全氟十二烷酸(PFDoA)慢性暴露干擾大鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)水平

張紅霞，崔瑞娜，戴家銀

中國科學(xué)院動物研究所 中國科學(xué)院動物生態(tài)與保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

?

全氟十二烷酸(PFDoA)慢性暴露干擾大鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)水平

張紅霞，崔瑞娜，戴家銀*

中國科學(xué)院動物研究所 中國科學(xué)院動物生態(tài)與保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

全氟烷基類化合物(PFASs)是一類新型持久性有機(jī)污染物，因其獨(dú)特的理化性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)和商業(yè)領(lǐng)域，對生物體具有一定的毒性作用。為探究全氟十二烷酸(PFDoA)致肝臟毒性作用機(jī)制，選擇雄性大鼠為受試生物，采用2-DE蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與ProQ Diamond dye磷酸化蛋白染色結(jié)合的方法初步研究了不同劑量PFDoA暴露110 d后大鼠肝臟蛋白磷酸化水平的變化。結(jié)果表明，30個(gè)磷酸化蛋白表達(dá)水平在PFDoA處理后發(fā)生顯著變化，其中，經(jīng)過MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，成功鑒定18個(gè)蛋白點(diǎn)。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要涉及糖脂代謝、氨基酸代謝、應(yīng)激防御及電子傳遞等途徑。以上結(jié)果有助于進(jìn)一步從翻譯后修飾水平了解PFDoA的肝臟毒性作用。

PFDoA；大鼠；肝臟毒性；磷酸化蛋白；Pro-Q Diamond

Received 18 August 2015 accepted 15 October 2015

全氟烷基類化合物(perfluoroalkyl substances, PFASs)是一類具有不同碳鏈長度的新型持久性有機(jī)污染物，包括全氟辛酸(perfluorooctanoic acid, PFOA, C8)、全氟辛磺酸(perfluorooctansulfonate, PFOS, C8)及全氟十二烷酸(perfluorododecanoic acid, PFDoA, C12)等。這類化合物因其獨(dú)特的疏水疏油、表面活性和熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)生產(chǎn)及商業(yè)消費(fèi)品領(lǐng)域[1]。PFASs不易降解、具有持久性及遠(yuǎn)距離遷移的特性，因此在世界各地的環(huán)境介質(zhì)和生物組織中都檢測到這類物質(zhì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)PFASs具有廣泛的生物毒性，如導(dǎo)致肝臟腫大和空泡化，增加肝臟脂質(zhì)水平，降低血清膽固醇，引起免疫器官萎縮和免疫細(xì)胞數(shù)量減少，具有雌激素活性，降低精子質(zhì)量，引起新生兒發(fā)育遲緩等現(xiàn)象[2-4]。而目前關(guān)于PFASs毒性機(jī)理的研究主要集中在傳統(tǒng)毒理學(xué)終點(diǎn)指標(biāo)、生化指標(biāo)、基因組學(xué)及蛋白水平上[5-8]，而從翻譯后修飾水平上對其毒性機(jī)制研究很少。

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式中最普遍的一種。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化幾乎調(diào)節(jié)著生命活動的整個(gè)過程，包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動、肌肉收縮、新陳代謝、腫瘤發(fā)生等[9-11]。尤其在細(xì)胞應(yīng)答外界刺激的信號傳遞途徑中，蛋白質(zhì)磷酸化是目前所知道的最主要方式[12-13]。而通常情況下，磷酸化作用調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性時(shí)，蛋白質(zhì)豐度并不發(fā)生變化，因此蛋白質(zhì)磷酸化的定量研究在進(jìn)一步探討磷酸化蛋白質(zhì)的功能時(shí)尤為重要。Pro-Q Diamond(Pro-Q DPS)是一種磷酸化蛋白質(zhì)的熒光染料[14]，可以直接對二維雙向電泳(2-DE)分離后的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性染色，對非磷酸化蛋白質(zhì)的反應(yīng)性很低，且熒光強(qiáng)度會隨著蛋白質(zhì)磷酸化程度的不同而呈現(xiàn)出一定的量的變化，因此被廣泛用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

肝臟是生物體最重要的代謝和免疫器官。本實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用磷酸化蛋白組和質(zhì)譜技術(shù)對PFDoA作用下大鼠肝臟蛋白磷酸化水平進(jìn)行定量研究，鑒定了差異磷酸化蛋白質(zhì)性質(zhì)及可能的修飾位點(diǎn)，并通過生物學(xué)分析確定其功能，為闡明PFDoA對大鼠肝臟的毒性作用機(jī)理提供進(jìn)一步的依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用雄性大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心，體重為230～240 g。實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)一周，飼養(yǎng)密度為2只/籠，光照周期為12 h∶12 h，溫度為20～26 ℃，相對濕度為50%，并具有通風(fēng)循環(huán)系統(tǒng)。馴養(yǎng)后，隨機(jī)將大鼠分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(包括1個(gè)對照組和2個(gè)處理組)，每組6只，各組平均體重?zé)o顯著性差異。

1.2 主要儀器與試劑

二維凝膠電泳系統(tǒng)(Ettan IPGphor 3等電聚焦電泳儀、Hoefer SE600垂直電泳儀)(美國GE)，Typhoon 9400掃描儀(美國GE)，MALDI-TOF/TOF MS(4700，美國Applied Biosystems) 。

PFDoA(純度﹥99%)、Tween-20、尿素、硫尿、CHAPs等購自美國Sigma公司，2D Quant Kit、2D Clean-Up Kit購自美國GE公司，Pro-Q DPS凝膠染料、磷酸化蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、SYPRO Ruby凝膠染料購自美國Invitrogen公司，胰蛋白酶(Trypsin)購自美國Promega，乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)購自德國Merck公司，果糖二磷酸酶1(Fbp1)多克隆抗體、Hprt兔多克隆抗體，熱休克蛋白Hsp90ab1和p-Hsp90ab1(S254)兔多克隆抗體均購自美國Santa Cruze公司。所有化學(xué)品除了ACN是色譜純其他均是分析純，實(shí)驗(yàn)所用水都經(jīng)過Milli-Q system(美國Millipore)處理。

1.3 動物暴露

PFDoA用0.5%的Tween-20制成懸濁液，對大鼠進(jìn)行灌胃。本實(shí)驗(yàn)設(shè)一個(gè)對照組(灌以0.5% Tween-20)和2個(gè)PFDoA處理組(0.2 mg·kg-1·d-1和0.5 mg·kg-1·d-1)，灌胃體積均為6 mL·kg-1。連續(xù)灌胃110 d后，所有大鼠進(jìn)行稱重，斷頭處死，迅速剝離肝臟置于液氮中，再轉(zhuǎn)入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白樣品制備

每組隨機(jī)選4個(gè)肝臟樣品，分別取約100 mg，加入預(yù)冷的蛋白裂解液(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、4% CHAPS、30 mmol·L-1Tris、1 mmol·L-1PMSF、1%蛋白酶抑制劑cocktail)，冰浴勻漿后超聲破碎2 min：15%功率，工作1 s，間隔5 s。以4 ℃、12 000 g離心20 min，收集上清液。提取后的蛋白用2D Quant Kit測定蛋白濃度。每組中4個(gè)樣品等蛋白量混合成1個(gè)樣品，混合樣品用2D Clean-Up Kit除鹽后重新測定濃度以備后續(xù)2-DE分析。

1.5 二維凝膠電泳(2-DE)

每組混合樣品各取100 μg加入200 μL水化液中(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、2% CHAPS、20 mmol·L-1DTT、0.5% IPG buffer)，充分混勻。20 000 g離心30 min后，加入到11 cm膠條槽中。將室溫平衡后的IPG膠條(11 cm，pH 4～7)放入膠條槽，加覆蓋油，在IPGphor儀器上進(jìn)行第一向等電聚焦至43 kVh。等電聚焦后，進(jìn)行IPG膠條平衡，之后置于Hoefer SE600電泳槽內(nèi)進(jìn)行垂直電泳，并加入0.5 μg磷酸化蛋白Marker。電泳條件：15 ℃循環(huán)水浴、10 mA電泳1 h，之后30 mA橫流電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)底部邊緣。每次3個(gè)樣品，每組1個(gè)，至少4個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

1.6 Pro-Q DPS染色和SYPRO Ruby染色

Pro-QDPS是一種磷酸化蛋白特異性染料。將SDS-PAGE分離后凝膠置于固定液(40%甲醇、10%乙酸)中過夜。超純水漂洗3次，加入Pro-Q DPS染液染色90 min。加入脫色液(50 mmol·L-1NaOAC、20%乙腈，pH 4.0)脫色3次，每次30 min。超純水漂洗2次后用Typhoon 9400掃描儀對凝膠進(jìn)行掃描。激發(fā)光/發(fā)射光：532 nm/580 nm，用ImageQuant TL 7.0軟件對圖像進(jìn)行分析，避免蛋白點(diǎn)過飽和。

SYPRO Ruby是一種全蛋白熒光染料。Pro-Q DPS染色后凝膠放入超純水中漂洗2次后加入含SYPRO Ruby染液中染色過夜。加入SYPRO Ruby脫色液(7%乙酸、10%甲醇)脫色30 min。超純水漂洗2次后用Typhoon 9400掃描儀對凝膠進(jìn)行掃描。激發(fā)光/發(fā)射光：532 nm/610 nm，用ImageQuant TL 7.0軟件對圖像進(jìn)行分析，避免蛋白點(diǎn)過飽和。

全程避光操作，掃描后將SYPRO Ruby染色后的凝膠進(jìn)行銀染。

1.7 圖像分析

運(yùn)用ImageMaster 2D Platinum 6.0(美國GE)軟件對Pro-Q DPS染色膠圖進(jìn)行分析。背景校正、定義地標(biāo)后檢測蛋白點(diǎn)，對照組作為Master gel，與各實(shí)驗(yàn)組膠進(jìn)行匹配。將匹配上蛋白點(diǎn)的體積百分比(Vol%)輸出后進(jìn)行分析，用t-test檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P <0.05的蛋白認(rèn)為是差異表達(dá)蛋白。將SYPRO Ruby膠圖與Pro-Q DPS染色圖進(jìn)行匹配，找出差異點(diǎn)后與銀染圖進(jìn)行匹配。

1.8 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫搜索

在銀染膠上切取差異蛋白點(diǎn)，置于96孔板中，每孔加入150～200 μL脫色液(鐵氰化鉀 25 mmol·L-1，硫代硫酸鈉50 mmol·L-1)脫色40 min。超純水洗2次，加入ACN脫水，烘干。每孔加入2.5～3 μL Trypsin酶液于37 ℃消化12 h，直到膠粒由白變透明。每孔加入肽段提取液(50% ACN、0.1% TFA)60～70 μL，提取30 min，重復(fù)1次。凍干后加入10 μL肽段提取液，用于質(zhì)譜分析。

取0.5 μL樣品與等體積的質(zhì)譜上樣液(0.1% TFA、50% ACN)混合后點(diǎn)靶，用4700 Proteomics Analyzer (TOF/TOF TM)串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，激光源為355 nm波長，加速電壓為20 kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)。所得結(jié)果用MASCOT進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。搜索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫為NCBInr；檢索種屬為大鼠；最大允許漏切位點(diǎn)為1；酶為胰蛋白酶。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置：PMF 0.3 Da，MS/MS 0.4 Da。

將protein score>56的檢索結(jié)果認(rèn)定為可信匹配蛋白，置信區(qū)間(C.I.)>95%的肽段序列認(rèn)定為可信序列。然后將可信匹配蛋白依據(jù)GO terms和KEGG進(jìn)行功能分類和生物學(xué)過程分析。多數(shù)蛋白具有多種功能，則根據(jù)其主要的功能進(jìn)行分類。

1.9 Western blot 驗(yàn)證

將等量蛋白樣品通過SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)膜。PBST洗膜后奶粉封閉，加入一抗(1：1 000)，過夜孵育。PBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:5000)，孵育1 h，后洗膜曝光。蛋白條帶使用化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑顯示，X膠片曝光。掃描后，用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，目標(biāo)蛋白灰度使用內(nèi)參(Hprt)進(jìn)行校正。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 Pro-Q DPS磷酸化蛋白染色方法的建立

本實(shí)驗(yàn)參考Agrawal等(2005)優(yōu)化的Pro-Q DPS染色方法結(jié)合二維電泳對雄性大鼠肝臟的磷酸化蛋白進(jìn)行分析，磷酸化蛋白染色后用SYPRO Ruby熒光染料對全蛋白進(jìn)行后染色。圖1顯示了同一張2D凝膠多重染色的圖譜，其中蛋白marker中45 kd、23.6 kd為磷酸化蛋白。圖中可以看出雄性大鼠肝臟蛋白在11 cm、pH 4～7二維凝膠上分離效果較好，大多數(shù)蛋白點(diǎn)清晰可見；從蛋白marker中磷酸化蛋白在兩膠圖上的信號強(qiáng)度可以看出本實(shí)驗(yàn)中Pro-Q DPS在二維凝膠上的磷酸化蛋白染色特異性比較好，可以進(jìn)行差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

2.2 PFDoA對大鼠肝臟磷酸化蛋白表達(dá)水平的影響

不同劑量PFDoA(0、0.2、0.5 mg·kg-1·d-1)暴露110 d大鼠肝臟蛋白2-DE分離后用Pro-Q DPS染料進(jìn)行磷酸化蛋白染色，并用ImageMaster 6.0軟件選取有明顯熒光信號的122個(gè)磷酸化蛋白點(diǎn)進(jìn)行定量差異分析，并與SYPRO Ruby染色膠圖進(jìn)行匹配。

圖1 用兩種熒光染料對雄性大鼠肝臟進(jìn)行染色的2-DE凝膠膠圖 注：A，Pro-Q DPS 磷酸化蛋白染色；B，SYPRO Ruby全蛋白染色。Fig. 1 2-DE images of hepatic proteins from male rats stained sequentially with two dyesNote:A, Pro-Q DPS stained phosphoproteins; B, SYPRO Ruby stained general proteins.

圖2 差異磷酸化蛋白在Pro-Q DPS染色2-DE膠圖上的分布 注：A，18個(gè)成功鑒定的磷酸化蛋白點(diǎn)在對照組Pro-Q DPS染色膠圖的位置，注釋為Spot No；B，蛋白點(diǎn)15、16在不同處理組的磷酸化水平；C，蛋白點(diǎn)14在不同處理組的磷酸化水平；Ctr，對照組，PFDoA 0.2，0.2 mg·kg-1·d-1 PFDoA處理組，PFDoA 0.5，0.5 mg·kg-1·d-1 PFDoA處理組。Fig. 2 Representative 2-DE image for differentially expressed phosphoproteins from rat liver (Pro-Q DPS stained-gel) Note:A, 18 spots of identified phosphoprotein from rat liver in control group. B, Phosphorylation levels of spots 15 and 16 in different groups; C, Phosphorylation levels of spots 14 in different groups; Ctr, Control; PFDoA 0.2, 0.2 mg·kg-1·d-1 PFDoA group; PFDoA 0.5, 0.5 mg·kg-1·d-1 PFDoA group.

表1 PFDoA暴露110 d后大鼠肝臟磷酸化差異蛋白鑒定列表

注：aSpot No. 參考圖1；b是否已確認(rèn)為大鼠磷酸化蛋白(Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索磷酸化位點(diǎn))，Y已確定(具有磷酸化位點(diǎn)信息)，N未確定(無磷酸化位點(diǎn)信息)；c生物學(xué)功能分類。

Note:aSpots No. referring to Fig.1；bKnown (Y) or unknown (N) rat phosphoproteins (searched the phosphorylated sites in Uniprot Database);cIdentified proteins were grouped according to their functions.

經(jīng)分析，30個(gè)磷酸化蛋白表達(dá)水平在PFDoA處理后發(fā)生顯著變化(P<0.05)。其中25個(gè)差異磷酸化蛋白點(diǎn)在銀染膠上進(jìn)行匹配，挖點(diǎn)后通過MALDI TOF/TOF質(zhì)譜對蛋白性質(zhì)進(jìn)行鑒定。18個(gè)蛋白點(diǎn)被成功鑒定，圖2顯示了它們在2-DE凝膠圖上的分布情況，蛋白性質(zhì)及磷酸化水平差異如表1所示。其中，磷酸化水平上調(diào)的有15個(gè)，而下調(diào)僅為3個(gè)。熱休克蛋白Hspd1、Hspab1在0.5 mg·kg-1·d-1PFDoA處理下磷酸化水平顯著升高(P < 0.05)，而Hspa8的磷酸化水平在低濃度組顯著降低，但變化倍數(shù)不大。酰基CoA硫解酶(Cte1)在PFDoA作用下分別上調(diào)1.75倍和2.21倍，但低濃度組差異不顯著(P>0.05)；另外，琥珀酰CoA連接酶(Suclg2)磷酸化水平在低濃度組(0.2 mg·kg-1·d-1)上調(diào)1.14倍(P < 0.05)。

2.3 生物信息學(xué)分析及蛋白含量分析

對18個(gè)MAIDI TOF/TOF鑒定的差異蛋白進(jìn)行UniProt數(shù)據(jù)庫搜索(http://www.uniprot.org/)，發(fā)現(xiàn)10個(gè)蛋白在大鼠中的磷酸化位點(diǎn)已知(表1)，而其他8個(gè)蛋白是否是磷酸化蛋白及其在哺乳動物中的磷酸化位點(diǎn)還需進(jìn)一步研究。

另外，我們對18個(gè)成功鑒定的蛋白進(jìn)行GO生物學(xué)功能和KEGG生物學(xué)通路分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要參與應(yīng)激防御、脂類代謝、糖代謝、氨基酸代謝和電子傳遞等功能(表1)。其中，4個(gè)磷酸化蛋白參與糖代謝過程，包括Suclg2、Fbp1、葡萄糖磷酸變位酶(Pgm1)和丙酮酸激酶(L-PK)。另一大類是應(yīng)激和免疫防御功能的蛋白，其中4個(gè)蛋白點(diǎn)屬于熱休克蛋白(Hspa8、Hspd1和Hsp90ab1)。

另外，進(jìn)一步用Western blot方法分析大鼠肝臟Fbp1的蛋白水平及Hsp90ab1的蛋白水平和磷酸化水平變化，如圖3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFDoA暴露110 d后，大鼠肝臟Fbp1蛋白水平變化不顯著(P>0.05)，而Hsp90ab1的總蛋白水平在0.5 mg·kg-1·d-1PFDoA處理組顯著升高，同時(shí)磷酸化水平在2個(gè)處理組均顯著升高(P<0.05)，可見Pro-Q DPS染色方法有一定的準(zhǔn)確性。

3 討論(Discussion)

PFDoA是含12個(gè)碳原子的PFAS，目前在水、土壤、野生動物及人體血清中均檢測到[15-16]。已被證實(shí)其毒性大于短鏈PFASs[17]，并可以引起肝臟腫大、血脂紊亂、性激素失調(diào)及睪丸損傷等[18-19]。其中，用不同濃度PFDoA(0、0.02、0.05、0.2和0.5 mg·kg-1·d-1)暴露雄性大鼠110 d后，各處理組肝臟相對重量和絕對重量顯著增加，其中0.2和0.5 mg·kg-1·d-1處理組血清葡萄糖、堿性磷酸酶(ALP)活性和總膽汁酸(TBA)水平顯著增加，肝臟出現(xiàn)脂肪空泡化及壞死現(xiàn)象，且最高濃度組肝臟出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)過氧化[8,[20]。為了從翻譯后修飾水平進(jìn)一步研究PFDoA致肝臟毒性作用機(jī)制，我們選擇0、0.2和0.5 mg·kg-1·d-1PFDoA處理組大鼠肝臟，采用與2-DE蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與ProQ DPS磷酸化蛋白染色結(jié)合的方法對不同劑量PFDoA暴露110 d大鼠肝臟磷酸化蛋白進(jìn)行了初步分析。

糖代謝包括糖異生和糖酵解過程。本實(shí)驗(yàn)中，糖異生過程的關(guān)鍵酶Fbp1磷酸化水平在0.2 mg·kg-1·d-1PFDoA處理組顯著上調(diào)，而總蛋白表達(dá)量未發(fā)生明顯變化，說明其磷酸化水平的變化不依賴于總蛋白量的升高，但PFDoA對其具體的作用途徑還不清楚。目前，F(xiàn)bp1活性被認(rèn)為是通過變構(gòu)效應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，ADP、AMP、2，6-二磷酸果糖(FBP2)是其主要的變構(gòu)激活劑；而在正常哺乳動物肝細(xì)胞中其磷酸化水平的變化與催化活性的影響還不清楚[21]，因此，我們還尚不能由此推斷PFDoA對大鼠肝臟糖異生途徑的影響。Pgm1是半乳糖進(jìn)入糖酵解途徑的催化酶。Gururai等[22]研究發(fā)現(xiàn)信號傳遞蛋白p21-活化蛋白激酶1(Pak1)通過介導(dǎo)Pgm1磷酸化而增強(qiáng)Pgm1的活性。由此可見本實(shí)驗(yàn)中Pgm1磷酸化水平升高可以促進(jìn)其催化活性的增加，使半乳糖生成的1-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖的速度增加，從而加速肝臟對半乳糖的分解利用，并對糖酵解途徑產(chǎn)生促進(jìn)作用。丙酮酸激酶(Pk)是糖酵解途徑的重要調(diào)節(jié)酶，其L型同功酶(L-Pk)可與磷酸烯醇式丙酮酸結(jié)合催化其形成丙酮酸，它的催化反應(yīng)速度被磷酸化和去磷酸化所調(diào)節(jié)。血糖水平低時(shí)，高血糖素的級聯(lián)放大系統(tǒng)可以使丙酮酸激酶磷酸化，成為活性低的形式，而去磷酸化的酶活性較高。本實(shí)驗(yàn)中，不同劑量PFDoA暴露后大鼠肝臟L-Pk磷酸化水平顯著下調(diào)，分別為對照組的-2.61和-6.40倍，說明在蛋白表達(dá)量不變的情況下L-Pk催化活性增加，從而加速酵解過程，這可能由于PFDoA暴露后大鼠血糖和肝臟葡萄糖的積累[8]對L-Pk的磷酸化狀態(tài)起到一定調(diào)節(jié)作用。而芯片結(jié)果顯示0.2 mg·kg-1·d-1處理組L-Pk mRNA表達(dá)水平顯著降低[8]，因此需要進(jìn)一步對其蛋白表達(dá)量及酶活性進(jìn)行驗(yàn)證，以確定PFDoA對L-Pk的具體作用方式及意義。

圖3 Western blot分析PFDoA暴露110 d后大鼠肝臟Fbp1蛋白水平變化、Hsp90ab1蛋白水平及磷酸化水平的變化Fig. 3 Protein levels of Fbp1, Hsp90ab1 and phosphorylation levels of Hsp90ab1 in rat liver exposed to PFDoA for 110 days by Western blot analysis

糖酵解過程產(chǎn)生的丙酮酸氧化脫羧形成乙酰CoA，并經(jīng)三羧酸循環(huán)最終生成CO2和H2O。Suclg2在三羧酸循環(huán)過程中將琥珀酰CoA轉(zhuǎn)化成琥珀酸，目前還沒有有關(guān)確認(rèn)Suclg2是磷酸化蛋白的報(bào)道，UniProt數(shù)據(jù)庫中也沒有其磷酸化位點(diǎn)的信息。而本實(shí)驗(yàn)中Suclg2可以被Pro-Q Diamond磷酸化染料染色，且表達(dá)量在0.2 mg·kg-1·d-1PFDoA處理組顯著升高，與我們之前DIGE結(jié)果中總蛋白水平變化趨勢一致[20]。Roux等[23]對不同發(fā)育階段海膽卵的磷酸化蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Suclg2可被Pro-Q Diamond染色并在不同發(fā)育階段表達(dá)量不同。因此，Suclg2可能是非特異性染色蛋白，我們觀察到的是總蛋白的變化，但也可能是一種磷酸化蛋白，PFDoA作用下其磷酸化水平的升高與總蛋白水平的變化有關(guān)，但可以肯定的是PFDoA對Suclg2的誘導(dǎo)首先體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，促進(jìn)蛋白表達(dá)量的增加，繼而加速TCA循環(huán)。

與Suclg2類似，脂肪酸代謝過程中的Cte1磷酸化情況也未見報(bào)道，并且本實(shí)驗(yàn)中Cte1 蛋白點(diǎn)的Pro-Q Diamond磷酸化染色較淺(圖2A，蛋白點(diǎn)20)，說明其磷酸化水平很低或?qū)儆诜翘禺愋匀旧?。已有研究顯示PFDoA作用下Cte1 mRNA和蛋白水平均顯著升高[20]，因此0.5 mg·kg-1·d-1處理組表達(dá)量的升高可能反映了總蛋白量的變化。甘油激酶(GK)是甘油代謝的限速酶，甘油被運(yùn)輸?shù)礁闻K，被GK磷酸化形成3-磷酸甘油，進(jìn)入糖酵解途徑分解或用于糖異生。有研究表明硬壁菌鉛黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)和嗜熱菌(Thermus flavus )GK可以受磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)介導(dǎo)使組氨酸殘基發(fā)生磷酸化從而增強(qiáng)其活性，且活性變化程度具有種屬差異[24]，而大鼠等哺乳動物中GK的磷酸化修飾情況還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中大鼠肝臟GK的Pro-Q DPS染色顏色較深(蛋白點(diǎn)6)，說明其磷酸化程度較高，而高濃度組GK的磷酸化水平顯著降低，是否因此改變酶活性從而影響甘油代謝途徑還需進(jìn)一步研究。

另一類差異磷酸化蛋白是與氧化應(yīng)激和免疫防御相關(guān)的熱休克蛋白，包括Hsp90家族的Hsp90ab1、Hsp70家族的Hspa8及Hsp60家族的Hspd1，高溫或生理上的刺激都可以激發(fā)它們的合成。它們以磷酸化蛋白的形式在體內(nèi)存在，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的作用。已有研究表明高溫刺激、腎上腺切除或劇烈運(yùn)動可使大鼠肝臟Hsp70s的磷酸化狀態(tài)發(fā)生改變[25]，TCDD可顯著增加人肝細(xì)胞Hspa5的磷酸化水平[26]，但磷酸化對Hsp70s功能的影響還不清楚；Kulathingal等[27]發(fā)現(xiàn)α突觸核蛋白的積累能顯著降低3D5細(xì)胞Hsp90α/β的磷酸化水平；另外Barati等[28]研究發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞中絲氨酸-蘇氨酸激酶(Akt)能使熱休克蛋白Hsp70、Hsp90α/β等磷酸化，并認(rèn)為腎細(xì)胞受到物理或病理刺激后Akt介導(dǎo)的熱休克蛋白磷酸化對調(diào)節(jié)分子伴侶的功能有重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，Hspd1和Hspab1在高濃度處理組磷酸化水平顯著升高，而Hspa8的磷酸化水平在低濃度組顯著降低，考慮到熱休克蛋白維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能的重要性，有必要進(jìn)一步研究PFDoA引起的Hsps磷酸化水平的變化對Hsps功能的影響。

本文通過2-DE和Pro-Q DPS磷酸化蛋白染色法對PFDoA引起的大鼠肝臟磷酸化蛋白組的變化進(jìn)行了初步分析。發(fā)現(xiàn)PFDoA處理組中一些磷酸化蛋白水平發(fā)生變化，這些蛋白涉及多個(gè)生物學(xué)過程，如脂類代謝、糖代謝、氨基酸代謝、應(yīng)激防御及呼吸鏈氧化磷酸化等途徑，這為我們從翻譯后修飾水平進(jìn)一步了解PFDoA的毒性作用提供了依據(jù)。但其中多數(shù)蛋白磷酸化位點(diǎn)的功能及磷酸化修飾水平對相關(guān)蛋白功能的影響還不清楚。因此，需要進(jìn)一步研究并完善蛋白修飾位點(diǎn)及其功能，為揭示環(huán)境污染物的毒性提供基礎(chǔ)。

[1] Giesy J P, Kannan K. Perfluorochemical surfactants in the environment [J]. Environmental Science & Technology, 2002, 36(7): 146A-152A

[2] Lau C, Anitole K, Hodes C, et al. Perfluoroalkyl acids: A review of monitoring and toxicological findings [J]. Toxicological Sciences, 2007, 99(2): 366-394

[3] Lau C, Butenhoff J L, Rogers J M. The developmental toxicity of perfluoroalkyl acids and their derivatives [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2004, 198(2): 231-241

[4] Kennedy G L Jr, Butenhoff J L, Olsen G W, et al. The toxicology of perfluorooctanoate [J]. Critical Reviews in Toxicology, 2004, 34(4): 351-384

[5] Guruge K S, Yeung L W, Yamanaka N, et al. Gene expression profiles in rat liver treated with perfluorooctanoic acid (PFOA) [J]. Toxicological Sciences, 2006, 89(1): 93-107

[6] Rosen M B, Abbott B D, Wolf D C, et al. Gene profiling in the livers of wild-type and PPARalpha-null mice exposed to perfluorooctanoic acid [J]. Toxicologic Pathology, 2008, 36(4): 592-607

[7] Rosen M B, Schmid J R, Corton J C, et al. Gene expression profiling in wild-type and PPARalpha-null mice exposed to perfluorooctane sulfonate reveals PPARalpha-Independent effects [J]. PPAR Research, 2010, DOI: 10.1155/2010/794739

[8] Ding L, Hao F, Shi Z, et al. Systems biological responses to chronic perfluorododecanoic acid exposure by integrated metabonomic and transcriptomic studies [J]. Journal of Proteome Research, 2009, 8(6): 2882-2891

[9] Gatzka M, Walsh C M. Apoptotic signal transduction and T cell tolerance [J]. Autoimmunity, 2007, 40(6): 442-452

[10] Hanahan D, Weinberg R A. The hallmarks of cancer [J]. Cell, 2000, 100(1): 57-70

[11] Taniguchi C M, Emanuelli B, Kahn C R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action [J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2006, 7(2): 85-96

[12] Charbonneau H, Tonks N K. 1002 protein phosphatases? [J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 1992, 8: 463-493

[13] 晏光榮, 曹亞. 蛋白質(zhì)組學(xué)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用 [J]. 生命的化學(xué), 2004, 24(1): 10-12

[14] Steinberg T H, Agnew B J, Gee K R, et al. Global quantitative phosphoprotein analysis using Multiplexed Proteomics technology [J]. Proteomics, 2003, 3(7): 1128-1144

[15] Guruge K S, Taniyasu S, Yamashita N, et al. Perfluorinated organic compounds in human blood serum and seminal plasma: A study of urban and rural tea worker populations in Sri Lanka [J]. Journal of Environmental Monitoring, 2005, 7(4): 371-377

[16] Olsen G W, Ellefson M E, Mair D C, et al. Analysis of a homologous series of perfluorocarboxylates from American Red Cross adult blood donors, 2000-2001 and 2006 [J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(19): 8022-8029

[17] Kudo N, Suzuki-Nakajima E, Mitsumoto A, et al. Responses of the liver to perfluorinated fatty acids with different carbon chain length in male and female mice: In relation to induction of hepatomegaly, peroxisomal beta-oxidation and microsomal 1-acylglycerophosphocholine acyltransferase [J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2006, 29(9): 1952-1957

[18] Zhang H, Shi Z, Liu Y, et al. Lipid homeostasis and oxidative stress in the liver of male rats exposed to perfluorododecanoic acid [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2008, 227(1): 16-25

[19] Shi Z, Zhang H, Ding L, et al. The effect of perfluorododecanonic acid on endocrine status, sex hormones and expression of steroidogenic genes in pubertal female rats [J]. Reproductive Toxicology, 2009, 27(3-4): 352-359

[20] Liu H, Zhang H, Cui R, et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor alpha ameliorates perfluorododecanoic acid-induced production of reactive oxygen species in rat liver [J]. Archives of Toxicology, 2016, 90(6): 1383-1397

[21] Rakus D, Zarzycki M, Dzugaj A. Rabbit muscle fructose-1,6-bisphosphatase is phosphorylated in vivo [J]. Acta Biochimica Polonica, 2003, 50(1): 115-121

[22] Gururaj A, Barnes C J, Vadlamudi R K, et al. Regulation of phosphoglucomutase 1 phosphorylation and activity by a signaling kinase [J]. Oncogene, 2004, 23(49): 8118-8127

[23] Roux M M, Radeke M J, Goel M, et al. 2DE identification of proteins exhibiting turnover and phosphorylation dynamics during sea urchin egg activation [J]. Developmental Biology, 2008, 313(2): 630-647

[24] Yeh J I, Kettering R, Saxl R, et al. Structural characterizations of glycerol kinase: Unraveling phosphorylation-induced long-range activation [J]. Biochemistry, 2009, 48(2): 346-356

[25] Gonzalez B, Manso R. Induction, modification and accumulation of HSP70s in the rat liver after acute exercise: Early and late responses [J]. The Journal of Physiology, 2004, 556(Pt 2): 369-385

[26] Kim J H, In Y J, Kim W K, et al. Differential signatures of protein glycosylation and phosphorylation in human Chang liver cells induced by TCDD treatment [J]. Toxicology Letters, 2008, 178(1): 20-28

[27] Kulathingal J, Ko L W, Cusack B, et al. Proteomic profiling of phosphoproteins and glycoproteins responsive to wild-type alpha-synuclein accumulation and aggregation [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2009, 1794(2): 211-224

[28] Barati M T, Rane M J, Klein J B, et al. A proteomic screen identified stress-induced chaperone proteins as targets of Akt phosphorylation in mesangial cells [J]. Journal of Proteome Research, 2006, 5(7): 1636-1646

◆

Chronic Exposure of PFDoA Affect the Phosphorylation Levels of Proteins in Rat Liver

Zhang Hongxia, Cui Ruina, Dai Jiayin*

Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances (PFASs), an emerging kind of persistent organic pollutant, have been widely used in commercial and industrial products due to their unique physicochemical properties. PFASs have various toxicities to the living system. Perfluorododecanoic acid (PFDoA) with twelve carbon atoms, has broad industrial applications and is widely distributed in both wildlife and the environment. However, unlike other PFASs with short carbon chains, up to date limited studies have been performed on the toxic effects of PFDoA on animals. To reveal the mechanism of PFDoA hepatotoxicity, male rats were exposed to PFDoA for 110 days and the phosphoprotein profiles in the rat liver were analyzed by 2-DE methods coupled with Pro-Q Dimond phosphoprotein stain (Pro-Q DPS). The results showed significant change in the phosphorylation levels of 30 proteins after PFDoA exposure. Among them, 18 proteins were identified successfully by MALDI-TOF/TOF MS analysis. After bioinformatics analysis, these identified phosphoproteins were found to be involved in lipid metabolism, glucose metabolism, stress and immune response, electron transport, and so on. The results presented in this study will provide basic data for further study of the mechanism of PFDoA hepatotoxicity at the post-translational modification level.

PFDoA; rat; hepatotoxicity; phosphoprotein; Pro-Q Diamond

10.7524/AJE.1673-5897.20150818003

國家自然科學(xué)基金(31320103915; 21377128)

張紅霞(1981-)，女，助理研究員，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: zhanghx@ioz.ac.cn；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: daijy@ioz.ac.cn

2015-08-18 錄用日期：2015-10-15

1673-5897(2016)2-266-09

X171.5

A

簡介：戴家銀(1965—)，男，博士，中國科學(xué)院動物研究所研究員，主要從事持久性污染物的生態(tài)毒理學(xué)研究工作，發(fā)表學(xué)術(shù)論文80余篇。

張紅霞，崔瑞娜，戴家銀. 全氟十二烷酸(PFDoA)慢性暴露干擾大鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)水平[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(2): 266-274

Zhang H X, Cui R N, Dai J Y. Chronic exposure of PFDoA affect the phosphorylation levels of proteins in rat liver [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 266-274 (in Chinese)