烏林哈德，石瑞麗

(包頭醫(yī)學(xué)院生理教研室，內(nèi)蒙古 包頭014060)

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缺血性神經(jīng)元死亡形式及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展*

烏林哈德，石瑞麗

(包頭醫(yī)學(xué)院生理教研室，內(nèi)蒙古 包頭014060)

缺血性腦卒中是大腦的某個區(qū)域血流量突然減少或血液循環(huán)出現(xiàn)障礙，包括血栓形成和相對血流灌注不足，導(dǎo)致相應(yīng)的神經(jīng)功能失活。通常缺血幾秒到數(shù)分鐘內(nèi)，缺血應(yīng)激模式啟動，隨后發(fā)生一系列生化反應(yīng)，最終導(dǎo)致梗塞中心的細(xì)胞膜崩解直至神經(jīng)元死亡。神經(jīng)細(xì)胞死亡過程涉及復(fù)雜的時間和空間級聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞自噬(autophagy)、凋亡(apoptosis)和程序性壞死(necroptosis)這幾種不同的細(xì)胞死亡形式通常相互誘導(dǎo)。

1細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是指自噬前體結(jié)構(gòu)不斷延伸成雙膜囊泡，包裹一些受損蛋白或細(xì)胞器，形成自噬體后與酸性溶酶體融合，將內(nèi)吞的胞質(zhì)物質(zhì)降解以重新利用的過程。微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)和自噬基因Beclin1均參與自噬體形成，Beclin1是參與自噬調(diào)控的重要基因，而LC3在自噬形成時由LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ。

1.1細(xì)胞自噬與腦缺血生理情況下細(xì)胞自噬主要維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但自噬不足或過剩都會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，自噬程度是細(xì)胞存亡的關(guān)鍵。應(yīng)用改良Levine/Vannucci小鼠缺氧缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元中出現(xiàn)細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放以及半胱氨酸天冬酶-8(caspase-8)和半胱氨酸天冬酶-9(caspase-9)的裂解，而作為各種凋亡通路最終調(diào)節(jié)因子的半胱氨酸天冬酶-3(caspase-3)并未被激活，進(jìn)一步的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，受損的神經(jīng)元并沒有表現(xiàn)出凋亡、壞死等形態(tài)學(xué)特征，相反卻出現(xiàn)了大量自噬小體[1]。在體外氧糖剝奪/再灌注細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，LC3和Beclin1表達(dá)明顯增加，用Fluoro-Jade C熒光和電子顯微鏡觀察到復(fù)氧后的神經(jīng)元死亡比率很高，加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)，細(xì)胞死亡率顯著減少[2]。觀察新生大鼠不同時間點缺氧缺血性損傷后細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的變化，發(fā)現(xiàn)海馬組織中的Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白質(zhì)表達(dá)水平在0 h后開始增加，24 h后達(dá)到峰值，隨后開始下降，并且在所有時間點內(nèi)，Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，低于自噬誘導(dǎo)劑處理組[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cell, BMVEC)發(fā)生自噬，從而減少血腦屏障的破壞。通過體外培養(yǎng)BMVEC細(xì)胞并模擬大腦缺血再灌注損傷模型，分別提前0.5 h給予自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)，發(fā)現(xiàn)3-MA明顯加劇BMVEC凋亡，而且升高活性氧水平。

細(xì)胞自噬作用與腦缺血后的時間有相關(guān)性。腦缺血后使用自噬誘導(dǎo)劑mTOR進(jìn)行再灌注，可能會減弱自噬的神經(jīng)保護(hù)作用，相反，在再灌注前使用3-MA會發(fā)現(xiàn)梗死面積明顯減少，并且阻斷了腦水腫的進(jìn)展[5]。研究高壓氧對腦缺血保護(hù)作用時發(fā)現(xiàn)，提前側(cè)腦室注射3-MA再灌注后明顯減弱高壓氧對腦缺血保護(hù)作用。而在大腦中動脈閉塞前給3-MA處理會加重腦損傷，使用mTOR處理可觀察到LC3-Ⅱ和Beclin基因表達(dá)上調(diào)，出現(xiàn)與高壓氧預(yù)處理相似的神經(jīng)保護(hù)作用，提示高壓氧預(yù)處理可能增加細(xì)胞自噬[6]。

1.2mTOR信號通路與細(xì)胞自噬細(xì)胞自噬涉及多種信號通路，主要包括mTOR信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(phosphoimsitide-3 killase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信號通路、活性氧(reactive oxygen species，ROS)信號通路和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路，其中mTOR信號通路不僅在細(xì)胞代謝，細(xì)胞生長發(fā)育和細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而且在腦缺血中起著至關(guān)重要的作用。mTOR是一種存在于真核生物、進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶家族。mTOR包括兩種復(fù)合物形式，分別是mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)，前者主要參與細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和能量代謝的調(diào)節(jié)，后者與細(xì)胞骨架重組有關(guān)。與自噬相關(guān)的mTORC1活性受氨基酸水平影響，而氨基酸主要由鳥苷三磷酸和絲裂原蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)介導(dǎo)生成，兩者活性均受亮氨酸調(diào)控。腫瘤抑制基因p53是mTOR的重要調(diào)節(jié)器，利用體外培養(yǎng)原代小鼠神經(jīng)元細(xì)胞建立氧糖剝奪/復(fù)灌(OGD/R)損傷模型，通過使用p53抑制劑或誘導(dǎo)劑觀察其是否對OGD/R損傷有影響。結(jié)果表明，激活p53基因會抑制mTOR的表達(dá)加劇損傷，相反，抑制p53基因表達(dá)后mTOR活性上調(diào)，細(xì)胞損傷減輕[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬可能會在腦缺血中被中斷。許多神經(jīng)變性疾病的一個共同的特征是大量異常的自噬體或自噬溶酶體堆積，或是不規(guī)則的自噬小體頻繁出現(xiàn)?？赡苡袃煞N原因：第一種是自噬信號和自噬流增加，因此檢測到自噬的各個水平的標(biāo)記物增加；第二種情況是自噬信號本身沒有變化，而是由于自噬小泡不能被溶酶體降解，而使得自噬小泡積累或是溶酶體出現(xiàn)功能障礙[8]。因此通常檢測自噬發(fā)生，除了需要檢測LC3是否有增加，還需要加上氯喹或者蛋白酶抑制劑等化合物阻斷溶酶體的降解途徑，觀察LC3是否增加更加明顯。

2細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是腦缺血時細(xì)胞死亡的另一種重要方式，也稱為程序性死亡，是腦缺血后神經(jīng)功能缺損的主要原因之一。細(xì)胞凋亡發(fā)生迅速，其特征主要有核染色質(zhì)固縮成片段，細(xì)胞器皺縮和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膨脹等。凋亡細(xì)胞通常與其相鄰細(xì)胞脫離，胞膜有小泡形成，將凋亡細(xì)胞殘骸分割包裹為凋亡小體，凋亡小體的質(zhì)膜保持完整性防止細(xì)胞質(zhì)泄漏引發(fā)炎癥反應(yīng)。

2.1細(xì)胞凋亡與腦缺血 缺血性腦卒中發(fā)生早期，缺血中心區(qū)腦血流急劇下降發(fā)生能量代謝障礙，神經(jīng)細(xì)胞死亡以壞死為主；而缺血中心區(qū)周圍(缺血半暗帶)的神經(jīng)細(xì)胞在周邊血流供應(yīng)下仍然具有代謝活力，其后續(xù)的死亡形式以凋亡為主。在大鼠大腦中動脈局灶缺血模型中[9]，活化的半胱天冬蛋白酶可同時介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩條凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，外源性途徑(又稱細(xì)胞死亡受體途徑)是通過活化的自殺基因(factor associated suicid，F(xiàn)as)受體與配體(Fas ligand，F(xiàn)as-L)結(jié)合后被啟動，在缺血半暗帶可觀察caspase-1、caspase-3、caspase-8、caspase-9以及裂解的caspase-8表達(dá)增加。內(nèi)源性途徑(又稱線粒體途徑)激活是指促凋亡蛋白Bax或Bcl-2家族其他成員易位到線粒體膜上形成線粒體跨膜通道，從而引起凋亡誘導(dǎo)因子細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C通過凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating facter-1，Apaf-1)的多聚化與caspases-9形成凋亡小體，而Bcl-2過度表達(dá)會減少梗死面積。caspase-8和caspase-9激活caspase-3后進(jìn)而切割其它關(guān)鍵底物，包括將DNA修復(fù)酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)切割成89 kDa和28 kDa的片段。相反，抑制caspase-3會縮小梗死面積，減少腦損傷。另外，caspase-8可以裂解Bcl-2家族中的Bid，裂解后的片段易位至線粒體上，增加細(xì)胞色素C的釋放能力。另有數(shù)據(jù)顯示線粒體是氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的重要通路。發(fā)生腦缺血時線粒體能量代謝產(chǎn)生障礙，能量合成受阻，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。研究發(fā)現(xiàn)，用氰化物對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪后，還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen，NADH)和還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen，NADPH)的含量減少，恢復(fù)氧糖供應(yīng)后，NADH和NADPH的含量有所增加，提示線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)促進(jìn)NAD(H)釋放，同時PARP被激活使NADP(H)發(fā)生降解[10]。細(xì)胞ATP逐漸耗盡，依靠ATP運轉(zhuǎn)的離子泵活性受阻，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子和鈉離子超載，使線粒體腫脹和線粒體外膜破裂，引起遲發(fā)性細(xì)胞損傷。

2.2絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路與細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡機制復(fù)雜，有多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與介導(dǎo)，主要包括線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路又包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前凋亡因子CHOP通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal Kinase，JNK)通路和caspase通路。JNK和p38MAPK都屬于MAPKs，是細(xì)胞內(nèi)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞調(diào)亡過程中具有至關(guān)重要的作用，可被不同生長因子和G-蛋白偶聯(lián)受體激活，腦卒中后通過激活細(xì)胞促炎和促凋亡信號加中腦損傷。腦缺血時活化的JNK轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)并使其下游作用底物c-Jun磷酸化，促進(jìn)線粒體中細(xì)胞色素C向胞漿釋放，進(jìn)而激活線粒體凋亡信號通路；p38MAPK是MAPK的蘇氨酸和酪氨酸殘基的特定位置發(fā)生雙重磷酸化而被激活，p38MAPK可通過增強Fas/Fas-L的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]，并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞及建立氧糖剝奪模型發(fā)現(xiàn)，p38MAPK可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表達(dá)增加。小鼠MCAO模型中，敲除小鼠的絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(Mitogen activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)基因和使用MKP-1抑制劑后發(fā)現(xiàn)，JNK和小膠質(zhì)細(xì)胞中p38MAPK被激活，腦梗塞增加，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙和出血量增多，提示MKP-1可使MAPKs快速發(fā)生去磷酸化，抑制其活性[12]。

3程序性細(xì)胞壞死

長期以來，細(xì)胞壞死被認(rèn)為是一種不受控制的被動死亡方式，但是越來越多的研究表明細(xì)胞壞死并不是完全不受調(diào)控的、被動的死亡方式，在某些情況下，可以通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行且不依賴caspase激活。2005年Degterev等提出了“程序性細(xì)胞壞死”的概念[13]，這種死亡細(xì)胞與傳統(tǒng)壞死細(xì)胞具有相似的形態(tài)學(xué)特點，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)腫脹，細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物釋放，但程序性細(xì)胞壞死伴有自噬現(xiàn)象。程序性細(xì)胞壞死主要由受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1)和受體相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)控制，RIP1和RIP3有一段特殊的蛋白相互作用區(qū)域，促進(jìn)RIP1與RIP3相互作用,使兩者相互磷酸化形成壞死復(fù)合物[14]。研究表明，程序性細(xì)胞壞死在許多疾病模型中加劇病理性損傷。

3.1程序性細(xì)胞壞死與腦缺血腦缺血發(fā)生后，缺血中心區(qū)的細(xì)胞由于血流中斷能量代謝障礙，發(fā)生壞死，在細(xì)胞形態(tài)還未發(fā)生明顯變化時開始產(chǎn)生活性氧，當(dāng)細(xì)胞膜破裂時，產(chǎn)生的活性氧達(dá)峰值，大量的活性氧激活NF-κB，使其產(chǎn)生細(xì)胞炎癥因子，增加活性氧的毒性和興奮性，促進(jìn)缺血神經(jīng)元的變性，同時細(xì)胞內(nèi)容物泄漏引起炎癥反應(yīng)，加重腦損傷。

3.2TNF-α受體介導(dǎo)信號通路與程序性壞死當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到各種刺激，包括感染和損傷時，活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生TNF-α，是介導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的主要信號通路，發(fā)生過程是TNF-α與受結(jié)合后誘導(dǎo)復(fù)合蛋白物I形成，進(jìn)一步在胞質(zhì)內(nèi)形成蛋白復(fù)合物Ⅱ，后者是死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，蛋白復(fù)合物2包括去泛化素化的PIP1和caspase-8，當(dāng)caspase-8活性受抑制時，RIPl/RIP3被磷酸化，磷酸化的RIPl/RIP3及RIP3下游因子形成復(fù)合物Ⅱb，即壞死小體(necrosome)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。雖然DNA修復(fù)酶PARP已被證明是TNF-α介導(dǎo)程序性細(xì)胞壞死的一個關(guān)鍵因素。但有實驗證明[15]，TNF-α和PARP通路所誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死并不完全相同。首先，DNA的烷基化劑如1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，MNNG)或甲磺酸甲酯會迅速激活PARP途徑，而在TNF誘導(dǎo)細(xì)胞壞死過程中較晚才發(fā)生。第二，抑制PARP通路對TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死沒有保護(hù)作用，如PARP-1抑制劑3-氨基苯酰胺(3-Aminobenzamide，3-AB)可以抑制MNNG，對TNF-α引起的5’-三磷酸腺苷耗竭、凋亡誘導(dǎo)因子易位和細(xì)胞壞死沒有影響。第三，用神經(jīng)酰胺干擾TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但沒有阻止RIP1或RIP3功能或自由基清除劑丁基羥基苯甲醚PARP引發(fā)程序性細(xì)胞壞死。

4自噬、凋亡和壞死的關(guān)系

目前，對細(xì)胞自噬、凋亡和壞死之間的具體聯(lián)系和相互作用沒有完全明確，但現(xiàn)有大量證據(jù)顯示，凋亡可以改變自噬。如果自噬無法維持細(xì)胞存活，則細(xì)胞可以通過激活細(xì)胞凋亡途徑以確保它們得到有效控制和消除，避免發(fā)生炎癥反應(yīng)。因此，自噬和凋亡(反之亦然)之間的調(diào)節(jié)關(guān)系可以表示為細(xì)胞進(jìn)化優(yōu)勢。細(xì)胞自噬和凋亡從根本上有著明確不同的生物化學(xué)和形態(tài)特征，但是它們的調(diào)節(jié)和執(zhí)行蛋白是緊密相連。凋亡和自噬既可以相互抑制又可以相互誘導(dǎo)。自噬減少細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要機制是發(fā)生線粒體自噬。在細(xì)胞死亡過程中，外膜蛋白會引起線粒體代謝水解酶的釋放和膜電位的消失，引起生物能紊亂。但是一些在自噬中起重要作用的蛋白質(zhì)也可能是促凋亡因子，例如自噬相關(guān)基因ATG12(autophagy related gene 12)和ATG5(autophagy related gene 15)是形成自噬體的重要蛋白質(zhì)，但同時也是激活細(xì)胞凋亡的信號因子[16]。程序性細(xì)胞壞死與凋亡均是由死亡受體介導(dǎo)的兩種不同的細(xì)胞死亡方式，但程序性細(xì)胞壞死既不依賴于caspase，也不需線粒體釋放細(xì)胞色素C，細(xì)胞在caspase活性被抑制而不能發(fā)生凋亡的情況下才會啟動程序性壞死，RIPK3是引起程序性細(xì)胞壞死必不可少的因素，也是調(diào)控caspase-8是否活化激活細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵。

綜上所述，腦缺血損傷后神經(jīng)元的死亡是一個多途徑、多因素的復(fù)雜病理過程，雖然自噬、程序性壞死、凋亡都被激活，但呈現(xiàn)不同的時程變化，發(fā)揮的作用也不盡相同。某些作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物已被證實對缺血性腦損傷發(fā)揮了良好的保護(hù)作用。因此，更加透徹地闡明各種死亡形式的作用機制，對于阻礙腦缺血損傷后神經(jīng)元的死亡，尋找新的藥物治療靶點，篩選優(yōu)秀的抗腦缺血藥物具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

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*基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81450058)；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(No 2013MS1108)

通訊作者：石瑞麗

(收稿日期：2015-06-15)