當(dāng)歸總酚酸的純化工藝研究

邵建兵，劉 尖，汪 燕，夏國華，解 冰

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·藥學(xué)研究·

當(dāng)歸總酚酸的純化工藝研究

邵建兵1，劉 尖2，汪 燕1，夏國華2，解 冰3*

目的 研究大孔樹脂純化當(dāng)歸總酚酸的工藝。方法 以阿魏酸和總酚酸含量為指標(biāo)，比較不同樹脂對阿魏酸和當(dāng)歸總酚酸的比吸附量和比洗脫量，篩選出最佳純化樹脂，并考察其純化當(dāng)歸酚酸的最佳工藝條件及參數(shù)。結(jié)果 將多糖純化中醇沉的上清液回收乙醇濃縮至1.2 g/mL，鹽酸調(diào)pH至2，上HPD600大孔吸附樹脂，上柱后水洗8 BV，70%乙醇洗脫8 BV。收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮，干燥得當(dāng)歸總酚酸組分，總酚酸純度為58.27%，純化轉(zhuǎn)移率為87.02%。結(jié)論 HPD600大孔吸附樹脂可以較好地純化富集當(dāng)歸總酚酸。

當(dāng)歸；總酚酸；阿魏酸；大孔吸附樹脂

0 引言

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Dliv.)Diels的干燥根，為臨床常用藥，俗有“十方九歸”之稱，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效。酚酸類物質(zhì)為當(dāng)歸的主要有效部位[1-3]，具有顯著的抗氧化、清除自由基以及細胞保護作用，其中阿魏酸具有抗血小板凝集和血栓[4]，抗氧化、清除自由基以及細胞保護作用，抗腫瘤，抗突變[5-6]等作用。但以阿魏酸為代表的該類成分在提取物中的純度較低[7]，因此，通過提取純化技術(shù)改變當(dāng)歸制劑粗大黑外觀和服用劑量過大的問題，是當(dāng)歸制劑現(xiàn)代研究的熱點。

本實驗以阿魏酸和當(dāng)歸總酚酸的含量為指標(biāo)，以阿魏酸和當(dāng)歸總酚酸的比吸附量和比洗脫量為指標(biāo)篩選出最佳純化樹脂，并考察其純化當(dāng)歸酚酸母液的工藝條件及參數(shù)，為當(dāng)歸總酚酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；十萬分之一電子天平(德國METTLER TOLEOR公司)；UV-2802型紫外可見分光光度計(上海尤尼克儀器有限公司)；DZF-6051真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

樹脂購自上海摩速科學(xué)器材有限公司；延胡索乙素對照品(批號：0726-200208，供含量測定用)，由中國藥品生物制品檢定所提供；醋延胡索(批號：080201)，南京藥業(yè)股份有限公司中藥飲片廠；甲醇為色譜純(美國OMNI公司)，水為實驗室自制超純水，其余試劑均為國藥(上海)試劑有限公司分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備 取2 000 g當(dāng)歸超臨界提取揮發(fā)油后，藥渣加10倍水提取，每次2 h，合并濾液，濃縮至相對密度1.4，冷卻至40 ℃用95%乙醇醇沉至醇濃度為70%，靜置過夜，抽濾，合并濾液減壓濃縮至1.6 g/mL，備用，測得阿魏酸含量為0.336 mg/g，總酚酸含量為12.655 mg/g。

2.2 阿魏酸含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent HC-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：MeOH-0.05%HAC(35∶65)，流速1.0 mL/min，檢測波長：320 nm，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取阿魏酸對照品4.785 mg至10 mL量瓶，用流動相定容，再精密吸取1.0 mL于25 mL容量瓶，用流動相定容得對照品溶液。分別吸取對照品溶液3、5、10、15、20、25、30、35 μL按上述色譜條件分別進樣。以對照品進樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，Y=49.577 X-15.147，r=0.999 9，表明阿魏酸在57.42～669.9 ng范圍內(nèi)線性良好。

2.2.3 樣品的含量測定 取適量樹脂洗脫液揮干，置10 mL量瓶用流動相定容，過0.45 μm的微孔濾膜后，精密吸取10 μL進樣，計算阿魏酸含量。

2.3 當(dāng)歸總酚酸含量測定[8]

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取阿魏酸對照品溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL置10 mL具塞試管，加甲醇至2 mL，加0.3%十二烷基硫酸鈉0.8 mL，0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1∶0.9)混合液0.4 mL，混勻，暗處放置5 min，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，暗處放置20 min，以顯色劑為空白，720 nm波長下測定吸光度。以阿魏酸的濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制阿魏酸對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.017 34 X-0.071 3，R2=0.994 0，表明阿魏酸濃度在12.53～47.13 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.3.2 樣品的含量測定 取適量樹脂洗脫液揮干，甲醇定容至10 mL，參照標(biāo)曲方法測定吸光度，計算其含量。

2.4 樹脂預(yù)處理 各樹脂用2 mol/L NaOH浸泡5 h，蒸餾水洗至中性后，用3 mol/L鹽酸浸泡8 h，蒸餾水洗至中性，再用乙醇浸泡24 h充分溶脹，至醇洗液加5倍水無白色渾濁，最后用蒸餾水洗至無醇味，蒸餾水浸泡待用。所用樹脂的物理參數(shù)見表1。

表1 所用樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.5 樹脂的篩選 采用動態(tài)吸附法，稱取處理過的上述濕樹脂各5.0 g，濕法裝柱，均上樣20.00 mL(生藥量：1.6 g/mL)，流速0.5 mL/min，過柱流出液重吸附2次，靜置2 h，用蒸餾水洗至流出液無色，以50%乙醇洗脫10 BV后，收集各洗脫液，測定阿魏酸和總酚酸的含量，按下式計算比吸附量和比洗脫量。結(jié)果見表2和表3。比吸附量=(上樣量-水洗成分量)/干樹脂重，比洗脫量=醇洗成分質(zhì)量/干樹脂重。

表2 4種型號大孔吸附樹脂對阿魏酸的動態(tài)吸附性能比較(n=3)

表3 4種型號大孔吸附樹脂對總酚酸的動態(tài)吸附性能比較(n=3)

由表2、表3可以看出，不同類型的大孔吸附樹脂對阿魏酸和總酚酸的動態(tài)吸附效果有較大的差異，其中HPD600各指標(biāo)均優(yōu)于其他3種。

2.6 上樣濃度的考察 取3份樣品液(生藥量：1.6 g/mL)各20.00 mL，加水配制成濃度為0.8、1.2和1.6 g/mL的溶液，分別上濕重5.0 g HPD600大孔吸附樹脂(干重1.438 g)柱，流速0.5 mL/min，過柱流出液重吸附2次，靜置2 h，用蒸餾水洗至流出液無色，以50%乙醇洗脫10 BV后，收集各洗脫液，以總酚酸和阿魏酸的比吸附量(mg/g)和比洗脫量(mg/g)為指標(biāo)，考察上樣濃度。結(jié)果見表4。

由表4可以看出，上樣液濃度為1.2 g/mL時，HPD600大孔吸附樹脂對總酚酸和阿魏酸比吸附量和比洗脫量最佳。

表4 上樣濃度考察

2.7 上樣液pH值考察 取當(dāng)歸樣品液(生藥量：1.2 g/mL)30.0 mL，測得pH值為4.2，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)pH值分別為2、4、6、8、10[9]，分別上濕重5.0 g HPD600大孔吸附樹脂(干重1.438 g)柱，流速0.5 mL/min，過柱流出液重吸附2次，靜置2 h，用蒸餾水洗至流出液無色，以50%乙醇洗脫10 BV后，收集各洗脫液。以總酚酸和阿魏酸的比吸附量(mg/g)及比洗脫量(mg/g)為指標(biāo)，考察上樣pH值。結(jié)果見表5。

表5 上樣液pH考察

從表5可以看出，上樣液pH值為2時，HPD600大孔吸附樹脂對總酚酸和阿魏酸比吸附量和比洗脫量最佳。

在上樣液濃度為1.2 g/mL，pH值為2，以阿魏酸為指標(biāo)時，每克干HPD600大孔吸附樹脂吸附26.557 g生藥，以當(dāng)歸總酚酸為指標(biāo)時，每克干HPD600大孔吸附樹脂吸附25.252 g生藥，為盡量保留有效組分，選擇以當(dāng)歸總酚酸為指標(biāo)下的飽和吸附量作為生藥的最佳吸附量，即25.252 g/g。

2.8 水洗體積考察 按當(dāng)歸總酚酸的飽和吸附量上樣，精密吸取樣品液(1.2 g/mL)30.26 mL，用鹽酸調(diào)pH值為2，加至濕的5.0 g HPD600大孔吸附樹脂(折合干樹脂1.438 g)柱，以0.5 mL/min的流速進行動態(tài)吸附，過柱流出液重吸附2次，靜置2 h。以蒸餾水沖洗，按1 BV收集，檢測Molish反應(yīng)，結(jié)果見表6。

表6 水洗液Molish反應(yīng)結(jié)果

注：++表示強陽性，+表示陽性，—表示陰性

由表6可知，水洗至8 BV時，大部分雜質(zhì)已經(jīng)洗脫，確定上柱后最佳水洗體積為8 BV。

2.9 洗脫劑濃度的考察 精密吸取當(dāng)歸樣品液(1.2 g/mL)30.26 mL，用鹽酸調(diào)pH值為2，加至濕的5.0 g HPD600大孔吸附樹脂(折合干樹脂1.438 g)柱，以0.5 mL/min的流速進行動態(tài)吸附，過柱流出液重吸附2次，靜置2 h，先用蒸餾水洗脫8 BV后，依次用20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各6 BV洗脫，洗脫液流速為1.0 mL/min，測定洗脫液中總酚酸和阿魏酸的含量，計算洗脫率。結(jié)果見表7。

表7 洗脫溶劑濃度考察

由表7可以看出，總酚酸主要集中在50%乙醇部分，總洗脫百分率達到79.87%，70%還可洗下8.18%；阿魏酸主要集中在50%乙醇部分，總洗脫百分率達到83.15%，70%還可洗下10.22%。綜合考慮溶劑用量和洗脫百分率，選擇70%乙醇作為洗脫溶劑。

洗脫曲線的繪制：精密吸取樣品液(1.2 g/mL)30.26 mL，用鹽酸調(diào)pH值為2，加至濕的5 g HPD600大孔吸附樹脂(折合干樹脂1.438 g)柱，以0.5 mL/min的流速進行動態(tài)吸附，過柱流出液重吸附2次，靜置2 h。先用蒸餾水洗脫8 BV，用70%乙醇洗脫，按1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 BV進行收集。分別測定總酚酸和阿魏酸的含量，并分別以總酚酸和阿魏酸的比洗脫量為縱坐標(biāo)(mg/g)，洗脫柱體積(BV)為橫坐標(biāo)繪制總酚酸和阿魏酸的洗脫曲線，見圖2。

圖2 70%乙醇洗脫曲線

由圖2可以看出，用70%乙醇洗脫8 BV時，總酚酸洗脫百分率達到95.86%，阿魏酸的洗脫百分率達到96.72%，已基本洗脫完全。

驗證試驗：吸取樣品液1.2 g/mL，鹽酸調(diào)pH值為2，體積為302.60 mL，加至已處理好的裝有50 g濕HPD600大孔吸附樹脂柱，調(diào)節(jié)流速為0.5 mL/min，過柱流出液重吸附2次，靜置2 h，用蒸餾水洗脫8 BV，用70%乙醇洗脫8 BV，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，60 ℃真空干燥。測定阿魏酸和總酚酸含量及各自占干膏的比例。結(jié)果見表8。

表8 驗證試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 HPD600樹脂純化當(dāng)歸提取揮發(fā)油后水提液的醇沉上清液中總酚酸的最佳工藝條件：每克干樹脂吸附25.252 g生藥，上樣藥液最佳濃度為1.2 g/mL，最佳pH值為2，上柱后水洗8 BV，70%乙醇洗脫8 BV。該工藝經(jīng)驗證，終產(chǎn)品總酚酸純度為58.27%，純化轉(zhuǎn)移率為87.02%，該工藝穩(wěn)定可靠，可較好地提取純化當(dāng)歸中總酚酸。

3.2 先前研究中[7,10]采用乙醇直接提取后直接純化得到當(dāng)歸總酚酸，而當(dāng)歸中揮發(fā)油、總多糖、總酚酸都具有顯著的藥理活性[11-13]，本研究充分考慮生藥資源的綜合利用，分步提取揮發(fā)油、總多糖和總酚酸，而且乙醇直接提取得到的浸膏黏稠度太高，不利于純化。

3.3 在設(shè)計當(dāng)歸各組分提取分離純化路線的過程中，有兩種不同的方法，一種是將當(dāng)歸粉末提取揮發(fā)油后的藥渣水提液濃縮、醇沉后取沉淀作為粗多糖，將上清液醇沉上清液回收乙醇作為酚酸母液；一種是將當(dāng)歸粉末提取揮發(fā)油后的藥渣水提液濃縮直接作為酚酸母液，將酚酸母液上樹脂純化后的水洗液作為多糖母液，濃縮醇沉取沉淀作為粗多糖。本研究在對兩種方法進行比較，后一種方法的缺點是：當(dāng)歸提取揮發(fā)油后的藥渣水提液濃縮至0.5 g/mL時已經(jīng)非常黏稠，容易堵塞樹脂柱，不利于有效組分的吸附。本研究經(jīng)過實驗比較后，對當(dāng)歸酚酸和總多糖的提取純化路線采用前一種方法，減少了濃縮、回收乙醇的次數(shù)，并且當(dāng)歸酚酸母液在醇沉前后含量測定比較損失很小，醇沉前為0.340 mg/g，醇沉后為0.336 mg/g。

3.4 總酚酸含量測定過程中，按照標(biāo)曲顯色方法處理后，UV-2802型紫外可見分光光度計進行全波長掃描，在720 nm處有最大吸收峰，故選擇檢測波長為720 nm。

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Purification technology of total phenolic acid from angelica

SHAO Jian-bing1,LIU Jian2,WANG Yan1,XIA Guo-hua2,XIE Bing3*

(1.Department of Pharmacy,Rugao People′s Hospital,Rugao 226500,China;2.School of Pharmacy,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;3.Department of Laboratory,Zhenjiang Dantu Hospital of Traditional Chinese Medicine,Zhenjiang 212028,China)

Objective To study the purification technology of total phenolic acid from angelica by macroporous resin.Methods The contents of phenolic acid and ferulic acid were chosen as the reference,and the optimum macroporous resin was selected by comparing adsorptive capabilities and desorption ratio in 4 kinds.The purification technology was optimized.Results The ethanol from supernatant of polysaccharides alcohol purification was condensed to 1.2 g/mL,the pH value of hydrochloric acid was adjusted to 2,and then it was purified by macroporous adsorptive resins HPD600 and washed by water for 8 BV and 70% ethanol for 8 BV.The 70% ethanol eluant was collected,and the angelica total phenolic acid was obtained after recovering,condensing and drying ethanol,and the purity was 58.27%,and purification of transfer was 87.02%.Conclusion HPD600 resin can be used to enrich and purify total phenolic acid from angelica.

Angelica;Total phenolic acid;Ferulic acid;Macroporous resin

2016-04-05

1.如皋市人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 如皋 226500；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)中醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江 212028

鎮(zhèn)江市重點研發(fā)計劃(HS2015075)；江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項項目

10.14053/j.cnki.ppcr.201611021

*通信作者