張文通，魏鳳，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

魯北地區(qū)豬瘟流行病學(xué)調(diào)查與分析

張文通1，魏鳳2，沈志強(qiáng)1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的，以淋巴結(jié)周邊出血、脾臟邊緣出血性梗死、回盲部淋巴結(jié)紐扣狀腫和腎臟密集點(diǎn)狀出血等為特征性病理變化的豬的重大傳染病[1-2]，被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病。目前，由于豬瘟疫苗的普遍使用，豬瘟臨床上主要以溫和型豬瘟為主。溫和型豬瘟可導(dǎo)致母豬繁殖障礙、仔豬先天性感染等[3-4]。為弄清楚魯北地區(qū)豬瘟病毒感染及豬瘟疫苗免疫效果情況，對(duì)2013—2015年山東綠都生物科技有限公司收集的400份豬病料及2 400份豬血清進(jìn)行檢測(cè)及分析，其目的是獲得該區(qū)域豬瘟野毒感染及豬瘟疫苗免疫效果情況，為防控本區(qū)域CSF提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料檢測(cè)時(shí)間與地點(diǎn)

病料于2016年1月6—18日在山東綠都生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 材料

Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)maga公司；RT-PCR試劑盒（PrimeScrip 1 Step Enzyme Mix）、UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、pMD18-T克隆載體、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；瓊脂粉購(gòu)自上?；蚬荆黄渌瘜W(xué)試劑如異丙醇、無水乙醇等，均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品；豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病料或細(xì)胞毒DNA基因組提取病料處理：將豬病料（豬脾臟、淋巴結(jié)等）用剪刀剪碎，用無菌生理鹽水以3∶1稀釋組織制備組織懸液；用無菌勻漿器研磨組織懸液；將研磨好的組織懸液以4 000 r/min離心10 min，取上清液；將上清液在-20℃與37℃之間反復(fù)凍融3次。

RNA基因組提?。喝》磸?fù)凍融上清加Trizol后，室溫放置5 min。每1 mL Trizol中加0.2 mL氯仿，用力搖晃15 s，室溫靜置5 min，然后于2～8℃，12 000r/min離心15min。將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后室溫靜置10 min，然后于2～8℃，12 000 r/min離心10 min。小心吸棄上清液，留取沉淀。加現(xiàn)配的1 mL 75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀1次。然后于2～8℃，7 500 r/min離心5 min。小心倒掉上清液，沉淀置室溫干燥10 min。再在管中加20 μL的DEPC水溶解，在55～60℃下孵育10 min助溶，即得到病料總RNA基因組。

1.3.2 病料PCR鑒定參照GenBank報(bào)道的豬瘟毒株（序列號(hào)：AY382481）合成一對(duì)引物，擴(kuò)增跨幅為288 bp的核苷酸，引物的合成由上海生物工程有限公司完成，引物序列如下：上游引物P1：5′-CAGGTATGCGATCTCGTCAACCA-3′；下游引物P2：5′-GGGCACAGCCCAAATCCGAAGT-3′。

RT-PCR體系成分為：PrimeScrip 1 Step Enzyme Mix 1 μL、2×1 Step Buffer 10 μL、0.5 μL P1、0.5 μL P2、4 μL RNA、4 μL滅菌水。RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?0℃30 min、94℃3 min、94℃30 s、53℃30 s、72℃45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。其RT-PCR產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)?；厥誔CR產(chǎn)物，連接pMD18-T克隆載體，送往上海生工測(cè)序。

1.3.3 血清ELISA抗體測(cè)定按照豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)收集的2 400份血清進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 病料豬瘟病毒RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

病料CSFV的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，在250 bp與500 bp之間出現(xiàn)特異性目的條帶，大小與預(yù)期相符（圖1）?；厥赵摂U(kuò)增產(chǎn)物，送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI報(bào)道CSFV序列同源性94%～99%。

2.2 病料中豬瘟病毒結(jié)果統(tǒng)計(jì)

為便于統(tǒng)計(jì)與分析，將豬場(chǎng)按規(guī)模分為4種類型：散養(yǎng)戶為年出欄商品豬100頭以下（含100頭）；小型養(yǎng)豬場(chǎng)為年出欄商品豬101～1 000頭；中型養(yǎng)豬場(chǎng)為年出欄商品豬1 001～5 000頭；大型養(yǎng)豬場(chǎng)為年出欄商品豬5 000頭以上（不含5 000頭）。表1結(jié)果顯示，小型養(yǎng)豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶病料豬瘟病毒陽性率最高，豬場(chǎng)陽性率分別為43.3%和42.6%；而大型養(yǎng)豬場(chǎng)病料豬瘟病毒陽性率最低，豬場(chǎng)陽性率為10.5%。

圖1 病料CSFV的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

表1 病料豬瘟病毒陽性率

2.3 血清豬瘟病毒ELISA抗體測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表2關(guān)于豬場(chǎng)規(guī)模劃分與表1中劃分標(biāo)準(zhǔn)一樣。所采血清的豬場(chǎng)均來自接種CSFV疫苗的豬場(chǎng)。按照豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)：ELISA（S/P值）大于0.17為免疫合格（血清ELISA抗體S/P值大于或等于0.17，相當(dāng)于豬瘟正向間接血凝抗體大于或等于25）。表2結(jié)果顯示，大型和中型養(yǎng)豬場(chǎng)血清豬瘟病毒ELISA抗體免疫合格率（豬場(chǎng)豬瘟病毒ELISA抗體陽性率在80%以上）較高，分別達(dá)90.0%和85.0%；而小型豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶豬瘟病毒免疫合格率較低，分別為37.5%和25.0%。

3 分析與討論

收集的病料均采自疑似豬瘟發(fā)病豬或病死豬脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體及肺臟等組織。血液采集豬場(chǎng)均為免疫豬瘟疫苗的豬場(chǎng)。

病料RT-PCR鑒定結(jié)果顯示，小型養(yǎng)豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶豬瘟病毒陽性率最高，豬場(chǎng)陽性率分別為43.3%和42.6%；而大型養(yǎng)豬場(chǎng)豬瘟病毒陽性率最低，豬場(chǎng)陽性率為10.5%。這在某種程度上說明小型豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶受豬瘟病毒影響較大，需進(jìn)一步重視本區(qū)域?qū)ωi瘟的防控。

血清ELISA抗體測(cè)定結(jié)果顯示，大型和中型養(yǎng)豬場(chǎng)豬瘟病毒ELISA抗體免疫合格率較高，分別達(dá)90.0%和85.0%；而小型豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶豬瘟病毒免疫合格率較低，分別為37.5%和25.0%。這說明大中型養(yǎng)豬場(chǎng)豬瘟防控較好，而小型豬場(chǎng)與散養(yǎng)戶豬瘟防控較差。

病料豬瘟病毒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與血清豬瘟病毒ELISA抗體測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析基本一致。由于本區(qū)域散養(yǎng)戶與小型養(yǎng)豬場(chǎng)對(duì)豬瘟防控不完善、因豬瘟病毒造成損失較大，須進(jìn)一步重視對(duì)豬瘟的防控；而大中型養(yǎng)豬場(chǎng)對(duì)豬瘟防控較完善，需繼續(xù)維持。

[1]單虎，李明義，沈志強(qiáng).現(xiàn)代獸醫(yī)獸藥大全[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2011：304-307.

[2]蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999：147-151.

[3]蔡奕琪，朱燕秋，王悅彬.2001—2008年豬瘟抗體和豬瘟病毒監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J].養(yǎng)豬，2009（3）：73-74.

[4]楊慧君.淺談豬瘟流行新特點(diǎn)及防治措施[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2009（5）：50.

（編輯：富春妮）

厄搜救犬勇救七人力竭而亡

【澳大利亞《悉尼先驅(qū)晨報(bào)》網(wǎng)站4月27日?qǐng)?bào)道】4歲的白色拉布拉多犬戴科被譽(yù)為英雄，它在厄瓜多爾地震救援行動(dòng)中救出7人后力竭而亡。

厄瓜多爾伊瓦拉消防部門的搜救犬戴科于22日死亡，它在之前的幾天內(nèi)一直在16日厄瓜多爾7.8級(jí)地震留下的廢墟中搜尋幸存者。

據(jù)伊瓦拉消防部門在其臉書網(wǎng)站主頁上發(fā)表的一篇日志，戴科的死因是“大規(guī)模心肌梗塞和急性呼吸衰竭”。它作為搜救犬工作了3年。

伊瓦拉消防部門說：“我們很遺憾地通知大家，今天（消防部門）衰悼戴科的逝去，它參與了對(duì)佩德納萊斯地區(qū)的搜救行動(dòng)。我們四條腿的朋友因公殉職了。謝謝戴科，謝謝你在佩德納萊斯以及在你曾參加過的其他緊急救援行動(dòng)中的英勇之舉。”

超過2 000人在這次地震中受傷。此次地震導(dǎo)致太平洋沿岸地區(qū)建筑物倒塌、道路損毀、電力中斷，并造成至少654人死亡。

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2016-04-28）

S858.282.65+9.6

A

1002-1957(2016)03-0100-02

2016-05-07

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院地科技合作引導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（214 YDHZ32）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-06-022-15）

張文通（1979-），男，河南滎陽人，助理研究員，碩士，主要從事基因工程疫苗研究工作.E-mail:hzndzwt1@163.com