1楊麗娟，1蒲曉亞，1杜旭升, 2王廷璞*，2薛志強

（甘肅省產品質量監(jiān)督檢驗東部分中心2，天水師范學院1，甘肅 天水 74 001;）

航天紫花苜蓿葉蛋白正交提取工藝模式的研究

1楊麗娟，1蒲曉亞，1杜旭升, 2王廷璞*，2薛志強

（甘肅省產品質量監(jiān)督檢驗東部分中心2，天水師范學院1，甘肅 天水 74 001;）

優(yōu)選航天紫花苜蓿葉蛋白的提取工藝條件，對不同品系的苜蓿葉蛋白進行差異性分析。用單因素極差分析，280nm紫外光測測定并計算提取率，L9 (33) 正交實驗設計確定最佳提取工藝。 結果表明，通過單因素實驗確定的各因素影響能力大小為：pH>浸泡時間>料液比>溫度，正交實驗最佳組合為A2B1C1。結果中三得利（蘭州）對照和MA-7中葉蛋白的含量相對較高，分別為21.91%和19.42%。

航天；紫花苜蓿；葉蛋白；正交設計

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)又名苜蓿，紫苜蓿，素有“牧草之王”的美稱。紫花苜蓿在我國已有兩千多年的栽培歷史，全國各地均有種植，但主要分布在西北和華北地區(qū)[1]。苜蓿有許多營業(yè)價值，其粗蛋白含量通常在22%左右，含有20種以上的氨基酸[2]。航天育種紫花苜蓿各方面因素均高于普通紫花苜蓿，本實驗對航天紫花苜蓿中葉蛋白進行正交提取工藝設計，優(yōu)選出最佳提取方案，為今后的我國航天紫花苜蓿研究做了一些借鑒。

1 、材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

航天紫花苜蓿（采自天水市國家級高新農業(yè)園區(qū)神州綠鵬航天育種基地）。

1.1.2 儀器

UV-9200型紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）、HJ-3型恒溫磁力攪拌器（金壇市科興儀器廠）、PHS-3D型精密PH計（上海精密科學儀器有限公司）、TDZ5-W型多管架自動平衡離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、TG16-W型微量高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、AUY220型電子天平、電熱恒溫水浴鍋、漩渦混合器等。

1.1.3 試劑

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸銨、牛血清白蛋白，其余試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制及曲線繪制

準確稱取25mg牛血清白蛋白，用無離子水定容至25mL，配制成1mg/mL的溶液[3]。另取12支試管，配制標準溶液梯度為0.00mg/mL、0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.00mg/mL，平行做兩份。于280nm下測光吸值，以牛血清白蛋白的含量為橫坐標，OD280nm值為縱坐標，做出牛血清白蛋白標準曲線，得其回歸方程為：Y=0.3109X－0.0071，R2=0.9984。

1.2.2 單因素實驗

通過查閱資料和單因素預實驗，初步擬選出影響苜蓿葉蛋白提取率的主要因素有：pH、溫度、料液比、浸泡時間，進行以下實驗[4]。

稱取5份樣品，每份2g，加入石英砂研磨，按料液比1∶7加入pH=5.0、6.0、7.0、8.0、9.0緩沖液[5]，調pH=7.0，浸泡40min。40min后，在多管架自動平衡離心機4000r/min離心10min，取上清液于兩個5mL離心管中，在微量高速離心機中12000r/min離心5min。將上清液轉入另兩個離心管中，按照硫酸銨飽和度50、60、70、80%分級分離苜蓿葉蛋白，將每次所得蛋白再溶解，總共體積為4mL，裝入同一離心管中，吸取0.4mL加入新的離心管中，再加入3.6mL的pH=7.0的緩沖液。經測定OD280后固定pH，再依次選取15、20、25、30、35℃恒溫水浴加熱，1∶4、1∶7、1∶10、1∶13、1∶16 mL/g料液比，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h浸泡時間，逐次選取一個單因素后再固定，直至選取結束。

1.2.3 不同品系航天育種紫花苜蓿葉蛋白的提取

按照前面單因素和正交設計所確定的工藝來提取紫花苜蓿葉蛋白。在待測的40個樣品中，選擇長勢較好的26個樣品，清洗后晾干，準確稱取2.00g，研磨，裝入寫有標簽的50mL的離心管，按料液比1:7加入Ph=5.0的緩沖液14mlL，浸泡2h。平衡后，在多管架自動平衡離心機4000r/min離心10min，取上清液于兩個5mL離心管中，微量高速離心機中12000r/min離心5 min，將上清液轉到另兩支離心管中，按硫酸銨飽和度50%、60%、70%、80%分級分離苜蓿葉蛋白，將每次所得蛋白再溶解，使總共體積增至4mL，裝入同一離心管中，吸取0.4mLz轉入新的離心管中，再加入3.6mL的 pH=5.0的緩沖液，測其OD280。

2 、結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

牛血清白蛋白標準曲線，見圖1所示。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線Fig.1 The standard curve of BSA

由上圖可知，牛血清白蛋白在0-1.0mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 不同pH值對苜蓿葉蛋白的提取率的影響

表1 不同pH值對提取效果的影響Tab.1 The different pH for the extraction effect

由表1可知，苜蓿葉蛋白的提取率在pH=5.0、6.0和7.0時提取率較高，且在pH=6.0時提取率最高，結合實驗時的觀察記錄，在pH=5.0和pH=6.0時所提的葉蛋白含的綠色粉末非常少，故pH在6.0時提取效果較好。

2.2.1 不同溫度對苜蓿葉蛋白的提取率的影響

表2 不同溫度對提取效果的影響Tab.2 The different temperature for the extraction effect

由表2可知，溫度對提取率的影響不顯著，在30℃時提取率最小，所以一般選擇室溫即可，而且加熱會增加實驗的成本，加熱將耗費大量的電。因此不選擇加熱或保溫，一般在室溫下進行。

2.2.3 不同料液比對苜蓿葉蛋白的提取率的影響

表3 不同液料比對提取效果的影響Tab.3 The different liquid to solid ratio for the extraction effect

由表3可知，苜蓿葉蛋白的提取率在料液比1:7時最大，和參考文獻一致[6]。隨著料液比增大提取率不再增加，緩沖液加入太少，葉蛋白不能充分溶解，加緩沖液加入太多，又會增加提取體積，加大工作量，降低生產效率。故料液比在1:7～1:13時最佳。

2.2.4 不同浸泡時間對苜蓿葉蛋白的提取率的影響

表4 不同浸泡時間對提取效果的影響Tab. 4 The different macerating time for the extraction effect

由表4可知，在浸泡時間為0.5h、2.0h和2.5h下的提取率較高，從經濟的角度考慮，0.5h的提取率和其他的水平差異不太顯著，故選擇浸泡時間為0.5h較為理想。

2.3 正交實驗的結果與分析

將優(yōu)選后的pH、料液比、浸泡時間等三種因素，采用L9(33)正交表，進行實驗設計，并通過標準曲線計算提取液中蛋白的含量，其結果見表5-7所示[7]。

表5 正交提取實驗因素水平表Tab. 5 The factor level table of orthogonal extraction

表6 正交提取實驗結果分析表Tab.6 The result analysis table of orthogonal extraction實驗號

表7 正交提取實驗方差分析表Tab.7 The variance analytical table of orthogonal extraction

從上表中可以看出，影響蛋白得率的因素主次順序為：料液比>pH>浸泡時間，各因素差異均呈顯著（P＜0.05）[8]。其正交實驗最佳提取工藝為：A2B1C1，即浸泡時間2.0h、料液比1:7、pH=5.0。

4 不同品系航天育種紫花苜蓿葉蛋白的提取結果

不同品系航天育種紫花苜蓿葉蛋白的提取結果見圖2所示。

圖2 不同品系苜蓿葉蛋白提取率Fig. 2 Alfalfa leaf protein extraction rate of different strains

經過對不同品系航天育種紫花苜蓿葉蛋白的測定可知，三得利（蘭州）和MA-7中所提的蛋白含量相對較高，分別為21.91%和19.42%。

3 、結 論

在正交實驗中，pH并不是影響實驗結果的最大因素，而料液比影響則比較顯著，說明在各因素共同作用時，與單因素的情況不同，存在一定的協(xié)同效應。提取苜蓿葉蛋白的方法多為酸熱法，即通過調節(jié)苜蓿葉蛋白的等電點和加熱，使蛋白質變性以利于測定，本實驗使用硫酸銨沉淀蛋白，在蛋白質不變性的情況下提取到有活性的蛋白質，操作簡單，花費較少。通過正交提取實驗，得到了航天育種紫花苜蓿葉蛋白的最佳提取工藝為：浸泡時間2.0h、料液比1:7、pH=5.0，提取不同品系航天育種紫花苜蓿葉蛋白后發(fā)現(xiàn)，三得利（蘭州）和MA-7葉蛋白的含量相對較高，分別為21.91%和19.42%。本實驗為我國航天育種紫花苜蓿的深層次開發(fā)和利用提供了一定的理論參考。

[1] 包愛科,王強龍,張金林, 等.苜?；蚬こ萄芯窟M展[J].分子植物育種,2007,5,:160-168.

[2] 李富娟,玉永雄.苜蓿蛋白質及影響苜蓿粗蛋白含量的主要因素[J].牧草科學,2006,2:6-7

[3] 許淑芳,朱江,劉鄰渭,等.考馬斯亮蘭G-250法測定蘋果濃縮汁生產中的蛋白含量[J].飲料工業(yè),2005,8:45-46.

[4] 安建平,王廷璞.生物化學與分子生物學實驗技術教程[M].蘭州大學出版社,2005,7.

[5] 張春蘭.莜面與其他面粉蛋白質含量的比較[J].現(xiàn)代面粉工業(yè),2010,3:41-42.

[6] 姜健,楊寶靈,王冰.苜蓿不同部位的氨基酸組成及含量分析[J].安徽農業(yè)科學,2008,36(29):12643-12649.

[7] 侯銀環(huán),辛海量,徐燕豐.正交實驗優(yōu)選馬齒莧提取物制備工藝研究[J].藥學服務與研究.2008,8 (3):202-203.

[8] 薛香,梁云娟,郜慶爐.農業(yè)科研中應用Excel 進行方差分析的方法[J].現(xiàn)代化農業(yè),2009,8:48-50.

Study on Orthogonal Design Mode of Leaf Protein from Space Breeding Alfalfa

YANG Lijuan2,PU Xiaoya2,WANG Tingpu1＊, XUE ZhiQiang1
(Product Quality Supervision and Inspect Center of The Eastern Branch of Gansu2, Tianshui Normal University1, Tianshui Gansu, 741001, China)

To select the alfalfa leaf protein extraction process conditions, To different strains of alfalfa leaf protein use difference analysis. After use the single factor analysis of range, measuring leaf protein extraction rate in 280nm by uv spectrophotometry, identify the best extraction technology by the result of L9(33) orthogonal experiment design. The results show that through the single factor to determine the influence of various factors are pH > macerating time > Liquid to solid ratio >temperature,the best combination of orthogonal test is A2B1C1. Conclusion: Through the experiments of San Deli (Lan Zhou) contrast and MA- 7 extracted relatively high leaf protein, 21.91% and 19.42% respectively.

space flight; alfalfa; leaf protein; orthogonal design