重組蛋白sCAR?TMTP1增強(qiáng)腺病毒對骨肉瘤細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染效率的研究

羅丹楓 龔靜吉 程騰 魏睿 魏軍成 祝文濤

·實(shí)驗(yàn)研究論著·

重組蛋白sCAR?TMTP1增強(qiáng)腺病毒對骨肉瘤細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染效率的研究

羅丹楓 龔靜吉 程騰 魏睿 魏軍成 祝文濤

目的提高腺病毒（adenovirus,ADV）在缺乏柯薩奇腺病毒受體（coxsackie and adenovirus receptor,CAR）的骨肉瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。方法通過昆蟲（Bac?to?Bac）桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)含有CAR胞外段（sCAR）及TMTP1肽的重組蛋白（sCAR?TMTP1），并對其純化、鑒定。流式細(xì)胞儀分別檢測骨肉瘤細(xì)胞及人胚腎細(xì)胞293（HEK293）的CAR表達(dá)水平，ADV對其的感染效率及FITC?TMTP1的結(jié)合能力。重組蛋白sCAR?TMTP1與ADV共同孵育形成復(fù)合物，流式細(xì)胞儀研究其在缺乏CAR的骨肉瘤細(xì)胞（MG?63）中的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表達(dá)及純化的sCAR?TMTP1蛋白在相對分子質(zhì)量約31 000處可見特異蛋白條帶，感染的sf9細(xì)胞裂解上清可與兔抗小鼠sCAR單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。MG?63可與FITC?TMTP1特異結(jié)合，其CAR表達(dá)水平低，ADV轉(zhuǎn)染效率低。經(jīng)sCAR?TMTP1修飾后的ADV/GFP對MG?63細(xì)胞的感染效率顯著高于未經(jīng)修飾的含報告基因GFP的ADV（ADV/GFP）。結(jié)論重組蛋白sCAR?TM?TP1可顯著提升ADV對缺乏CAR的骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

骨肉瘤；腺病毒；TMTP1肽；柯薩奇腺病毒受體；重組蛋白；基因治療；腫瘤細(xì)胞

骨肉瘤（osteosarcoma）是最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，其極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早，其中最常見的是肺轉(zhuǎn)移。對于發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，常規(guī)進(jìn)行手術(shù)治療及化療，但臨床療效不佳，愈后不良，亟需探索發(fā)現(xiàn)新的治療模式［1］。

基因治療是一種有前景的新型治療策略，腺病毒（adenovirus,ADV）因具有轉(zhuǎn)染效率高、不整合到靶細(xì)胞基因組中、遺傳毒性低等優(yōu)點(diǎn)，已成為基因治療中最常見的病毒載體之一［2］。ADV對細(xì)胞的感染依賴于細(xì)胞表面表達(dá)的柯薩奇腺病毒受體（coxsack?ie and adenovirus receptor,CAR），但在腫瘤細(xì)胞表面，CAR的表達(dá)顯著下調(diào)［3］，使得重組ADV載體難以轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，影響了治療效果。因此，提高重組ADV載體對靶細(xì)胞的感染效率對于改善腫瘤基因治療的療效具有十分重要的意義。

對ADV載體纖維蛋白進(jìn)行修飾是提高其對宿主細(xì)胞感染效率的主要途徑之一。TMTP1肽是一類可以特異性識別腫瘤及其微小轉(zhuǎn)移的靶向多肽，可以偶聯(lián)核素、可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（soluble tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligands,sTRAIL）等基團(tuán)實(shí)現(xiàn)對多種腫瘤的靶向診療，具有良好的應(yīng)用前景［4?6］。本研究通過昆蟲（Bac?to?Bac）桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)含有CAR胞外段（sCAR）及TMTP1肽的重組蛋白（sCAR?TMTP1），用于與ADV的纖維蛋白的頭節(jié)（knob）形成嵌合體，并考察經(jīng)此修飾的ADV對CAR低表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

（一）質(zhì)粒、菌種、病毒與細(xì)胞系

含有CAR全長的真核表達(dá)質(zhì)粒pTOPOCAR由Jer?Tsong Hsieh教授（the University of Texas South?western Medical Center）惠贈。大腸桿菌DH10?BacTM、pFASTBACHTb載均購自Invitrogen公司，大腸桿菌株DH5α由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院同濟(jì)醫(yī)院腫瘤生物醫(yī)學(xué)中心（本中心）引進(jìn)并保存。含報告基因GFP的ADV（ADV/GFP）由本中心構(gòu)建［7］，病毒在人胚腎細(xì)胞293（HEK293；ATCC）中擴(kuò)增后，經(jīng)氯化銫超速離心純化、滴度測定后保存于-80℃冰箱。昆蟲細(xì)胞sf?9，人成骨肉瘤細(xì)胞系MG?63、Saos?2、U2OS均購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

（二）主要試劑

MiniBESTViral RNA/DNA Extraction KitVer 3.0試劑盒、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ、SolutionⅠDNA連接酶、ExTaq酶均購自大連寶生物工程有限公司。培養(yǎng)基MEM、DMEM、SF900Ⅱ和Grace、桿粒提取試劑盒PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司。FITC標(biāo)記的多肽TMTP1（GCGNVVRQCG）是本中心前期研究所獲得的一段可以特異結(jié)合高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞的短肽，由西安華辰公司合成。

（三）引物設(shè)計(jì)

嵌合體sCAR?TMTP1、嵌合體sCAR的基因引物均由上海英駿公司合成，兩者的NCBI號均為NC_000021.9（表1）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）重組蛋白sCAR?TMTP1及sCAR的構(gòu)建

利用基因島分析軟件分析獲得多肽TMTP1偏向于真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的核苷酸序列5′?GGCTGC GGTAACGTGGTAAGGCAAGGCTGC?3′，在其5′端加入與從GenBank獲得sCAR CDS末尾15個核苷酸，3′端加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，以此構(gòu)成嵌合體sCAR?TMTP1的下游長鏈引物。嵌合體sCAR?TMTP1上游引物序列由BamHⅠ及與sCAR CDS 1?16 bp互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，PCR擴(kuò)增sCAR，回收測序無誤后，插入pFASTBACHTb中構(gòu)成重組穿梭質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，雙酶切及PCR鑒定陽性克隆，并送生工生物工程（上海）有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒命名為pFastBac?HTB sCAR?TMTP1。參考Bac?to?Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)手冊，取重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH10BacTM，篩選鑒定后獲得重組桿粒Bacmid?sCAR?TMTP1。同法構(gòu)建桿粒Bacmid?sCAR。

（二）重組桿粒的表達(dá)、純化及分析

表1　基因引物序列

參看Bac?to?Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)手冊及文獻(xiàn)。收獲P3、P4、P5代重組桿狀病毒后，將0.05MOIP3和P4代重組桿狀病毒分別感染200m l懸浮培養(yǎng)的sf9細(xì)胞（2×106個/m l），27℃水浴搖床培養(yǎng)5 d，2 292 r/min，離心20min，收集沉淀、重懸，超聲破碎后，3 300 r/min，離心30min，收集上清液。應(yīng)用陽離子交換層析系統(tǒng)純化蛋白，收集感染P3和P4代重組桿狀病毒的細(xì)胞裂解及培養(yǎng)上清液，反復(fù)凍融3次，裂解細(xì)胞，然后低溫離心，收集細(xì)胞裂解液上清。將細(xì)胞裂解液上清液和病毒培養(yǎng)上清液分別加入蛋白的上樣緩沖液，沸水浴5min，取樣進(jìn)行12％SDS?PAGE分析。取純化后的蛋白，經(jīng)12％ SDS?PAGE分析后，半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2 h后，加入sCAR單克隆抗體Western Blot檢測。

（三）ADV/GFP感染效率測定

細(xì)胞按照2×105個/孔接種于6孔板，各株細(xì)胞分別設(shè)立對照組（不加入ADV/GFP）和實(shí)驗(yàn)組（加入0.1MOIADV/GFP）。第2天加入0.1MOI 2％FBS/ DMEM培養(yǎng)基稀釋的ADV/GFP 0.5 m l/孔。室溫孵育30 min，吸凈培養(yǎng)基，用2％FBS/DMEM洗孔板1次，加入2％FBS/DMEM 2m l/孔，37℃培養(yǎng)1 h后更換為完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞GFP表達(dá)的百分率。

（四）FITC?TMTP1的細(xì)胞結(jié)合及拮抗實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的HEK293及骨肉瘤細(xì)胞以4× 105個/孔種于12孔板內(nèi)，37℃培養(yǎng)過夜待貼壁完全后，胰酶消化細(xì)胞并PBS漂洗，以500μlDMEM重懸的細(xì)胞作為空白對照，F(xiàn)ITC?TMTP1組分別加入1、5、10μmol/L FITC?TMTP1培養(yǎng)基500μl重懸的細(xì)胞。利用未標(biāo)記的游離TMTP1進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞準(zhǔn)備：37℃培養(yǎng)箱孵育30min后，PBS漂洗2次，流式細(xì)胞儀檢測FITC標(biāo)記陽性率。為驗(yàn)證TMTP1與細(xì)胞結(jié)合的特異性，F(xiàn)ITC?TMTP1組預(yù)先用50μmol/L TMTP1于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后，PBS漂洗2次，再加入10μmol/L FITC?TMTP1上述孵育、漂洗步驟，然后流式細(xì)胞儀檢測FITC標(biāo)記陽性率。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后統(tǒng)計(jì)分析平均陽性率及標(biāo)準(zhǔn)誤。

（五）sCAR?TMTP1修飾前后的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

P4代細(xì)胞裂解及培養(yǎng)上清經(jīng)吸附柱3輪洗脫純化后的得到總量約300 ng重組蛋白sCAR?TMTP1，溶于10μl超純水-20℃保存。為探索最適濃度，取CAR低表達(dá)的MG?63細(xì)胞，按1×104個/孔的密度接種于96孔板中預(yù)實(shí)驗(yàn)，取30 ng的sCAR?TMTP1倍比稀釋與0.1 MOI 2％FBS/DMEM培養(yǎng)基稀釋的ADV/GFP 100μl混合，室溫孵育10min，加入吸凈原培養(yǎng)基96孔板中，繼續(xù)室溫孵育30min，吸凈培養(yǎng)基，用2％FBS/DMEM 2ml/孔洗孔板1次，37℃培養(yǎng)1 h后更換為完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下觀察各組熒光強(qiáng)度，篩選得出最適濃度為30μg/L。正式實(shí)驗(yàn)2×105個/孔接種于6孔板，分別設(shè)立對照組（單加入0.1MOIADV/ GFP）、sCAR?TMTP1組（加入0.1 MOIADV/GFP+ sCAR?TMTP1）、sCAR組（加入0.1 MOIADV/GFP+ sCAR）。第2天加入0.1MOI 2％FBS/DMEM培養(yǎng)基稀釋的ADV/GFP 0.5m l/孔，重復(fù)上述過程，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞GFP表達(dá)的百分率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、重組蛋白sCAR?TMTP1和sCAR的純化及鑒定

P3代重組桿狀病毒滴度為1.7×107pfu/m l（pfu= CCID 50×0.69）。P3、P4代重組桿狀病毒感染后的細(xì)胞裂解上清及培養(yǎng)上清經(jīng)吸附柱數(shù)輪的吸附、洗脫后經(jīng)12％SDS?PAGE分析，均可見相對分子質(zhì)量約31 000特異蛋白條帶（圖1）。純化的重組蛋白經(jīng)SDS?PAGE及Western Blot分析，也在在相對分子質(zhì)量約31 000處，均可見特異的蛋白條帶，并可與兔抗小鼠sCAR單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。嵌合體sCAR?TMTP1與嵌合體sCAR僅相差10個氨基酸的大小，兩者在條帶大小上比較并無明顯差別（圖2）。

圖1　純化后sCAR?TMTP1的SDS?PAGE分析M：蛋白Marker分子量；1～6分別代表第1～6輪洗脫樣品

二、骨肉瘤細(xì)胞株中CAR表達(dá)水平與ADV感染效率關(guān)系

流式細(xì)胞儀檢測不同骨肉瘤細(xì)胞株中CAR表達(dá)水平，以HEK293細(xì)胞作為陽性對照，MG?63的CAR表達(dá)水平最低（表2）。同時ADV/GFP以0.1 MOI分別感染上述細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測GFP蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞比率，HEK293為61.13％±1.22％，MG?63為2.92％±0.85％，Saos?2為13.20％±1.40％，U2OS為13.20％±1.40％。結(jié)果顯示ADV/GFP對不同骨肉瘤細(xì)胞株中的感染效率與其CAR表達(dá)水平具有正相關(guān)性。

圖2　表達(dá)產(chǎn)物的鑒定P4：第4代裂解上清；P3：第3代裂解上清；sCAR：加入第4代重組桿狀病毒（Bacmid?sCAR）的細(xì)胞裂解及培養(yǎng)上清；M：蛋白marker分子量

表2　不同細(xì)胞中CAR表達(dá)水平及ADV/GFP感染效率測定（±s，％）

表2　不同細(xì)胞中CAR表達(dá)水平及ADV/GFP感染效率測定（±s，％）

細(xì)胞系HEK293 MG?63 Saos?2 U2OS CAR表達(dá)的陽性率91.30±1.63 0.65±0.07 26.26±0.48 32.46±1.65細(xì)胞表達(dá)GFP蛋白的陽性率對照組0.50±0.04 0.46±0.05 0.47±0.04 0.49±0.03實(shí)驗(yàn)組61.13±1.22 2.92±0.85 13.20±1.40 18.07±0.40

三、TMTP1肽靶向結(jié)合部分骨肉瘤細(xì)胞

部分骨肉瘤細(xì)胞能夠與FITC?TMTP1結(jié)合，而且隨著FITC?TMTP1濃度的提升，多肽與細(xì)胞間的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)，與陰性對照HEK293細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。按實(shí)驗(yàn)方法中FITC?TMTP1的細(xì)胞結(jié)合及拮抗實(shí)驗(yàn)所述，當(dāng)使用50μmol/L TMTP1與10μmol/L FITC?TMTP1（5∶1）共同孵育細(xì)胞時，F(xiàn)ITC?TMTP1與骨肉瘤細(xì)胞株之間的結(jié)合被顯著抑制（圖3），提示TMTP1與骨肉瘤細(xì)胞的結(jié)合是特異性的。

四、重組蛋白sCAR?TMTP1增強(qiáng)ADV/GFP對MG?63細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

在摸索最適蛋白濃度時，我們發(fā)現(xiàn)在30μg/L sCAR?TMTP1蛋白與0.1MOIADV/GFP混合后，轉(zhuǎn)染MG?63細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度較對照組（0.1MOI ADV/GFP）提升8～10倍（圖4）。以此濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示sCAR?TMTP1組的熒光陽性率為28.5％±1.33％，相較對照組的6.3％±1.72％、sCAR組的7.4％±1.5％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而sCAR組僅加入含有sCAR的蛋白，與對照組比較并差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在對HEK293細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)時，sCAR?TMTP1組和sCAR組因重組sCAR蛋白事先與ADV上的knob結(jié)合，導(dǎo)致ADV對HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯下降（90％vs.47％，90％vs.55％）。提示ADV/GFP對MG?63細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的提升確實(shí)為重組蛋白sCAR?TMTP1所介導(dǎo)。

圖3　HEK293及骨肉瘤細(xì)胞株與FITC?TMTP1的結(jié)合能力的測定1、5和10μmol/L為1、5和10μmol/L FITC?TMTP1；Antag：10 μmol/L FITC?TMTP1+50μmol/L TMTP1。與1μmol/L比較，*P＜0.05；與10μmol/L比較，#P＜0.05

圖4　重組蛋白sCAR?TMTP1增強(qiáng)ADV/GFP對MG?63細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率與對照組比較，*P＜0.05，#P＞0.05

討論

ADV是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，它的諸多生物學(xué)特性：①能有效進(jìn)行增殖，有高滴度的重組病毒產(chǎn)量（通常＞1 010 pfu/ml），濃縮后仍可增加100倍；②除一些抗ADV感染的淋巴瘤細(xì)胞外，可在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因；③病毒基因組不整合到宿主細(xì)胞（除卵細(xì)胞）基因組中，減少了重組突變危險；④病毒基因組大，可插入大片段外源基因（至多可達(dá)35 kb）等，使其成為腫瘤的基因治療中的重要工具，目前已有多種溶瘤ADV被應(yīng)用于腫瘤治療的臨床前或臨床研究中，對其安全相關(guān)性及效用進(jìn)行了廣泛、深入地驗(yàn)證及評估［8?10］。

目前常用的以2型和5型ADV構(gòu)建而成的溶瘤ADV感染細(xì)胞均需首先通過其纖毛的knob與細(xì)胞表面的CAR黏附、結(jié)合，然后病毒纖毛基底部五鄰體表面的三肽RGD再與細(xì)胞表面的αvβ3和αvβ5整合素結(jié)合，再通過“內(nèi)化作用”進(jìn)入細(xì)胞從而完成基因轉(zhuǎn)錄及病毒DNA復(fù)制。而且研究表明sCAR已經(jīng)足以介導(dǎo)病毒與細(xì)胞結(jié)合及感染［11，12］。但CAR在許多原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)往往下調(diào)和缺失，并隨腫瘤分級和分期的升高而逐漸降低，而在一些正常組織（如：肝）卻可高表達(dá)CAR，使得ADV載體介導(dǎo)的基因治療效果受到明顯影響［13，14］。因而亟需采取相應(yīng)措施在病毒感染細(xì)胞階段進(jìn)行靶向調(diào)控，降低其對正常組織的親和感染，提高其對腫瘤細(xì)胞的特異性感染，從而提高病毒的腫瘤靶向性和溶瘤效應(yīng)。

為了解決此問題，常用的策略是通過基因工程技術(shù)對ADV的結(jié)構(gòu)蛋白基因進(jìn)行修飾，用新的短肽、抗體等特異性配體將整個病毒纖毛的knob加以替換或者將其插入knob的HI環(huán)上［15?17］。但此方法有著改造過程復(fù)雜，難以大量、經(jīng)濟(jì)地獲得所需要的病毒，且存在插入病毒基因組外源基因大小受限以及改造過程可能對病毒的正確組裝的帶來干擾等局限性。而具有雙特異性的適配子（bispecific adap?tor）成為了一種新的可供選擇的針對病毒外殼的修飾方式。適配子一端表達(dá)CAR的蛋白，另一端通過化學(xué)偶聯(lián)抗體或者表達(dá)特異的配體蛋白，適配子一方面通過CAR與ADV纖毛的knob牢固結(jié)合，封閉ADV的固有嗜性，另一方面通過偶聯(lián)的特異性的配體分子引導(dǎo)ADV實(shí)現(xiàn)特異的靶向結(jié)合。這樣既可以克服前述策略的局限性，又能簡單、高效地實(shí)現(xiàn)ADV的特異性靶向［18，19］。本研究旨在通過構(gòu)建含有一種新型腫瘤靶向多肽TMTP1和sCAR的適配子來實(shí)現(xiàn)提升ADV對CAR低表達(dá)腫瘤的細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效能。我們將短肽TMTP1的核酸序列設(shè)計(jì)并入擴(kuò)增sCAR的下游引物中，通過優(yōu)化長鏈PCR反應(yīng)條件，將測序正確的sCAR?TMTP1克隆入桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒，然后提取含有sCAR?TMTP1基因的重組Bacmid，將其轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞最終獲得重組表達(dá)目的蛋白sCAR?TMTP1。由于同一氨基酸可能由不同的密碼子翻譯出，在短肽氨基酸序列反推核苷酸序列的過程中，我們利用生物信息學(xué)技術(shù)分析、選擇適合于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中核苷酸序列，以提高桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)正確表達(dá)目的短肽。而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的使用，雖然在重組蛋白的得率上不及大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)，但也避免了潛在的重組蛋白的復(fù)性以及部分或者全部的溶解性不佳等常見的問題。

TMTP1是我們前期研究所獲得的一段可以特異結(jié)合高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞的短肽，其核心序列為NVVRQ。系列研究證實(shí)TMTP1對胃癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤有特異的靶向識別能力，而且對小于2mm的亞臨床病灶有著良好的識別能力，具備較好的向臨床轉(zhuǎn)化的前景［20，21］。本研究中發(fā)現(xiàn)TMTP1也可以特異地結(jié)合骨肉瘤細(xì)胞株MG?63、Saos?2、U2OS，與文獻(xiàn)中提及的上述細(xì)胞具有較高的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移潛能相符［22，23］。同時因?yàn)镸G?63細(xì)胞CAR表達(dá)水平較低，可用來驗(yàn)證重組蛋白sCAR?TMTP1修飾后的ADV/GFP的感染效率，結(jié)果表明修飾后的ADV對MG?63細(xì)胞的感染效率顯著高于未經(jīng)修飾的病毒。但我們也注意到，與利用RGD、NGR短肽改造病毒外殼的實(shí)驗(yàn)相比較，本實(shí)驗(yàn)4～5倍的基因轉(zhuǎn)染效率要低于文獻(xiàn)所述提升17倍的程度［24］，考慮可能與檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率手段的差異以及TMTP1介導(dǎo)了不同的ADV內(nèi)吞機(jī)制有關(guān)。目前我們正嘗試分離鑒定TMTP1在細(xì)胞膜表面的受體，研究其可能介導(dǎo)的入胞作用的分子機(jī)制。同時研究攜帶自殺基因的新型ADV，以增強(qiáng)病毒對骨肉瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，此也是我們另一個正在開展的研究方向。

目前已有ADV用于肉瘤治療的Ⅰ期臨床報道，其效能與安全性已得到驗(yàn)證［25］。病毒介導(dǎo)的基因治療有望與手術(shù)、化療一樣成為骨肉瘤常規(guī)診療的一部分。盡管面臨著眾多挑戰(zhàn)，研究新型的溶瘤ADV，提升病毒治療的特異性和效能，仍將是今后的主要研究方向，而本研究希望能為此提供有益的參考。

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The recombinant fusion protein sCAR?TMTP1 enhances thegene transfer efficiency of ADV on human osteosarcoma cells.

LUO Danfeng*,GONG Jingji,CHENG Teng,WEIRui,WEI Juncheng,ZHU Wentao.*Department ofGynecology and Obstetrics,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Scienceand Technology,Wuhan 430030,China
Corresponding author:ZHUWentao,E?mail:wentao?zhu@hotmail.com

Objective To enhance the transduction efficiency of adenovirus on coxsackievirus and adenovirus receptor(CAR)deficient human osteosarcoma cells.M ethods The recombinant protein sCAR?TMTP1wasexpressed and purified by Bac?to?Bac system,then identified by SDS?PAGE andWestern blotting. The expression levelof CAR and the infection efficiency of ADV/GFP in different cell lines(osteosarcoma cells ＆amp;293)were detected by flow cytometry(FCM),and the positive rate of FITC?TMTP1 binding to above cell lineswas also measured by FCM.MG?63 cells were exposed to Ad/sCAR?ligand complexesmixtures,and the infection efficiency of ADV/GFPwasmeasured by FCM.Results Either ofexpressed and purified sCAR?TMTP1 showed a specific protein band with a relativemolecularmass of 31 000,withwhich the supernatantof lysed sf9 cells infected showed specific reaction with rabbit anti?mouse sCAR monoclonal antibody.FITC?TMTP1 specifically bound to the MG?63 cellswith a lower level of CAR and poor infection efficiency of ADV. ADV/GFP modified with sCAR?TMTP1 mediated an obvious enhancements of GFP expression in MG?63, compared with those cells exposed to ADV/GFP.Conclusion The recombinant fusion protein sCAR?TMTP1 has theability toenhance thegene transferefficiency ofADV on CAR deficienthuman osteosarcoma cells.

Osteosarcoma;Adenovirus;TMTP1;Coxsackie and adenovirus receptor;Recombinant protein;Gene therapy;Tumer cell

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.06.013

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81202061）

430030武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科（羅丹楓、龔靜吉、程騰、魏睿、魏軍成）；骨科（祝文濤）

祝文濤，E?mail：wentao?zhu@hotmail.com

（2016?06?25）