方章順，姚志峰，王婷，林志芬，左勝鵬,*

1. 安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，蕪湖 241002 2. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092

?

典型抗生素與群體感應(yīng)抑制劑對(duì)費(fèi)氏弧菌的三元慢性聯(lián)合毒性

方章順1，姚志峰2，王婷2，林志芬2，左勝鵬1,*

1. 安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，蕪湖 241002 2. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092

群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitor, QSIs)廣泛應(yīng)用之后與環(huán)境中現(xiàn)有抗菌藥物共存的趨勢(shì)不可避免。為了評(píng)價(jià)QSIs和現(xiàn)有抗菌藥物共存所引起的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)，本文以費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)作為模式生物，磺胺類抗生素磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺類增效劑甲氧芐嘧啶(TMP)和群體感應(yīng)抑制劑4-溴-5-溴亞甲基-2(5氫)-呋喃酮(FC-30)為研究對(duì)象，測(cè)定了以上3個(gè)化合物對(duì)Vibrio fischeri的單一/混合慢性毒性效應(yīng)。單一慢性毒性結(jié)果表明，3個(gè)化合物的毒性大小如下：FC-30

抗生素；群體感應(yīng)抑制劑；費(fèi)氏弧菌；三元混合；慢性毒性；聯(lián)合毒性

Received 2 November 2015 accepted 30 November 2015

抗生素自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因其對(duì)病原微生物的特異性，進(jìn)而無(wú)節(jié)制大量使用[1]。隨著抗生素使用量的逐漸增加，全球每年僅獸用抗生素的消費(fèi)總量就達(dá)到100 000～200 000 t[2-3]。Thomas等[4]研究了全球抗生素用量的變化，結(jié)果顯示近十年來(lái)抗生素用量增加了36%，其中以中國(guó)為主的5個(gè)國(guó)家抗生素用量占增加的76%。抗生素濫用造成的抗性基因問(wèn)題引起了廣泛關(guān)注[1-5]，尋找抗生素替代品是目前解決抗性基因的重要途徑。群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitor, QSI)是目前提出較為理想的抗生素替代品?？筛蓴_細(xì)菌的群體感應(yīng)，進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。QSI與抗生素的聯(lián)合使用使得細(xì)菌對(duì)后者的敏感心增加，因此研究者可以嘗試用低劑量的抗生素和QSI聯(lián)合用藥，這可能會(huì)起到更好的效果。另外，如果QSI在未來(lái)大量使用，那它與抗生素在環(huán)境中共存的可能性極大，因此對(duì)QSI與抗生素聯(lián)合毒性進(jìn)行研究是必要的，可為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供借鑒意義。

磺胺類抗生素(sulfonamides, SAs)在1937年被發(fā)現(xiàn)，因其對(duì)細(xì)菌具有廣譜抗菌性、療效高、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)成為最早系統(tǒng)性藥用的抗生素之一?；前奉惪股夭灰捉到?，屬于新型的POPs[6]。在選用抗菌藥物時(shí)，為了達(dá)到更好的療效，降低治療過(guò)程會(huì)產(chǎn)生的副作用，臨床醫(yī)生常常采用聯(lián)合用藥的方式。TMP是磺胺類抗生素常用的增效劑，臨床上常常聯(lián)合使用，因此二者在環(huán)境中聯(lián)合存在的可能性較高。呋喃酮類化合物是研究最早的QSI，被證實(shí)具有良好的群體感應(yīng)效應(yīng)的拮抗作用，能有效抑制生物膜的形成，有良好的抑菌效果[7]，未來(lái)被臨床上應(yīng)用的可能性較大，一旦其進(jìn)入環(huán)境中，必定與現(xiàn)有的SAs和TMP聯(lián)合存在。所以三者聯(lián)合毒性研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本課題組前期對(duì)SAs和TMP的聯(lián)合毒性，以及SAs和QSI的聯(lián)合毒性進(jìn)行了初步研究[8-14]，研究發(fā)現(xiàn)SAs和TMP的急性聯(lián)合效應(yīng)為協(xié)同，慢性聯(lián)合效應(yīng)為拮抗，并指出急慢性毒性過(guò)程中作用蛋白不同是導(dǎo)致聯(lián)合效應(yīng)不同的根本原因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大部分呋喃酮類化合物與磺胺類抗生素的急性聯(lián)合毒性為協(xié)同作用。三元慢性毒性還未涉及，那么，QSI與抗生素的慢性聯(lián)合效應(yīng)如何；在評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性時(shí)，對(duì)環(huán)境的影響如何？這是本研究所關(guān)注和所要回答的問(wèn)題。

費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)作為典型的革蘭氏陰性菌，特別是作為抗生素及QSI的靶生物，在聯(lián)合毒性效應(yīng)研究中已被廣泛應(yīng)用[15-16]。本研究以Vibrio fischeri作為模式生物，以環(huán)境中常被檢測(cè)出的SCP、TMP及FC-30作為研究對(duì)象，測(cè)定了3種藥物對(duì)Vibrio fischeri的單一慢性毒性和三元混合慢性毒性，并回答聯(lián)合效應(yīng)的原因，為環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)使用化合物均購(gòu)自Sigma-Aldrich化學(xué)制品有限公司(St. Louis, MO, USA)，具體試劑信息如表1所示。進(jìn)行慢性毒性測(cè)試所用化合物配制使用助溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，DMSO濃度均控制為1‰。

所用儀器及軟件：化學(xué)發(fā)光分析儀(BH9507，北京濱松光子技術(shù)股份有限公司)、高壓蒸汽滅菌鍋、精密電子天平(BT25，德國(guó)saryorius公司)、電子pH計(jì)(PH510，美國(guó)OAKTON公司)、超凈工作臺(tái)、全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱(ZSD-1430，上海智城分析儀器有限公司)、恒溫培養(yǎng)振蕩器、超聲波清洗器和恒溫鼓風(fēng)干燥箱等。

表1 實(shí)驗(yàn)用化合物名稱及結(jié)構(gòu)

1.2 Vibrio fischeri慢性毒性測(cè)定

1.2.1 菌種及培養(yǎng)及配制

Vibrio fischeri凍干粉購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所。培養(yǎng)基選擇參照供應(yīng)商提供的配方配制。菌液配制：在超凈工作臺(tái)中，取適量斜面三代菌種接入5 mL液體培養(yǎng)基，在22 ℃恒溫條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(12～16 h)成為藥瓶菌液。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的搖瓶菌液約0.2 mL，加入到20 mL的3%NaCl溶液中，磁力攪拌40 min后，此時(shí)菌液的發(fā)光強(qiáng)度平穩(wěn)，即可將菌液用于毒性測(cè)定。

1.2.2 毒性試驗(yàn)

本論文基于Microtox急性毒性測(cè)試原理[17]與水質(zhì)急性毒性測(cè)定發(fā)光[18]細(xì)菌法進(jìn)行毒性測(cè)試。在每一測(cè)試管中加入800 μL測(cè)試溶液(含預(yù)設(shè)濃度梯度待測(cè)化合物，不足800 μL部分使用2% NaCl溶液補(bǔ)齊)，振蕩1 min混勻。在上述測(cè)試溶液中加入200 μL工作菌液，統(tǒng)一振蕩1 min混勻。將加菌溶液于22 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(BHP9507)測(cè)定發(fā)光值。

1.2.3 毒性測(cè)試數(shù)據(jù)表征

化合物毒性用其對(duì)Vibrio fischeri的發(fā)光抑制率表述[19]，如式(1)所示：

其中，S表示測(cè)試樣的發(fā)光值，C表示空白平均發(fā)光值。

慢性聯(lián)合毒性采用指標(biāo)(TU)來(lái)表征，其計(jì)算方法如式(2)所示：

TU=CA/EC50A+CB/EC50B

其中，CA和CB是混合體系半數(shù)抑制效應(yīng)時(shí)單一污染物(A、B)在混合體系中的摩爾濃度(mol·L-1)；EC50A和EC50B分別是污染物單一污染時(shí)的半數(shù)效應(yīng)濃度。

根據(jù)Broderius[20]的研究，當(dāng)0.8TU1.2，認(rèn)為兩組分間存在加和效應(yīng)；當(dāng)TU1.2表明組分間存在拮抗效應(yīng)；當(dāng)TU0.8意味著組分間存在協(xié)同效應(yīng)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 SCP、TMP和FC-30對(duì)Vibrio fischeri的單一慢性毒性

測(cè)定了SCP、TMP和FC-30對(duì)Vibrio fischeri的單一慢性毒性，結(jié)果如圖1所示。

圖1 SCP、TMP和FC-30對(duì)Vibrio fischeri單一慢性毒性Fig. 1 The single toxicity of SCP, TMP and FC-30 to Vibrio fischeri

圖2 SCP、TMP和FC-30等毒性比組成的三元混合物慢性聯(lián)合毒性Fig. 2 The tertiary mixture toxicity of SCP, TMP and FC-30 at equal toxic ratio

從圖1中可以看出，3種化合物對(duì)Vibrio fischeri單一慢性毒性均呈現(xiàn)hormesis效應(yīng)，即低劑量促進(jìn)高劑量抑制的雙向劑量效應(yīng)關(guān)系。

此外，3種化合物的慢性毒性大小順序如下所示：FC-30(EC50=2.44×10-5mol·L-1)< SCP(EC50=7.78×10-6mol·L-1)

圖3 等毒性比組成的二元混合物慢性聯(lián)合毒性Fig. 3 The chronic mixture toxicity of binary mixture at equal toxic ratio

2.2 SCP、TMP和FC-30對(duì)Vibrio fischeri的三元聯(lián)合毒性作用

根據(jù)Lin等[21]提出的頂點(diǎn)假設(shè)理論可知，當(dāng)化合物各組分以等毒性比(1:1:1)混合時(shí)，聯(lián)合效應(yīng)最強(qiáng)。因此本文根據(jù)單一化合物的慢性毒性結(jié)果，在等毒性比的情況下，測(cè)定了SCP、TMP和FC-30三元混合物對(duì)Vibrio fischeri的慢性混合毒性，結(jié)果如圖2所示

從圖2可以看出，與單一毒性結(jié)果相似，三元混合物的慢性毒性也呈現(xiàn)hormesis效應(yīng)。此外，根據(jù)公式(2)計(jì)算了混合體系的聯(lián)合效應(yīng)，結(jié)果顯示TU為2.3，說(shuō)明了三元混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng)為拮抗作用。

前期研究表明SAs和TMP的二元慢性聯(lián)合效應(yīng)為協(xié)同，而本文研究表明SCP、TMP和FC-30的三元混合物的聯(lián)合效應(yīng)為拮抗，那么三元混合物產(chǎn)生拮抗作用的原因是什么呢?

2.3 SCP、TMP和FC-30對(duì)Vibrio fischeri的二元聯(lián)合毒性作用

為了回答以上問(wèn)題，以SCP、TMP和FC-30在三元混合體系中的濃度(CSCP=2.93×10-5mol·L-1，CTMP=3.72×10-6mol·L-1，CFC-30=9.76×10-5mol·L-1)為基礎(chǔ)，分別建立了相應(yīng)的二元混合體系，即SCP+TMP，SCP+FC-30和TMP+FC-30，并測(cè)定了二元混合體系對(duì)Vibrio fischeri的慢性毒性，結(jié)果如圖3所示。

由圖3(a)可知，SCP和TMP在毒性比為1:1時(shí)，TU值為0.2，說(shuō)明二者聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同作用。而圖3(b, c)中，在毒性比1:1時(shí)，SCP+FC-30和TMP+FC-30兩個(gè)混合體系的最大抑制率未超過(guò)6%，這說(shuō)明二者混合暴露的毒性小于單一化合物暴露毒性相加，即FC-30與SCP和FC-30與TMP的兩個(gè)混合體系的相互作用皆為拮抗?？梢?jiàn)FC-30與SCP或TMP之間的拮抗作用是導(dǎo)致3種化合物聯(lián)合用藥時(shí)聯(lián)合效應(yīng)為拮抗作用的根本原因。

那么，在聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)中，應(yīng)該考慮到在慢性毒性條件下，QSI和磺胺類抗生素聯(lián)合用藥時(shí)可能產(chǎn)生拮抗作用。

綜上可知：

(1)本文測(cè)定了SCP、TMP以及FC-30對(duì)Vibrio fischeri的單一慢性毒性，結(jié)果表明SCP、TMP和FC-30對(duì)Vibrio fischeri單一慢性毒性均呈現(xiàn)hormesis效應(yīng)，毒性大小順序如下TMP>SCP>FC30。

(2)測(cè)定了SCP、TMP和FC-30對(duì)Vibrio fischeri的三元聯(lián)合慢性毒性，結(jié)果表明聯(lián)合效應(yīng)為拮抗。并指出FC-30和SCP以及FC-30和TMP二元混合體系的拮抗作用導(dǎo)致了三元混合體系聯(lián)合作用為拮抗。

(3)在毒性評(píng)價(jià)中，F(xiàn)C-30與SCP或TMP聯(lián)合時(shí)具有拮抗作用，對(duì)環(huán)境的影響小。

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◆

Chronic Joint Toxicity of Sulfa Antibiotics and Quorum Sensing Inhibitors toVibriofischeri

Fang Zhangshun1, Yao Zhifeng2, Wang Ting2, Lin Zhifen2, Zuo Shengpeng1,*

1. College of Environmental Science and Engineering, Anhui Normal University, Wuhu 241002, China 2. College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China

Being promising antibiotic alternatives, quorum sensing inhibitors (QSIs) will unavoidably coexist with the existing antibiotic drugs after its wide application. To assess the joint toxicity of QSIs and existing antibiotic chemicals, sulfachloropyridazine (SCP), its synergist-trimethoprim (TMP) and furanone C-30 (FC30), a kind of QSIs) were selected as objects, and we determined their single/mixture chronic toxicity on Vibrio fischeri. The results showed that the order of single chronic toxicity was FC30 < SCP

antibiotics; quorum sensing inhibitors; Vibrio fischeri; tertiary mixture; chronic toxicity; joint toxicity

10.7524/AJE.1673-5897.20151102001

污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題資助(PCRRK16007)；中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金(201177092，21377096，21577105)；同濟(jì)大學(xué)“攀登”計(jì)劃(0400219287)；111項(xiàng)目，上海市科技委員會(huì)(14DZ2261100)資助；安徽師范大學(xué)2015度研究生科研創(chuàng)新與實(shí)踐項(xiàng)目

方章順(1991-)，男，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锒纠韺W(xué)，E-mail: 15801769917@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: whmzsp79@ahnu.edu.cn

2015-11-02 錄用日期：2015-11-30

1673-5897(2016)2-369-05

X171.5

A

簡(jiǎn)介：左勝鵬(1979— )男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境生態(tài)學(xué)、入侵生態(tài)學(xué)、農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)等研究。

方章順, 姚志峰, 王婷, 等. 典型抗生素與群體感應(yīng)抑制劑對(duì)費(fèi)氏弧菌的三元慢性聯(lián)合毒性[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(2): 369-373

Fang Z S, Yao Z F, Wang T, et al. Chronic joint toxicity of sulfa antibiotics and quorum sensing inhibitors to Vibrio fischeri [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 369-373 (in Chinese)