胡曉波，張優(yōu)儀，程德云

(1.四川省成都市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 610041；2.四川省人民醫(yī)院放射科，成都 610041；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸內(nèi)科，成都 610041)

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論著·基礎(chǔ)研究

機(jī)械力刺激對(duì)人肺泡上皮A549細(xì)胞JNK蛋白表達(dá)的影響*

胡曉波1，張優(yōu)儀2，程德云3△

(1.四川省成都市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 610041；2.四川省人民醫(yī)院放射科，成都 610041；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸內(nèi)科，成都 610041)

目的 探討機(jī)械力刺激對(duì)人肺泡上皮A549細(xì)胞c-Jun氨基末端激酶/促分裂原活化蛋白激酶 (JNK/MAPK)表達(dá)的影響。方法 建立離體的A549細(xì)胞機(jī)械刺激模型：分別以大小為1 000μstrain的張應(yīng)力或壓應(yīng)力刺激細(xì)胞，在刺激前和刺激后0、5、15、30、60min時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，共10組，每組3皿細(xì)胞。采用Westernblot檢測(cè)機(jī)械刺激后細(xì)胞內(nèi)磷酸化JNK/MAPK蛋白、總JNK/MAPK蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果A549細(xì)胞經(jīng)機(jī)械力刺激后，磷酸化JNK/MAPK蛋白水平增加。張應(yīng)力組在30min時(shí)間點(diǎn)增加最明顯，壓應(yīng)力組在15min時(shí)間點(diǎn)最明顯。之后隨著機(jī)械刺激時(shí)間延長(zhǎng)，張應(yīng)力和壓應(yīng)力刺激組的磷酸化JNK蛋白水平均出現(xiàn)下降，在60min時(shí)下降至基線水平。結(jié)論 1 000μstrain張應(yīng)力或壓應(yīng)力刺激，均激活A(yù)549細(xì)胞JNK/MAPK，提示JNK通路可能參與了機(jī)械力誘導(dǎo)的A549細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

肺泡；蛋白質(zhì)類；機(jī)械力；A549；JNK/MAPK；張應(yīng)力；壓應(yīng)力

呼吸機(jī)誘導(dǎo)的肺損傷是機(jī)械通氣最直接的危害。為了提高機(jī)械通氣救治率，減少患者死亡，眾多研究試圖闡明呼吸機(jī)誘導(dǎo)肺損傷的相關(guān)機(jī)制[1-5]。國外研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械力可引起肺上皮細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生活性氧簇，引起細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白改變等[6-9]，而國內(nèi)鮮有這方面的報(bào)道。c-Jun氨基末端激酶/促分裂原活化蛋白激酶 (JNK/MAPK)是有絲分裂原活化蛋白酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中重要的信號(hào)傳導(dǎo)因子，是否參與了肺細(xì)胞力信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)并不清楚。因此，本課題組在前期研究基礎(chǔ)上[10-11]，觀察機(jī)械力刺激人肺泡上皮A549細(xì)胞JNK/MAPK蛋白的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細(xì)胞株(美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和10%的小牛血清(美國GIBCO公司)；聚氟乙烯膜(PVDF膜，美國Millipore公司)；兔抗人JNK多克隆抗體、兔抗人磷酸化JNK抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體(美國Cell signaling公司)；蛋白定量試劑盒、發(fā)光底物試劑盒(美國Pierce公司)；4點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀(成都電子科技大學(xué)研制)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2孵箱(37 ℃，5%CO2，95%空氣)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度約80%時(shí)，用胰酶消化傳代。按2×105/L的細(xì)胞密度接種于加力板上，然后放入培養(yǎng)皿，于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。加力前用無血清培養(yǎng)基孵育細(xì)胞過夜，使細(xì)胞同步化。

1.2.2 試驗(yàn)分組 根據(jù)機(jī)械力的不同，試驗(yàn)分張應(yīng)力試驗(yàn)和壓應(yīng)力試驗(yàn)。張應(yīng)力試驗(yàn)設(shè)0、5、15、30、60 min刺激共5組。壓應(yīng)力試驗(yàn)設(shè)0、5、15、30、60 min 刺激也是5組。每組3皿細(xì)胞。

1.2.3 建立離體細(xì)胞刺激力學(xué)模型 分別以大小為1 000 μstrain 的張應(yīng)力和壓應(yīng)力刺激A549細(xì)胞，在刺激后5、15、30、60 min時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察；0 min刺激組行偽暴露。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 按文獻(xiàn)[10-11]方法提取細(xì)胞總蛋白、蛋白定量，Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)。棄上清液，加入細(xì)胞裂解液后再用超聲裂解儀破碎，4 ℃低溫離心分裝樣本，然后蛋白濃度測(cè)定。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，上樣前加變性劑。電泳完畢后切膠，蛋白電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，過夜。以三羥甲基氨基甲烷(TBST)緩沖液漂洗，加一抗1∶1 000，37 ℃孵育1 h，如前漂洗。再加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(抗兔1∶5 000)，再孵育60 min，再TBST漂洗3次。加入顯色劑，暗室曝光，見到顯色后終止反應(yīng)，清水沖洗。用Bio-Image分析系統(tǒng)對(duì)條帶灰度值測(cè)定。

2 結(jié) 果

0 min時(shí)經(jīng)機(jī)械應(yīng)力偽刺激有低水平的JNK磷酸化陽性反應(yīng)，張應(yīng)力組0 min時(shí)為0.56±0.12，壓應(yīng)力組0 min時(shí)0.62±0.22。隨著應(yīng)力刺激開始，JNK/MAPK蛋白磷酸化出現(xiàn)變化趨勢(shì)。張應(yīng)力刺激5 min時(shí)為0.71±0.17，JNK/MAPK蛋白磷酸化表達(dá)增多，但和0 min時(shí)間點(diǎn)相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，JNK/MAPK蛋白磷酸化表達(dá)呈上升趨勢(shì)。張應(yīng)力組15 min時(shí)為1.03±0.21，磷酸化JNK和0 min時(shí)(0.56±0.12)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。張應(yīng)力組30 min時(shí)間點(diǎn)磷酸化JNK條帶灰度值最高，至60 min磷酸化水平又明顯減少，接近刺激前水平。壓應(yīng)力組刺激5 min時(shí)為0.98±0.30，JNK/MAPK蛋白磷酸化表達(dá)增多和0 min時(shí)(0.62±0.22)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。壓應(yīng)力組15 min時(shí)為1.47±0.52，磷酸化JNK水平表達(dá)最高，和0 min時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。壓應(yīng)力組30 min時(shí)磷酸化JNK水平開始下降，在壓應(yīng)力組60 min時(shí)磷酸化JNK水平接近機(jī)械刺激前水平，見圖1。

圖1 機(jī)械張應(yīng)力和壓應(yīng)力刺激A549細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)磷酸化JNK、總JNK、內(nèi)參β-actin的表達(dá)

3 討 論

體外培養(yǎng)細(xì)胞然后施加機(jī)械應(yīng)力刺激的力學(xué)模型是目前較為新穎的研究方式，已經(jīng)應(yīng)用于呼吸領(lǐng)域[12]。肺泡上皮細(xì)胞在受到機(jī)械力刺激后，胞內(nèi)鈣離子濃度出現(xiàn)變化，肌動(dòng)蛋白絲聚合等，并引發(fā)了后續(xù)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。JNK廣泛存在于真核細(xì)胞中，介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、分裂、死亡等多種生物學(xué)行為，是細(xì)胞信息傳遞的樞紐。JNK位于細(xì)胞質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量為46×103和54×103，通過蘇氨酸和酪氨酸殘基羥基側(cè)鏈的雙重磷酸化而被激活。JNK蛋白激酶有3個(gè)基因編碼：JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2基因在全身廣泛表達(dá)，主要在生物學(xué)和病理過程中發(fā)揮作用。多種細(xì)胞外信號(hào)如熱損傷、紫外線、滲透壓改變、放射線、炎性信號(hào)因子、氧自由基、休克等均可激活JNK/MAPK信號(hào)通路[14]。研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽拉刺激可活化JNK/MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞增生[15]。而關(guān)于機(jī)械牽拉刺激肺上皮細(xì)胞是否能激活其JNK MAPK信號(hào)通路目前尚未見詳細(xì)研究。

本課題組應(yīng)用4點(diǎn)加力裝置，通過免疫印跡法觀察機(jī)械應(yīng)力刺激肺上皮A549細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路的活化情況。該4點(diǎn)加力裝置，可以分別提供張應(yīng)力和壓應(yīng)力。本研究觀察到0 min時(shí)經(jīng)機(jī)械應(yīng)力偽刺激仍然有低水平的JNK磷酸化陽性反應(yīng)，說明正常情況下的A549細(xì)胞有一定量的JNK磷酸化本底。通過不同類型的應(yīng)力刺激，觀察細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)因子的變化情況。本研究發(fā)現(xiàn)，不論哪種應(yīng)力刺激，A549細(xì)胞受到機(jī)械應(yīng)力作用后，細(xì)胞內(nèi)的磷酸化JNK水平均有增高，并有一定的時(shí)間變化規(guī)律，提示JNK可能參與了A549細(xì)胞內(nèi)的機(jī)械應(yīng)力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究觀察到，隨時(shí)間進(jìn)一步推移，JNK磷酸化程度反而有所下降。推測(cè)產(chǎn)生上述變化的原因可能是由于刺激時(shí)間過長(zhǎng)以后，力傳導(dǎo)因子如離子通道或細(xì)胞骨架產(chǎn)生耐受，在一定不應(yīng)期內(nèi)對(duì)持續(xù)的應(yīng)力不再起反應(yīng)，使得細(xì)胞內(nèi)后續(xù)生物化學(xué)反應(yīng)停止，中斷了機(jī)械力信號(hào)向胞內(nèi)傳導(dǎo)，而原本激活的JNK已被磷酸酯酶去磷酸化失活所致。

總之，本試驗(yàn)對(duì)機(jī)械力刺激肺A549細(xì)胞的JNK蛋白表達(dá)變化進(jìn)行了初步研究，探討了不同種類的應(yīng)力對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)因子表達(dá)的影響，提示機(jī)械應(yīng)力對(duì)A549細(xì)胞JNK蛋白的磷酸化有著重要作用。這為后續(xù)研究肺細(xì)胞機(jī)械力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

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Expression of JNK/MAPK in A549 cells induced by mechanical force*

HuXiaobo1，ZhangYouyi2，ChengDeyun3△

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstPeople′sHospitalofChengduCity,Chengdu,Sichuan610041,China；2.DepartmentofRadiology,SichuanProvincialPeople′sHospital，Chengdu，Sichuan610041,China；3.DepartmentofRespiratoryMedicine,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China)

Objective To explore whether the JNK/MAPK is involved in the mechanotransduction of the A549 cells induced by mechanical force.Methods Cells were divided into ten groups:tensile stress groups(0，5，15，30，60 min),and compressive stress groups(0，5，15，30，60 min)，3 replicate wells in each group.Cells were stimulated by tensile stress or compressive stress respectively at the magnitude of 1 000 μstrain for 5，15，30，60 min.Then the protein level of JNK and phosphorylated JNK were tested by Western blot.Results After mechanical stimulation,the protein level of phosphorylated JNK/MAPK increased.These were most obviously at the 30 min time point in both tensile stress group and the 15 min time point in compressive stress group.However,the protein level of phosphorylated JNK/MAPK returned to the original level at the 60 min time point in tensile stress group and the compressive stress group.Conclusion Mechanical force activated the expression of JNK in A549 cells.JNK pathway might be involved in signal transduction in A549 cells induced by mechanical force.

pulmonary alveoli；proteins；mechanical force;A549;JNK/MAPK;tensile stress；compressive stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.007

四川省衛(wèi)生廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(100051)；成都市科技計(jì)劃項(xiàng)目(12PPYB042SF-002)。 作者簡(jiǎn)介：胡曉波(1976-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事呼吸系統(tǒng)的生物力學(xué)方面研究?！?/p>

E-mail：chengdeyun@sohu.com。

R563.8；R

A

1671-8348(2016)23-3188-02

2016-04-23

2016-06-23)