)酯(TCPP)純度為99.5%，購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH。用于胚胎染毒的24孔細胞培養(yǎng)板購自浙江拱東醫(yī)療科技有限公司。斑馬魚專用卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)濃度和芳香化酶活性酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒購自上海通蔚實業(yè)有限公司。mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。

對胚胎的拍照和觀察使用德國萊卡LEICA S8 APO型復消色差立體顯微鏡。實時定量PCR使用SYBR熒光顯色PCR，采用美國BIO-RAD實時系統(tǒng)進行分析。微量風光光度計購自美國Quawell公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 成魚急性毒性試驗

稱取0.377 g TCPP原藥，溶解于1 L去離子水中，配制成375.0 mg·L-1的TCPP儲備液。

急性毒性的試驗方法主要參考經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co- operation and Development, OECD)化學品測試準則203[15]。由于TCPP在酸性和堿性條件下都不易分解[3]，根據(jù)預實驗結(jié)果，TCPP在試驗開始96 h后，其實際濃度不低于添加濃度的80%，因此急性試驗采用靜態(tài)暴露法，96 h內(nèi)不更換暴露溶液。試驗共設(shè)置5個暴露濃度梯度，分別為：30.0、36.0、43.1、47.0和51.8 mg·L-1。另設(shè)置一個空白對照組(control, CK)。

試驗使用無接縫圓形6 L玻璃缸，1缸為1重復，每缸放入5 L配制好濃度的供試品溶液，并使用15條受試魚進行暴露。整個試驗過程中每天對水中的溫度和溶解氧進行監(jiān)控，整個試驗期間每隔12 h曝氧1 h，以維持水中溶氧度。試驗期間，分別在6 h、12 h、24 h、48 h和96 h觀察受試魚的中毒癥狀和死亡情況，死亡標準為：用鑷子輕戳受試魚體無應激反應，并觀察受試魚腮部無呼吸活動，即判定為死亡。

1.2.2胚胎急性毒性試驗

胚胎急性毒性試驗參考OECD化學品測試準則236[16]。收集試驗當天斑馬魚產(chǎn)出的胚胎，通過立體顯微鏡挑選出形狀飽滿，顏色透明的健康胚胎。以24孔細胞培養(yǎng)板作為染毒容器，每孔放置1枚胚胎，在其中的20個孔中加入2 mL暴露溶液，另外4孔加入2 mL潔凈的曝氣水作為板內(nèi)空白對照組。1板為1重復，每濃度設(shè)2個重復組，此外單獨設(shè)置1個空白對照組。同樣采用靜態(tài)暴露法，TCPP對斑馬魚胚胎的暴露濃度分別為：6.1、9.2、13.8、20.7、31.1和46.7 mg·L-1。試驗開始后24 h、48 h、72 h和96 h使用立體顯微鏡觀察胚胎的死亡、發(fā)育和孵化情況并拍照記錄。

1.2.3 14 d延長毒性試驗

14 d延長毒性試驗參考OECD化學品測試準則204[17]。試驗采用半靜態(tài)法，每隔96 h更新1次暴露溶液，以無接縫圓形12 L玻璃缸作為暴露容器，設(shè)置受試物TCPP的濃度梯度為0.008、0.04、0.2、1.0和5.0 mg·L-1。使用5個月大性成熟的斑馬魚，每濃度梯度雌魚和雄魚各6尾。整個試驗共進行14 d，每天對受試魚的中毒癥狀進行觀察和記錄，并檢查是否出現(xiàn)死亡。每日早晚各投喂1次餌料(周末減少為1次)，投喂以固體漂浮飼料和新孵化的豐年蝦為主。

試驗結(jié)束后，使用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)安樂死所有受試魚，逐一稱重并記錄。每濃度組解剖雌魚和雄魚各3尾，分離出它們的肝臟、性腺和大腦，稱重肝臟和性腺計算性腺指數(shù)(GSI=100×[性腺重量(g)/體重(g)])和肝臟指數(shù)(HSI=100×[肝臟重量(g)/體重(g)])，并分別裝入不同的離心管中，加入適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)(按組織：PBS=1:9的比例)，冷藏于-20 ℃冰箱中，用于酶和卵黃蛋白原(VTG)的檢測。將分離出的雌性和雄性的大腦分別放入離心管中，并迅速用液氮冷凍，冷藏于-80 ℃冰箱中，用于mRNA表達量的檢測。

1.2.4 芳香化酶的檢測

雌魚和雄魚肝臟中VTG的含量以及性腺中芳香化酶的活性均使用酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒進行檢測。

向每個裝有組織和PBS的試管中放入1顆無菌小鋼珠，使用震蕩勻漿機充分研磨。用小型離心機，4 ℃，3 000 r·min-1離心15 min，取上清液。使用斑馬魚VTG專用ELISA試劑盒檢測雌魚和雄魚肝臟中的VTG含量。

與肝臟的處理過程相同，將性腺勻漿后離心取上清，使用斑馬魚芳香化酶專用ELISA試劑盒檢測卵巢和精巢中芳香化酶的活性。

1.2.5 大腦調(diào)控基因表達量的檢測

使用TRIZOL法提取斑馬魚大腦中的總RNA，提取完畢后使用微量風光光度計檢測總RNA的濃度，并通過1.3 %瓊脂凝膠電泳檢查提取RNA的質(zhì)量。cDNA的合成使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

PCR混合液(20 μL)由0.8 μL前、后引物，1 μL cDNA樣品，10 μL 2×mixture SYBR和8.2 μL RNase-Free H2O組成。主要檢測的目標基因包括：細胞色素P450 19(CYP19)、雌激素受體(ER)、ER2、黃體化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促性腺激素釋放激素3(GnRH3)、GnRH 2、GnRH 1、促性腺激素受體4(GnRHR4)、GnRHR3、GnRHR2和內(nèi)參基因(Actin)(前后引物見附錄中表1)。

熒光定量PCR反應的條件為：95 °C預變性2 min；95 °C變性20 s，55 °C退火25 s，72 °C延伸35 s共40個循環(huán)；從60 °C到95 °C每隔0.2 °C讀取熔點曲線；72 °C延伸7 min。每個基因都做3個機械重復，以保證數(shù)據(jù)的可靠性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

計算成魚和胚胎急性毒性24 h、48 h、72 h和96 h-LC50的值以及相應的95%置信區(qū)間使用軟件DPS 7.05版?；虮磉_量的計算與分析使用IBM SPASS Statistics 21軟件。

2 結(jié)果 (Results)

2.1 成魚急性毒性試驗結(jié)果

TCPP對斑馬魚成魚24～96 h的LC50如表1所示。試驗開始后的0～24 h，高濃度TCPP處理組會出現(xiàn)大量死亡，在24 h～96 h，死亡率趨于平緩，這表明TCPP會在短時間內(nèi)對魚類造成致命損傷。在未出現(xiàn)死亡的濃度組中，斑馬魚表現(xiàn)出不同程度的中毒癥狀，包括身體失衡、游動緩慢、沉底和腮部出血等。

2.2 胚胎毒性試驗結(jié)果

2.2.1 致死效應

TCPP對斑馬魚胚胎24～96 h的LC50見表2。由圖1可知，隨著暴露濃度的增加，TCPP對斑馬魚胚胎的致死毒率也隨之增加，這說明TCPP對斑馬魚胚胎的毒性具有劑量-效應關(guān)系。在斑馬魚胚胎最高暴露濃度(46.7 mg·L-1)，胚胎死亡率會隨著時間的延續(xù)而不斷升高，最終在96 h達到最高值(60%)，這說明在最高暴露濃度，斑馬魚胚胎的死亡率與暴露濃度之間存在時間-效應關(guān)系。然而，其他暴露濃度組(31.1～6.1 mg·L-1)只在0～24 h會導致

斑馬魚胚胎大量死亡，之后死亡率維持在較穩(wěn)定水平，這表明在較低的濃度組中，TCPP對斑馬魚胚胎的致死毒性沒有顯著的時間-效應關(guān)系。

2.2.2 亞致死效應

斑馬魚的孵化時間一般在48 h～72 h，由圖2可知TCPP對斑馬魚胚胎的孵化率無顯著影響。胚胎經(jīng)TCPP暴露后，孵化出的仔魚會出現(xiàn)不同程度的畸形，主要表現(xiàn)為仔魚和胚胎的發(fā)育畸形，且這種現(xiàn)象的發(fā)生幾率會隨著暴露濃度的增加而不斷提高。由圖2可知，受試魚胚胎在96 h-46.7 mg·L-1TCPP的畸形率為80.0%，但在96 h-31.1 mg·L-1TCPP致畸率則只有10.0%。

圖1 TCPP對斑馬魚的致死效應Fig. 1 Effect of TCPP on mortality of zebrafish

表1 TCPP對斑馬魚成魚的急性毒性

表2 TCPP對斑馬魚胚胎的急性毒性

Table 2 Acute toxicity of TCPP to embryo of zebrafish

受試生物Testorganism暴露時間/hTimeofexposure/h毒力回歸方程Toxicregressionequation相關(guān)系數(shù)Relativecoefficient,r半致死濃度(95%置信區(qū)間)/(mg·L-1)LC50(95%CI)/(mg·L-1)斑馬魚(Daniorerio)24y=-10.4038+9.7031x0.896542.32(19.89～81.59)48y=2.0958+1.5347x0.983379.00(58.360～116.88)72y=1.5792+2.3308x0.992230.82(26.11～34.56)96y=2.2249+2.0112x0.960126.01(18.46～32.71)

圖2 TCPP對斑馬魚孵化率和致畸率的影響Fig. 2 Effect of TCPP on hatchability and teratogenic rate of zebrafish

圖3 斑馬魚脊柱彎曲 注：a. 脊柱正常的仔魚；b. 輕度脊柱彎曲的仔魚；c. 重度脊柱彎曲的仔魚(黑色箭頭標注的位置即為脊柱彎曲)。Fig. 3 Spinal disorders of zebrafish Note: a. larvae with normal spine; b. larvae with slight spinal curvature; c. larvae with moderate spinal curvature.

圖4 斑馬魚肝臟指數(shù)和性腺指數(shù)的變化Fig. 4 Effect of gonadosomatic index and hepatosomatic index of zebrafish

斑馬魚的發(fā)育畸形主要表現(xiàn)為仔魚脊柱彎曲，如圖3所示，a圖為CK組中正常發(fā)育的仔魚，b圖為出現(xiàn)輕度脊柱彎曲的仔魚，此時的仔魚能夠游動，但不能像正常發(fā)育的仔魚那樣保持身體平衡；c圖中所示的仔魚其脊柱彎曲程度較為嚴重，雖然在顯微鏡下能觀察到心跳，但已失去基本游動能力。

2.3 14 d延長毒性試驗結(jié)果

通過14 d的暴露，最高暴露濃度(5 mg·L-1)在第12天有出現(xiàn)斑馬魚死亡的現(xiàn)象，1.000 mg·L-1濃度組中的受試魚未出現(xiàn)死亡，但能觀察到游動緩慢、沉底、呼吸減緩等中毒癥狀，其他濃度組并未觀察到明顯的中毒癥狀。因此，TCPP對斑馬魚成魚致死效應的最大無效應濃度(NOEC)為1 mg·L-1。

2.3.1 斑馬魚肝臟指數(shù)和性腺指數(shù)的變化

斑馬魚雌魚和雄魚肝臟指數(shù)和性腺指數(shù)的變化如圖4所示。受到TCPP暴露后，雌魚和雄魚的肝臟指數(shù)隨暴露濃度的增加而降低。雄魚的性腺發(fā)育并未受到TCPP暴露的影響，在試驗結(jié)束后受試組的性腺指數(shù)與對照組相比無明顯變化，但雌魚在受到暴露后，各暴露組受試魚的性腺指數(shù)與對照組相比都有略微下降。2.3.2 肝臟中VTG的含量與性腺中芳香化酶的活性

經(jīng)不同濃度TCPP暴露后，斑馬魚肝臟中VTG的含量變化如圖5所示。與對照組相比，雄魚肝臟中VTG的含量在受到較高的3個濃度暴露后會有所升高。而雌魚肝臟內(nèi)VTG含量會隨TCPP暴露濃度的增加而急劇升高，特別是最高暴露濃度組(1.000 mg·L-1)中雌魚肝臟VTG的含量甚至超過對照組2倍以上。在精巢中，受暴露的雄魚芳香化酶的活性并沒有發(fā)生顯著的變化，只是隨TCPP暴露濃度的增加而略微有上升。而在卵巢中，芳香化酶的活性與受試組相比顯著升高，特別是在較高的2個濃度組中。

圖5 斑馬魚肝臟中VTG的含量與性腺中芳香化酶的活性Fig. 5 Vitellogenin in liver and aromatase activity in gonad of zebrafish

圖6 斑馬魚大腦調(diào)控基因表達量的變化Fig. 6 Changes of relative genetic expression in brain of zebrafish

2.3.3 大腦中調(diào)控基因表達量分析

圖6所示為大腦中下丘腦-垂體與調(diào)控性激素相關(guān)的基因表達量的變化，在受到TCPP暴露14 d后，雌魚和雄魚腦部接受血液中雌激素反饋信息的雌激素受體ER和ER2在受到較高濃度TCPP暴露后，其表達量與對照組相比發(fā)生顯著正向調(diào)控。其次，雄魚下丘腦中促性腺激素釋放激素基因GnRH的表達量與對照組相比均表現(xiàn)為顯著的負調(diào)控，雌魚下丘腦中的GnRH-1的表達量未出現(xiàn)顯著變化，而GnRH-2、GnRH-3的表達量與對照組相比也表現(xiàn)為顯著的負調(diào)控。受此影響，雄魚垂體中接受促性腺激素釋放激素調(diào)控信息的促性腺激素釋放激素受體基因(RnRHR)的表達量與對照組相比全部表現(xiàn)為顯著的負調(diào)控，而雌魚除RnRHR-2外，其余RnRHR基因的表達量也表現(xiàn)為顯著的負調(diào)控，此結(jié)果與下丘腦中GnRH的表達量結(jié)果一致。但是，雌魚黃體生成素基因(LH)和卵泡刺激素基因(FSH)的表達量與對照組相比則表現(xiàn)為顯著的正調(diào)控，雄魚LH基因表現(xiàn)為顯著負調(diào)控，而FSH基因也表現(xiàn)為顯著負調(diào)控，且表達量隨暴露濃度的增加而不斷提高。

3 討論(Discussion)

由成魚和胚胎急性毒性試驗結(jié)果可知，斑馬魚成魚(96-h LC50為47.06 mg·L-1)對TCPP的耐受性要遠高于胚胎(96-h LC50為26.01 mg·L-1)。此外，成魚和胚胎的致死效應與暴露時間之間均沒有明顯的時間-效應關(guān)系。各濃度組中存活下來的個體雖然會出現(xiàn)明顯的中毒現(xiàn)象，如游動緩慢、失去平衡和沉底等現(xiàn)象，但會維持這些狀態(tài)直至試驗結(jié)束。這種在受到化合物短時間暴露就產(chǎn)生不可逆損傷的現(xiàn)象與有機磷農(nóng)藥對魚類產(chǎn)生的毒性效應類似[18]，因此，我們懷疑OPFRs作為一類有機磷酸酯類化合物可能與有機磷類農(nóng)藥有相似的致毒機理，且作用靶器官可能是乙酰膽堿酯酶較為豐富的腦部，但這一假設(shè)還有待于進一步的驗證。

此外，未死亡的胚胎在孵化后會出現(xiàn)發(fā)育畸形的現(xiàn)象，特別是在較高的濃度中，這與其同系物TDCPP的實驗結(jié)果相似。Sean等[12]用TDCPP對斑馬魚胚胎進行暴露實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孵化出的幼魚會出現(xiàn)脊柱向后彎曲和心包囊腫等現(xiàn)象，其認為TDCPP可能會干擾魚類胚胎中成纖維細胞生長因子家族(fibroblast growth factors, FGFs)的正常功能，這是一類被認為在脊椎動物的胚胎發(fā)育過程中起非常關(guān)鍵作用的生長因子。由本研究結(jié)果可知，TCPP的暴露會產(chǎn)生相同的影響，因此，我們認為這類TCPP可能會在魚類生命早期階段干擾成纖維細胞生長因子家族并阻礙脊柱的正常發(fā)育。

通過14 d延長毒性試驗的結(jié)果可知，在低于NOEC的濃度下，雌魚和雄魚肝臟指數(shù)與對照組相比并沒有出現(xiàn)顯著的變化，這表明在整個暴露過程中，受試魚的肝臟并未受到影響，即肝臟沒有出現(xiàn)病變且未出現(xiàn)大量分解肝糖原的現(xiàn)象[19]。雌魚和雄魚的性腺指數(shù)也未出現(xiàn)顯著的變化，因此我們認為，在低濃度下TCPP不會對肝臟和性腺的發(fā)育產(chǎn)生影響。

在卵巢中，芳香化酶催化產(chǎn)生雌激素并釋放到血液中，促使肝臟合成卵黃蛋白原，促進胚胎中卵黃的正常發(fā)育[20]。因此，芳香化酶的活性對魚類卵母細胞的發(fā)育有重要作用[21]。試驗結(jié)果表明，受到TCPP暴露后，雌魚卵巢中芳香化酶的活性會顯著升高，這導致雌魚肝臟中VTG的含量也大幅上升。此外，通常情況下雄魚體內(nèi)并不會產(chǎn)生VTG，或VTG在較低的水平，但經(jīng)TCPP暴露后，雄魚肝臟中的VTG含量會隨暴露濃度的增加而上升。大量研究表明[22-24]，在受到外源性雌激素暴露后，雄魚的內(nèi)分泌系統(tǒng)會受到干擾，最重要的一個標志就是雄魚體內(nèi)VTG含量升高，這會造成雄魚精子發(fā)育失常、第二性征退化、性行為頻次降低，甚至出現(xiàn)性別反轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。因此，本試驗的結(jié)果表明，TCPP可能具有類雌激素的效應。

內(nèi)分泌調(diào)控研究表明，斑馬魚內(nèi)分泌系統(tǒng)與哺乳動物類似，大腦中雌激素受體在接收到血液中雌激素含量變化的信號后，會向下丘腦發(fā)出反饋信號，之后下丘腦做出反應，增加或減少向垂體釋放促性腺激素釋放激素。垂體中的促性腺激素釋放激素受體會依據(jù)接收到的信號做出正確的反應，合成促性腺激素進入血液循環(huán)并傳遞至性腺，從而調(diào)控體內(nèi)性激素的含量，此過程即為下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控系統(tǒng)[25-26]。而通過分析本試驗中相關(guān)調(diào)控基因表達量的變化發(fā)現(xiàn)，血液中性激素含量升高后，雌激素受體和下丘腦均做出了正確的反應，即性激素受體基因做出正向調(diào)控，下丘腦中促性腺激素釋放激素調(diào)控基因受到抑制以減少促性腺激素釋放激素的合成量，而垂體在促性腺激素釋放激素信號減少的情況下，卻做出錯誤的反應，繼續(xù)不斷增加促性腺激素基因的表達量，從而產(chǎn)生更多的促性腺激素進入血液，促進性腺分泌性激素，這勢必導致整個內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂(見圖7)。研究結(jié)果表明，TCPP會干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控功能，影響斑馬魚的正常發(fā)育，且其作用位點可能位于腦垂體中。

圖7 雌性和雄性斑馬魚基因調(diào)控示意圖Fig. 7 Diagram of gene regulation in female and male zebrafish

Liu等[11]有關(guān)TDCPP和TPP(磷酸三苯酯)對斑馬魚繁殖毒性效應的研究表明，成年斑馬魚在經(jīng)過21 d暴露后，其累積產(chǎn)卵量會顯著減少。同時，血液中17β-雌二醇和VTG的含量都顯著升高。同時，根據(jù)對大腦和性腺中相關(guān)基因的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下丘腦中促性腺激素釋放激素的調(diào)控基因與對照組相比均表現(xiàn)為負調(diào)控或無變化，而腦垂體促性腺激素則主要表現(xiàn)為正調(diào)控，從而導致內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂。這與本研究中得到的結(jié)果一致，這表明OPFRs這類化合物可能都會對內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

TCPP作為一種新興的阻燃劑，它的使用量和使用范圍正在逐年擴大，而目前有關(guān)TCPP的毒理學研究還非常匱乏。因此，本研究能夠為政府部門有效管理這類化學品提供科學支持。

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◆

附錄(Appendix)

Toxicity Effects of A New Flame Retardant Tris(2-chloroisopropyl) Phosphate to Zebrafish (Daniorerio)

Pi Tianxing1,2, Cai Leiming2,*, Jiang Jinhua2, Zhao Xueping2, Wang Yanhua2, Wu Shenggan2, Su Lianshui2, Tang Tao2

1. College of Grassland and Environment Sciences, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China 2. Institute of Quality and Standard of Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control/Key Laboratory for Pesticide Residue Detection of Ministry of Agriculture, Hangzhou 310021

To understand the ecological risk of fire retardant tris(2-chloropropyl) phosphate (TCPP), we investigated its toxic effects on adult zebrafish and zebrafish embryos. Acute toxicological study indicated that the LC50of TCPP for adult zebrafish in 96 h was 47.06 mg·L-1, and that for zebrafish embryos in 96 h was 26.01 mg·L-1. Moreover, TCPP could impair the embryo development, leading to deformed larvae. The 14-day chronic toxicity study indicated that the no observed effect concentration (NOEC) of TCPP towards adult zebrafish was 1.00 mg·L-1. The liver and gonad function index slightly declined with the chronic exposure of increased TCPP concentration. However, the levels of liver vitellogenin (VTG) and gonadal aromatase were increased. In addition, exposure to TCPP resulted in the increased expression of the genes involved in the biosynthesis of gonadotropin in the pituitary. Therefore, the acute toxicity of TCPP to adult zebrafish and its embryos was low toxicity grade. However, chronic exposure disrupted the endocrine system and affected the normal development of zebrafish.

tris(2-chloroisopropyl) phosphate (TCPP); zebrafish (Danio rerio); developmental toxicity

附表1 目標基因引物

10.7524/AJE.1673-5897.20150709002

農(nóng)藥助劑環(huán)境風險評估及管理研究(2013467026)

皮天星(1989-)，男，碩士研究生，研究方向為環(huán)境毒理學，E-mail: ptx@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: hzcaileiming@foxmail.com

2015-07-09 錄用日期：2015-12-25

1673-5897(2016)2-247-10

X171.5

A

簡介：蔡磊明(1962—)，男，博士，教授級高級工程師，主要研究方向為生態(tài)學、化學品安全評價及環(huán)境科學。

皮天星, 蔡磊明, 蔣金花, 等. 新型阻燃劑TCPP對斑馬魚的毒性研究[J]. 生態(tài)毒理學報，2016, 11(2): 247-256

Pi T X, Cai L M, Jiang J H, et al. Toxicity effects of a new flame retardant tris(2-chloroisopropyl) phosphate to zebrafish (Danio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 247-256 (in Chinese)