江玉梅,張 晨,黃小蘭,倪才英*,王金鳳,宋鵬飛,張志斌,2(.江西師范大學(xué),鄱陽(yáng)湖濕地與流域研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330022；2.流域生態(tài)與地理環(huán)境監(jiān)測(cè)國(guó)家測(cè)繪地理信息局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330209)

重金屬污染對(duì)鄱陽(yáng)湖底泥微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

江玉梅1,張 晨1,黃小蘭1,倪才英1*,王金鳳1,宋鵬飛1,張志斌1,2(1.江西師范大學(xué),鄱陽(yáng)湖濕地與流域研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330022；2.流域生態(tài)與地理環(huán)境監(jiān)測(cè)國(guó)家測(cè)繪地理信息局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330209)

利用Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序技術(shù),分析了鄱陽(yáng)湖4大河流(信江XS,饒河RS,修河SS,贛江GS)河口底泥微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)底泥重金屬污染的響應(yīng)情況.結(jié)果表明,在測(cè)試的6種重金屬離子中,Cu、Zn全量和有效態(tài)表現(xiàn)為RS、XS顯著高于SS、GS,Mn全量和有效態(tài)在GS中顯著最高,Pb有效態(tài)在XS顯著最高,Pb全量、Cd全量和有效態(tài)、Cr全量和有效態(tài)在4條河流中無顯著差異; 經(jīng)檢測(cè),鄱陽(yáng)湖4河口底泥微生物群落主要有5大類,它們分別是：變形菌門(Proteobacteria)(32.54%～50.35%),酸桿菌門(Acidobacteria)(6.13%～13.13%),擬桿菌(Bacteroidetes)(4.38%～14.92%),疣微菌門(Verrucomicrobia)(6.42%～10.70%)和綠灣菌門(Chloroflexi)(3.21%～11.73%). 多樣性指數(shù)結(jié)果表明：GS、SS微生物多樣性指數(shù)(Chao1和 Shannon)高于RS,與重金屬含量成反相關(guān). 相關(guān)性分析表明：重金屬Cu、Zn、Cd、Pb、Cr、Mn和138個(gè)主要OTU顯著相關(guān),其中Cu、 Cd和微生物門、屬顯著相關(guān)的OTU數(shù)量最多. 變形菌門中有9個(gè)屬和Cu有效量,5個(gè)屬和Cd有效量顯著正相關(guān),這些正相關(guān)的菌群是土壤重金屬污染修復(fù)的重要微生物種質(zhì)資源.

Mi-seq sequencing；土壤微生物；重金屬；鄱陽(yáng)湖

鄱陽(yáng)湖是中國(guó)最大的淡水湖,因承接五大河流(贛江、修河、信江、饒河、撫河,以下簡(jiǎn)稱五河)來水的影響,其沉積物中營(yíng)養(yǎng)水平和重金屬含量呈區(qū)域性差異分布[1].在五河入口處,信江和饒河因上游銅礦的影響使其河口底泥重金屬含量較高,贛江與修河河口含量較低[2].隨著人為活動(dòng)的加劇,底泥中重金屬因挖沙、洪水、微生物活動(dòng)和有機(jī)碳的輸入等作用下,從惰性物質(zhì)轉(zhuǎn)變成可利用的有效態(tài),增加其生物有效性或生物毒性[3-4].微生物作為底泥中最活躍的生物組成部分,對(duì)底泥重金屬含量及存在形式的變化反應(yīng)最直接也最敏感.有研究認(rèn)為微生物多樣性變化與重金屬離子種類[5-7]及污染時(shí)間[8]有關(guān).不同微生物種類對(duì)重金屬的敏感性不同[9-11].如何確定土壤重金屬污染與土壤微生物群落之間的關(guān)系一直是土壤重金屬污染生態(tài)評(píng)價(jià)中的熱點(diǎn)問題[9-11].

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為環(huán)境微生物群落多樣性研究提供了新的視野,重金屬污染對(duì)微生物的影響機(jī)制研究隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用而日愈增多[9-11].Haller等[10]利用熒光定量分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),在重金屬污染的日內(nèi)瓦湖泊沉積物中主要變形菌門、擬桿菌門. Brito等[11]利用T-RFLP技術(shù)發(fā)現(xiàn)萊爾馬淡水湖泊沉積物中主要為放線菌門、變形菌門.高通量測(cè)序技術(shù)相比實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)、末端標(biāo)記限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(T-RFLP)技術(shù)等具有成本低、能做大量平行實(shí)驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn),并且能快速檢測(cè)微生物群落結(jié)構(gòu).

為此,本研究將結(jié)合鄱陽(yáng)湖不同河口底泥重金屬元素(Cu,Zn,Pb,Cd,Cr,Mn)的含量及其分布特征,利用 Illumina平臺(tái)高通量深度測(cè)序技術(shù)分析底泥微生物群落結(jié)構(gòu),將鄱陽(yáng)湖重金屬污染狀況與微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性聯(lián)系起來,尋找鄱陽(yáng)湖不同重金屬污染下微生物種群的變化特征,這對(duì)認(rèn)識(shí)鄱陽(yáng)湖沉積物中重金屬離子對(duì)微生物群落的原位影響,尋找具有高效重金屬污染修復(fù)能力的微生物,闡釋鄱陽(yáng)湖沉積物污染微生物修復(fù)機(jī)理具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據(jù)前人的研究成果[2],本研究選擇了信江(XS)、贛江(GS)、饒河(RS)和修河(SS)河口為重金屬污染程度高低采樣點(diǎn).撫河重金屬含量很低,且因采集的土壤多為沙質(zhì),提取 DNA的量無法進(jìn)行后續(xù)分析,故沒撫河這一樣點(diǎn)的數(shù)據(jù).

每個(gè)采樣地設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn),每個(gè)采樣點(diǎn)距離50m遠(yuǎn),且在每一采樣點(diǎn)設(shè)3～5個(gè)重復(fù).樣品采集用經(jīng)過無金屬涂層加工過的抓斗式漏斗進(jìn)行.每次采樣前先用 10%殺菌劑先對(duì)采樣器進(jìn)行滅菌處理.依次用采樣器采集 0～10cm表層底泥樣品.用滅好菌的竹勺將樣品裝入滅菌自封袋,置于干冰保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室.用于 DNA提取的樣品存于-80℃低溫冰箱中保存.用于其他指標(biāo)分析用的樣品存于4℃冰箱中保存.

1.2 土壤理化指標(biāo)測(cè)定

pH值用水提取法(水土比2.5：1)測(cè)定;土壤有機(jī)碳(Total soil organic C,TOC)采用重鉻酸法測(cè)定[12].

重金屬(Cu,Zn,Pb,Cd,Cr和Mn)含量分析：全量采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的三酸消化.底泥重金屬有效態(tài)、有效鉀和有效磷的提取和測(cè)定分別采取Mehlich-3方法和ICP法.

1.3 DNA 提取、PCR擴(kuò)增及Miseq測(cè)序

采用土壤DNA提取試劑盒(E.Z.N.A. Water DNA Kit)提取土壤DNA,每個(gè)樣地重復(fù)3次采樣,將每個(gè)樣地3個(gè)重復(fù)的DNA樣品合并成一個(gè),檢測(cè)DNA濃度,送華大基因公司測(cè)序.

PCR 擴(kuò)增采用16S rRNA 基因V4可變區(qū)

的細(xì)菌通用引物 515F(5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’,這對(duì)引物所擴(kuò)增的 DNA片段能準(zhǔn)確反映微生物的比例和分類地位[7,11].PCR 下游引物引入標(biāo)簽序列(barcode)和PCR 條件見文獻(xiàn)[13].

擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳,試劑盒回收,用NanoDrop測(cè)定DNA濃度,最后按等物質(zhì)的量比例混合成測(cè)序文庫(kù),回收目的 Amplicon片段,用T4DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4PNK將打斷形成的粘性末端修復(fù)成平末端,再通過3’端加堿基“A”,使得DNA片段能與3’端帶有“T”堿基的特殊接頭連接;最后,用合格的文庫(kù)進(jìn)行 cluster制備和 Mi-seq測(cè)序(Illumina Inc.,San Diego,CA).用下機(jī)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的生物信息分析.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

通過QIIME平臺(tái)去除原始序列中的低質(zhì)量序列[13],根據(jù)標(biāo)簽序列分開來自不同樣品的序列.利用Uchime軟件去除在PCR過程中形成的嵌合體[14],獲得的高質(zhì)量序列用 Usearch方法進(jìn)行聚類[15],以16S rRNA基因序列97%相似度作為分類操作單元(operational taxonomic units,OTUs)的劃分標(biāo)準(zhǔn). Chao1和 Shannon多樣性指數(shù)的計(jì)算利用 QIIME平臺(tái)完成,通過RDP Classifier鑒定OTU代表性序列的微生物分類地位(80%置信水平).方差分析(ANOVA)、Pearson相關(guān)性分析和PCA分析用SPSS Statistics 19.0完成. RDA分析用Canoco 4.5完成.

2 結(jié)果分析

2.1 底泥重金屬含量分析

表1 鄱陽(yáng)湖底泥的化學(xué)性質(zhì)Table 1 Chemical characteristics of soil sediments under Poyang Lake

表2 鄱陽(yáng)湖底泥重金屬總含量Table 2 Total heavy metal contents of soil sediments under Poyang Lake

表1為鄱陽(yáng)湖底泥的化學(xué)性質(zhì),4大河流底泥pH、TOC含量有顯著差異(P＜0.05),表現(xiàn)為SS顯著高于RS;有效P和K沒有顯著差異.表2和表3是各河口底泥重金屬全量及有效態(tài)測(cè)定結(jié)果,從表2和表3可以看出,除Cd和Cr外,RS和GS河流河口底泥Cu、Zn和Mn全量,Cu、Zn、Mn和

Pb有效態(tài)含量均有顯著差異(P＜0.05). Cu、Zn全量和有效態(tài)表現(xiàn)為RS顯著高于GS(P＜0.05),SS和XS介于它們之間. GS的Mn全量和有效態(tài)含量最高,且顯著高于XS. XS的Pb含量最高,SS的Cr含量最高.與《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB15618-1995)相比,在測(cè)試的4條河流中,Cd的含量超過三級(jí)標(biāo)準(zhǔn),Cr沒有污染;RS的Cu和Zn的含量超過二級(jí)標(biāo)準(zhǔn),XS的Cu和Zn的含量超過一級(jí)標(biāo)準(zhǔn),RS和XS的Pb含量超過一級(jí)標(biāo)準(zhǔn),GS的Mn含量最高,但沒給出標(biāo)準(zhǔn),無法確定其污染程度.

表3 鄱陽(yáng)湖底泥重金屬有效態(tài)含量Table 3 Mehlich-3extractable heavy metal contents of soil sediments under Poyang Lake

2.2 底泥微生物多樣性指數(shù)

利用Mi-seq測(cè)序技術(shù)研究鄱陽(yáng)湖RS、XS、SS和GS4條河流河口底泥微生物多樣性,共檢測(cè)到 1,868,376條序列,平均每個(gè)樣品 212782條. PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為 253bp,覆蓋率為 98.7%～99.1%(圖1). Rarefaction曲線趨于平坦,說明測(cè)序數(shù)量趨于飽和,現(xiàn)有的測(cè)序數(shù)據(jù)量對(duì)于獲得新的OTU已經(jīng)足夠.

圖1 鄱陽(yáng)湖濕地4條河流底泥DNA序列的Rarefaction曲線和OTU數(shù)量關(guān)系Fig.1 Rarefaction curves of OTUs clustered at 97% 16S rRNA sequence identity across soil DNA sequence samples from four rivers of Poyang Lake

表4為RS、XS、SS和GS河口底泥的OTU信息和微生物多樣性指數(shù).本文共檢測(cè)到 OTU 18921-32161個(gè), OTU數(shù)量表現(xiàn)為：GS ＞ XS ＞SS ＞ RS.微生物物種數(shù),chao1指數(shù)和 Shannon指數(shù)變化趨勢(shì)表現(xiàn)為：XS ＞ GS ＞ SS ＞ RS. RS的微生物多樣性指數(shù)最低,XS的微生物多樣性指數(shù)最高.

表4 微生物群落多樣性指數(shù)(序列相似性97%)水平Table 4 Sequencing information and microbial diversity indices based on 97% identity of 16S rRNA gene sequences

2.3 底泥微生物群落結(jié)構(gòu)組成

在檢測(cè)到的鄱陽(yáng)湖4河口底泥微生物中,門分類水平上(OTU相對(duì)豐度大于5%)的原核微生物群落組成如圖2所示.鄱陽(yáng)湖4條河流河口底泥微生物主要包括：變形菌門(Proteobacteria, 32.54%～50.35%),平均含量為 41.19%,酸桿菌門(Acidobacteria,6.13%～13.13%),平 均 含 量 為10.06%,擬桿菌門(Bacteroidetes,4.38%～14.92%),平均含量為 9.03%,疣微菌門(Verrucomicrobia, 6.42%～10.70%),平均含量為 8.80%,綠灣菌門

(Chloroflexi,3.21%～11.73%),平均含量為 6.55%.說明變形菌門、酸桿菌門是鄱陽(yáng)湖底泥中的優(yōu)勢(shì)微生物群落.4大河流中,變形菌門表現(xiàn)為：RS ＞SS ＞ GS ＞ XS,其中 RS占 50.35%,XS的占32.54%.酸桿菌門的含量由高到低依次為：GS (13.14%)＞ XS ＞ SS＞ RS(6.13%),其中GS的酸桿菌門含量是RS(的2倍多.擬桿菌門的含量變化順序?yàn)椋篟S ＞ SS ＞ GS ＞ XS.疣微菌門則表現(xiàn)為：SS ＞ GS ＞ RS ＞ XS,每個(gè)樣點(diǎn)差異不大.綠灣菌門表現(xiàn)為：XS ＞ GS ＞ SS ＞ RS,其中XS(11.73%)是RS(3.21%)的近4倍. PCA分析結(jié)果表明RS和SS分別和GS、XS相距較遠(yuǎn),GS和XS的距離相對(duì)較近(圖3),這和RS的污染最嚴(yán)重,SS輕微污染的結(jié)果相吻合.

圖2 微生物群落結(jié)構(gòu)(門分類水平)Fig.2 Relative abundance of bacterial community proportions at phylum level in the soil samples collected from Poyang lake

另外,OTU平均相對(duì)豐度大于 0.5%的還有浮霉菌門(Planctomycetes)(2.21%～3.42%),硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(0.92%～3.60%),廣古菌門(Euryarchaeota)(0.37%～3.96%),綠菌門(Chlorobi) (1.03%～2.40%),放 線 菌 門 (Actinobacteria) (0.67%～2.47%),WS3(0.51%～1.72%),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(0.28%～1.40%),藍(lán) 藻 門(Cyanobacteria) (0.22%～1.51%),泉 古 菌 門(Crenarchaeota) (0.31%～2.31%),厚 壁 菌 門(Firmicutes) (0.22%～1.39%),螺 旋 體 門(Spirochaetes)(0.32%～1.44%),OP8(0.11%～1.89%), OP3(0.18%～1.19%).

圖3 主成分分析Fig.3 PCA (Principal component analysis)

2.4 不同重金屬對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

OTU劃分有助于了解環(huán)境中微生物的種群組成及分布.每一個(gè) OTU代表一種微生物.本研究選擇豐度高于0.05%的262個(gè)OTU,分析其與重金屬含量的Pearson相關(guān)性,結(jié)果表明有138個(gè)OTU與重金屬顯著相關(guān).

2.4.1 將138個(gè)相關(guān)的OTU按豐度梯度(0.05%～0.1%、0.1%～0.5%、0.5%以上)歸類(圖4)當(dāng)豐度在0.05%～0.1%之間時(shí),和重金屬顯著或極顯著正/負(fù)相關(guān)的OTU個(gè)數(shù)最多,為97個(gè),占37%;在0.1%～0.5%之間時(shí),為39個(gè),占15%;在0.5%以上時(shí),只有2個(gè),占0.01%,說明豐度介于0.05%～0.1%的菌群受重金屬影響最大.此外, OTU與重金屬正相關(guān)數(shù)量(218個(gè)OTU)明顯多于負(fù)相關(guān)(75個(gè)OTU);與重金屬有效態(tài)相關(guān)性個(gè)數(shù)(143個(gè) OTU)稍低于與重金

屬全量(150個(gè)OTU).具體表現(xiàn)為：與有效態(tài)A_Cu、A_Pb、A_Zn、A_Cd、A_Cr、A_Mn的正相關(guān)數(shù)量分別為48、7、12、19、10、8個(gè),與全量T_Cu、T_Pb、T_Zn、T_Cd、T_Cr、T_Mn正相關(guān)數(shù)量分別為26、5、21、26、24、12個(gè);和有效態(tài)A_Cu、A_Pb、A_Zn、A_Cd、A_Cr、A_Mn的負(fù)相關(guān)數(shù)量分別為6、12、3、6、5、7個(gè),和全量T_Cu、 T_Pb、T_Zn、T_Cd、T_Cr、T_Mn負(fù)相關(guān)數(shù)量分別為5、2、9、10、4、6個(gè).說明重金屬對(duì)微生物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的菌群大于有抑制作用菌群,那些與重金屬含量成正相關(guān)的菌群被定義為耐受菌群,與重金屬含量呈負(fù)相關(guān)的菌群被定義為敏感菌群.這些耐受或敏感菌群正是土壤重金屬污染修復(fù)或指示的重要種質(zhì)資源.

圖4 不同豐度的OTU和重金屬含量的顯著正(A)/負(fù)(B)相關(guān)性個(gè)數(shù)Fig.4 Significant positive (A) and negative (B) relation numbers of soil heavy metal content with OTU of three richness threshold values (＞0.5%; 0.5%～0.1%; and 0.1%～0.05%)

2.4.2 將138個(gè)相關(guān)的OTU序列比對(duì)到微生物門水平 共比對(duì)到12個(gè)門和6類重金屬全量、有效態(tài)顯著或極顯著相關(guān)(表5).其中優(yōu)勢(shì)菌變形菌門和重金屬相關(guān)OTU個(gè)數(shù)最多(155個(gè))：β-變形菌綱和重金屬Cu、Zn、Cd、Mn全量和有效態(tài)主要為顯著正相關(guān),與有效態(tài)A_Pb、A_Cr為顯著負(fù)相關(guān),與全量T_Pb、T_Cr既有正相關(guān),也有顯著負(fù)相關(guān);δ-變形菌綱和 Cu、Cd、Cr、Zn全量和有效態(tài)主要為正顯著相關(guān),與 Mn全量和有效態(tài)主要為負(fù)顯著相關(guān);γ-變形菌綱與 Cu全量和有效態(tài)正相關(guān),和有效態(tài) A_Pb顯著負(fù)相關(guān);α-變形菌綱和有效態(tài)A_Cu、全量T_Pb、T_Zn顯著正相關(guān).說明變形菌門中多數(shù)為耐受菌,少數(shù)為敏感菌.其他優(yōu)勢(shì)菌如擬桿菌門、疣微菌門、酸桿菌門、綠灣菌門和重金屬也有顯著相關(guān)性.擬桿菌門對(duì)六類重金屬的有效態(tài)表現(xiàn)為耐受性,特別是對(duì) A_Cu的耐受菌最多,對(duì)全量 T_Cd、T_Zn、T_Cu的耐受菌較多. 酸桿菌門對(duì)重金屬

A_Cu、A_Pb、A_Cd、T_Cd、T_Cr較敏感,表現(xiàn)為負(fù)顯著相關(guān).疣微菌門與有效態(tài)和全量 Cu、Pb、Cd主要呈顯著負(fù)相關(guān),說明其對(duì) Cu、Pb、Cd污染敏感.

2.4.3 將138個(gè)顯著相關(guān)的OTU序列比對(duì)到微生物屬水平 發(fā)現(xiàn)39個(gè)OTU比對(duì)到24個(gè)屬,這24屬中,除了紅長(zhǎng)命菌屬、假單胞菌屬(OTU7558,OTU3859)、Tolumonas、柄桿菌屬、Prochlorococcus、硝化螺旋菌屬和部分重金屬顯著負(fù)相關(guān)外,其他菌屬和不同重金屬顯著正相關(guān)(表6).變形菌門 13個(gè)屬和重金屬顯著正相關(guān)：其中9個(gè)屬和有效態(tài)A_Cu顯著正相關(guān),有6個(gè)屬和全量T_Cu顯著正相關(guān),5個(gè)屬和效態(tài)A_Cd顯著正相關(guān). 疣微菌門、擬桿菌門分別有2個(gè)屬和重金屬顯著正相關(guān)：表現(xiàn)為L(zhǎng)uteolibacter和T_Cr,突柄桿菌屬和A_Cu,黃桿菌屬和A_Cu,Arcicella和A_Cu、A_Cd、T_Cu顯著正相關(guān).另外,非優(yōu)勢(shì)菌群藍(lán)藻門、放線菌門和硝化螺旋菌門分別有4、2、1個(gè)屬和重金屬顯著相關(guān).通過環(huán)境變量和微生物屬水平的RDA分析也得出了類似的結(jié)果(圖5).

24屬39個(gè)OTU中除了13個(gè)OTU序列和單種重金屬顯著相關(guān)外,其他26個(gè)OTU序列和2種或以上重金屬或一種重金屬的有效態(tài)、全量均顯著相關(guān).如紫色桿菌屬中OTU16442和A_Cu、A_Cr、T_Cu顯著正相關(guān),硫桿菌屬(OTU10013)和A_Cu、A_Zn、A_Cd、T_Cu、T_Pb顯著正相關(guān).地桿菌屬OTU7599和A_Cu、A_Cd、T_Cu、T_Zn、T_Cd顯著正相關(guān),OTU1499和 A_Cu、A_Zn、A_Cd、T_Cu、T_Zn顯著正相關(guān).說明紫色桿菌屬、硫桿菌屬、地桿菌屬在復(fù)合重金屬污染中的具有一定耐受能力.

圖5 RDA分析Fig.5 RDA analysis

表5 重金屬全量和有效態(tài)對(duì)微生物門類(相對(duì)豐度高于0.05%)的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)Table 5 Correlation of total and mehlich-3extractable heavy metals and microbe abundance higher than 0.05% at phylum level

續(xù)表5

表6 重金屬全量和有效態(tài)對(duì)微生物屬(相對(duì)豐度高于0.05%)的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)Table 6 Pearson’s correlation of total and mehlich-3extractable heavy metals with dominant genus of microbe (relative abundance ＞ 0.05%)

3 討論

3.1 鄱陽(yáng)湖底泥微生物群落的結(jié)構(gòu)組成

本研究利用Mi-seq高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)鄱陽(yáng)湖底泥中豐度高于0.5%的微生物歸屬于16個(gè)門,其中優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門、酸桿菌門、疣微菌

門、擬桿菌門、綠灣菌門,表明這些菌都能在厭氧環(huán)境中生長(zhǎng),是鄱陽(yáng)湖底泥微生物信息的重要補(bǔ)充. Haller等[10]利用熒光定量分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),在重金屬污染的日內(nèi)瓦湖泊沉積物中主要變形菌門、擬桿菌門. Brito等[11]利用T-RFLP技術(shù)發(fā)現(xiàn)萊爾馬淡水湖泊沉積物中主要為放線菌門、變形菌門.與這些淡水湖泊相比,鄱陽(yáng)湖底泥中發(fā)現(xiàn)了更多的微生物種類,這同時(shí)也說明Mi-seq高通量測(cè)序技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中具有重要的作用[16-17].任麗娟等[18]報(bào)道淡水湖泊和河流水體中,微生物類群主要為變形菌門、藍(lán)藻菌門、放線菌門、擬桿菌門、疣微菌門. Zhu等[19]利用454平臺(tái)高通量測(cè)序技術(shù)在中國(guó)南海底泥中的優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、放線菌門和綠灣菌門,其中γ-變形菌綱最豐富,含量達(dá)42.6%.本研究也發(fā)現(xiàn)變形菌門豐度最高,其中 β-變形菌綱最豐富,得到了與上述研究類似的優(yōu)勢(shì)菌,說明不同生境中微生物群落組成類似,但豐度有差異.

3.2 重金屬對(duì)土壤微生物多樣性的影響

近年來,土壤重金屬污染與土壤微生物群落之間的關(guān)系一直是土壤重金屬污染生態(tài)研究中的熱點(diǎn)問題.雖然不同微生物對(duì)不同重金屬的敏感性不一致,但多數(shù)研究表明重金屬污染能明顯影響微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性[20-21].

RS和XS的的Cu、Pb、Zn、Cd含量明顯高于GS和SS,這在張杰等[22]的研究中也有報(bào)道.張杰等[22]認(rèn)為RS和XS已嚴(yán)重受到重金屬的污染,SS和GS的污染程度較輕. SS和GS的重金屬污染程度輕,其微生物多樣性(Observed species, Chao1和 Shannon多樣性指數(shù))高,物種較豐富;RS的污染重,其微生物多樣性指數(shù)低(表2～表4),物種數(shù)下降.與 RS相比,XS的污染也嚴(yán)重,但其微生物多樣性指數(shù)并沒有下降,而是介于 SS和GS之間. 同樣是重金屬含量相對(duì)較高的 XS和 RS微生物多樣性指數(shù)卻有明顯差異,說明重金屬對(duì)微生物的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[7,24-26],還受到其他因素的影響,如pH、TOC、重金屬的有效態(tài)等[23].Nakatsu等[27]曾發(fā)現(xiàn) Cr(VI)含量高的土壤中放線菌豐富,說明鉻對(duì)微生物影響可能較小,并無明顯毒害作用,這和本文中 Cr的結(jié)果是相吻合的,Cr在SS和GS中高,但Cr含量沒超過《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB15618-1995)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn),因此對(duì)微生物的影響很小,微生物多樣性指數(shù)依然保持較高水平.

3.3 重金屬對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

Prasad等[28]的研究結(jié)果表明不同微生物種類對(duì)重金屬的耐受程度不同.本研究通過分析OTU豐度和重金屬之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)：在高豐度(＞0.5%)時(shí),2個(gè)門(變形菌門和酸桿菌門)和重金屬顯著相關(guān);在 0.1%～0.5%豐度時(shí),6個(gè)門類和重金屬顯著相關(guān),其中以變形菌門為主;在 0.05%～0.1%豐度時(shí),12個(gè)門類和重金屬顯著相關(guān)(圖 4,表5).這些結(jié)果表明,隨著OTU豐度的改變,與重金屬相關(guān)的微生物種類明顯不同.

4條河流中微生物群落結(jié)構(gòu)分布差異明顯,如GS的酸桿菌門含量是RS的2倍多,XS的綠灣菌門(11.73%)是RS(3.21%)的近4倍,表明重金屬含量除了影響微生物多樣性外,還影響微生物的組成和豐度. RS的Cu、Pb、Zn顯著高于GS,而酸桿菌門豐度只有GS的一半不到,說明Cu、Pb、Zn抑制酸桿菌門的生長(zhǎng).相關(guān)性分析表明,酸桿菌門和有效Cu、Pb顯著負(fù)相關(guān)(表5). 酸桿菌門是新近基于分子生物學(xué)研究劃分的新細(xì)菌類群,嗜酸菌,且多為不可培養(yǎng)細(xì)菌,對(duì)重金屬污染的響應(yīng)研究還很少. Frazar等[29]和Gillan等[30]研究表明,變形菌門對(duì)重金屬的耐受能力最強(qiáng),本研究也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果(表 5～表 6).變形菌門為革蘭氏陰性菌,有研究表明革蘭氏陰性菌中單胞菌屬的丁香假單胞菌cop基因?qū)u有耐受性[31],后來發(fā)現(xiàn)很多微生物中含有這個(gè)基因.本文通過相關(guān)性和RDA分析(表6,圖5)發(fā)現(xiàn)變形菌門中Methylotenera、紫色桿菌屬、硫桿菌屬、胞菌屬、假單胞菌屬、地桿菌屬、慢生根瘤菌屬、紅桿菌屬等 9個(gè)屬和 A_Cu顯著或極顯著正相關(guān); Methylotenera、紫色桿菌屬、硫桿菌屬、胞菌屬、地桿菌屬、慢生根瘤菌屬等6個(gè)屬和T_Cu顯著或極顯著正相關(guān),這些菌是否含有cop基因,需要進(jìn)一步驗(yàn)證.

另外,變形菌門(β,γ-變形菌綱)和A_Pb表現(xiàn)

為正、負(fù)相關(guān),說明Pb對(duì)β,γ-變形菌綱的影響是復(fù)雜(表5). Zhang等[32]在實(shí)驗(yàn)室分析Pb污染對(duì)土壤微生物影響也發(fā)現(xiàn)變形菌門最豐富,特別是α,β,γ,δ-變形菌綱.變形菌門為重金屬污染土壤中的優(yōu)勢(shì)群,可能與其廣泛的降解代謝有關(guān)以及生境廣泛有關(guān)[33].信江 Pb的含量最高,而疣微菌門含量最低,且疣微菌門和A_Pb、T_Pb負(fù)相關(guān)(表5),說明Pb不利于疣微菌門微生物生長(zhǎng),因?yàn)镻b和酶活性基團(tuán)如-SH,-NH2,-OH,-COOH,等可形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵,導(dǎo)致酶活性位點(diǎn)的關(guān)閉,間接提高對(duì)微生物的毒性[32].

Rajapaksha等[34]發(fā)現(xiàn)重金屬對(duì)革蘭氏陰性菌中假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌屬、叢毛單胞菌屬、貪噬菌屬、勞爾氏菌屬、伯克氏菌屬和黃桿菌屬等7個(gè)屬有耐受性,而本研究中發(fā)現(xiàn)重金屬和24個(gè)屬顯著相關(guān)(表6,圖5).和Rajapaksha等[34]報(bào)道的耐受菌類別相比,本研究獲得的可能的耐受菌屬更多.

4 結(jié)論

4.1 信江,饒河,修河,贛江4條河流河口底泥中,除Cd和Cr,其他4種重金屬Cu、Pb、Zn、Mn總含量和有效態(tài)差異均達(dá)到顯著水平. 其中饒河的 T_Zn含量顯著高于信江、贛江和修河(P＜0.05),贛江的T_Mn顯著高于饒河、信江和修河(P＜0.05). 重金屬有效態(tài)A_Cu、A_Pb、A_Zn表現(xiàn)為饒河和信江高于修河和贛江,且差異達(dá)顯著水平(P＜0.05),信江的 A_Mn顯著低于其他三河口.

4.2 鄱陽(yáng)湖4條河流河口底泥沉積物微生物群落主要有：變形菌門,酸桿菌門,擬桿菌,疣微菌門,綠灣菌門,其豐度分別為 41.19%,10.06%,9.03%, 8.80%,和6.55%.

4.3 變形菌門對(duì)重金屬 Cu、Cd的耐受性最明顯,其中9個(gè)屬和A_Cu,5個(gè)屬和A_Cd顯著正相關(guān),這些正相關(guān)的菌群是土壤重金屬修復(fù)的重要種質(zhì)資源.

4.4 重金屬污染對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.RS的重金屬污染重,其微生物多樣性指數(shù)低.Cr和Mn含量分別在SS和GS中最高,但SS和GS的微生物多樣性指數(shù)依然保持較高水平.

[1] 王圣瑞,倪 棟,焦立新,等.鄱陽(yáng)湖表層沉積物有機(jī)質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)鹽分布特征 [J]. 環(huán)境工程技術(shù)學(xué)報(bào), 2012,2(1)：23-28.

[2] 李 鳴.鄱陽(yáng)湖重金屬污染特征研究及環(huán)境容量估算 [D]. 南昌：南昌大學(xué), 2010.

[3] Beveridge T J, Hughes M N, Lee H, et al. Metal-microbe interactions： Contemporary approaches [J]. Advances in Microbial Physiology, 1997,38：177-243.

[4] Newman D K, Banfield J F. Geomicrobiology： how molecularscale interactions underpin biogeochemical systems [J]. Science, 2002,296(5570)：1071-1077.

[5] Singh B K, Quince C, Macdonald C A, et al. Loss of microbial diversity in soils is coincident with reductions in some specialized functions [J]. Environmental Microbiology, 2014,16(8)：2408-2420.

[6] Islam E, Paul D, Sar P. Microbial diversity in uranium deposits from jaduguda and bagjata uranium mines, india as revealed by clone library and denaturing gradient gel electrophoresis analyses [J]. Geomicrobiology Journal, 2014,31(10)：862-874.

[7] Liu Y R, Wang J J, Zheng Y M, et al. Patterns of bacterial diversity along a long-term mercury-contaminated gradient in the paddy soils [J]. Microbial Ecology, 2014,68(3)：575-583.

[8] Yuan G L, Liu C, Chen L, et al. Inputting history of heavy metals into the inland lake recorded in sediment profiles： Poyang Lake in China [J]. Journal of Hazardous Materials, 2011,185(1)：336-345.

[9] Hoostal M J, Gabriela Bidart-Bouzat M, Bouzat J L Local adaptation of microbial communities to heavy metal stress in polluted sediments of Lake Erie [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2008,65(1)：156-168.

[10] Haller L, Tonolla M, Zofi J, et al. Composition of bacterial and archaeal communities in freshwater sediments with different contamination levels (Lake Geneva, Switzerland) [J]. Water Research, 2011,45(3)：1213-1228.

[11] Brito E M S, De la Cruz Barrón M, Caretta C A, et al. Impact of hydrocarbons, PCBs and heavy metals on bacterial communities in Lerma River, Salamanca, Mexico： Investigation of hydrocarbon degradation potential [J]. Science of the Total Environment, 2015,521-522：1-10.

[12] 魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法 [M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000.

[13] Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. Q I I M E allows analysis of high-throughput community sequencing data [J]. Nature Methods, 2010,7(5)：335-336.

[14] Edgar R C, Haas B J, Clemente J C, et al. U C H I M E improves

sensitivity and speed of chimera detection [J]. Bioinformatics, 2011,27(16)：2194-2000.

[15] Edgar R C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST [J]. Bioinformatics, 2010,26(19)：2460-2461.

[16] Julia M, Bella D, Bao Y G, et al. High throughput sequencing methods and analysis for microbiome research [J]. Journal of Microbiological Methods, 2013,95：401-414.

[17] Vasileiadis S, Puglisi E, Arena, M, et al. Soil bacterial diversity screening using single 16S rRNA gene V regions coupled with multi-million read generating sequencing technologies [J]. PLoS ONE, 2012：e42671.

[18] 任麗娟,何 聃,邢 鵬,等.湖泊水體細(xì)菌多樣性及其生態(tài)功能研究進(jìn)展 [J]. 生物多樣性, 2013,21(4)：421-432.

[19] Zhu D, Tanabe SH, Yang C, et al. Bacterial Community Composition of South China Sea Sediments through Pyrosequencing-Based Analysis of 16S rRNA Genes [J]. PLoS ONE, 2013,8(10)：e78501.doi：10.1371/journal.pone.0078501

[20] 陳承利,廖 敏,曾路生.污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及功能多樣性測(cè)定方法 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2006,26(10)：3404-3409.

[21] Wasilkowski D, Mrozik A, Piotrowska-Seget Z, et al. Changes in enzyme activities and microbial community structure in heavy metal-contaminated soil underin situaided phytostabilization [J]. CLEAN - Soil, Air, Water, 2014,42(11)：1618-1625.

[22] 張 杰,陳 熙,劉倩純,等.鄱陽(yáng)湖主要入湖口重金屬的分布及潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià) [J]. 長(zhǎng)江流域資源與環(huán)境, 2014,23(1)：95-100.

[23] 崔紅標(biāo),范玉超,周 靜,等.改良劑對(duì)土壤銅鎘有效性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2016,36(1)：197-205.

[24] 韓桂琪,王 彬,徐衛(wèi)紅,等.重金屬Cd、Zn、Cu、Pb復(fù)合污染對(duì)土壤微生物和酶活性的影響 [J]. 水土保持學(xué)報(bào), 2010,(5)：238-242.

[25] 滕 應(yīng),黃昌勇,駱永明,等.鉛鋅銀尾礦區(qū)土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究 [J]. 土壤學(xué)報(bào), 2004,41(1)：113-119.

[26] 汪仲瓊,王為東,祝貴兵,等.人工和天然地蘆葦根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的比較 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011,31(16)：4489-4498.

[27] Nakatsu C H, Carmosini N, Brett B, et al. Soil microbial community responses to additions of organic carbon substrates and heavy metals (Pb and Cr) [J]. Applied Environmental Microbiology, 2005,71(12)：7679-7689.

[28] Prasad M N V. Metals in the Environment： Analysis by Biodiversity [M]. CRC Press (New York). 2001,

[29] Frazar C, Gannon J E, Ramsey P, et al. Differences in hyporheiczone microbial community structure along a heavy-metal contamination gradient [J]. Applied Environmental Microbiology, 2003,69：5563-5573.

[30] Gillan D C, Danis B, Pernet P, et al. Structure of sediment associated microbial communities along a heavy-metal contamination gradient in the marine environment [J]. Applied Environmental Microbiology, 2005,1 71：679-690.

[31] Mellano M A, Cooksey D A. Nucleotide sequence and organization of copper resistance genes from Pseudomonas syringae pv. tomato [J]. Journal of Bacteriology, 1988,170：2879-2883.

[32] Zhang W, Chen L, Zhang R, et al. High throughput sequencing analysis of the joint effects of BDE209-Pb on soil bacterial community structure [J]. Journal of Hazardous Materials, 2016, 301：1-7.

[33] Sinkko H, Lukkari K, Sihvonen L M, et al. Bacteria contribute to sediment nutrient release and reflect progressed eutrophicationdriven hypoxia in an organic-rich continental sea [J]. PLoS ONE, 2013,8,e67061.

[34] Rajapaksha R M C P, Tobor-Kap?on M A, B??th E. Metal toxicity affects fungal and bacterial activities in soil differently [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004,70(5)：2966–2973.

Effect of heavy metals in the sediment of Poyang Lake estuary on microbial communities structure base on Mi-seq sequencing.

JIANG Yu-mei1, ZHANG Chen1, HUANG Xiao-lan1, NI Cai-ying1*, WANG Jin-feng1, SONG Peng-fei1, ZHANG Zhi-bin1,2(1.Jiangxi Provincial Key Lab of Protection and Utilization of Subtropical Plant Resources, Key Laboratory of Poyang Lake Wetland and Watershed Research (Ministry of Education), Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China；2.Key laboratory of Watershed Ecology and Geographical Environment Monitoring, NASG, Nanchang 330209, China). China Environmental Science, 2016,36(11)：3475～3486

An alternative approach based on the high-throughout Mi-seq sequencing technology was used in this study to analyze microbial communities of the sediments polluted by heavy metals from Poyang Lake estuaries including Xinjiang river (XS), Raohe river (RS), Xiushui river (SS) and Ganjiang river (GS), which aimed to understand how microbial community composition response to different heavy metals (Cu、Zn、Cd、Pb、Cr and Mn). Contents of total Cu (T_Cu) and Zn (T_Zn) in RS and XS were significantly higher than those in other rivers (SS and GS), and the content of total Mn (T_Mn) in GS was the highest, but the content of available Pb (A_Pb) was the highest in XS among the four river estuaries. On the other hand, total Pb (T_Pb), total and available Cd (T_Cd and A_Cd), and total and available Cr (T_Cr and A_Cr) among four rivers estuaries had no significant difference with each other. The microbial communities explored by 16S rRNA gene sequencing were distributing mainly in five broad taxonomic groups, which were Proteobacteria (32.54%～50.35%), Acidobacteria (6.13%～13.13%), Bacteroidetes (4.38%～14.92%), Verrucomicrobia (6.42%～10.70%) and Chloroflexi (3.21%～11.73%). The microbial diversity index (Chao 1and Shannon) of SS and GS were much higher than those of the RS, which resulted from much higher heavy metals in RS than the others. Correlation analysis showed that both kinds (total and available) of heavy metal ions (Cu、Zn、Cd、Pb、Cr and Mn) measured had significantly positive or negative relation with 138 operational taxonomic units (OTUS) among all OTUS (18921～32161) detected, and Cu

Mi-seq；sequencing；soil microbe；heavy metals；Poyang Lake

X172

A

1000-6923(2016)11-3475-12

江玉梅(1976-),女,江西萬年人,副教授,博士,主要研究方向?yàn)橥寥牢⑸飳W(xué).發(fā)表論文15篇.

2016-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41061037,31460147,41461042);江西省青年科學(xué)家(20142BCB23010);鄱陽(yáng)湖濕地與流域研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金(ZK2013007,ZK2013001);流域生態(tài)與地理環(huán)境監(jiān)測(cè)國(guó)家測(cè)繪地理信息局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助(WE2016010)

* 責(zé)任作者, 教授, ncy1919@126.com

and Zn had the most related OTU numbers among all metals. For example, A_Cu were positively related with nine genera in Proteobacteria, and A_Cd positively related with five genera in the same phylum. These microbes may be the important species resource for restoration of damaged water or land area polluted by heavy metals.