梅建鳳，李 靚，易 喻，陳建澍，張彥璐，應(yīng)國清

(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

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紫變青霉生物轉(zhuǎn)化根皮苷制備根皮素的研究

梅建鳳，李 靚，易 喻，陳建澍，張彥璐，應(yīng)國清

(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

為了開發(fā)一種生物轉(zhuǎn)化根皮苷生成根皮素的工藝，首先從蘋果皮富集培養(yǎng)物中分離篩選微生物菌株，進而優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基主要組成、pH和轉(zhuǎn)化條件，提高根皮素的轉(zhuǎn)化得率.結(jié)果從富集培養(yǎng)物中篩選到一株紫變青霉(Penicilliumpurpurescens)QL-9204菌株，經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)制備的粗酶液能轉(zhuǎn)化根皮苷為根皮素；在產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為蔗糖2 g/L，(NH4)2SO46 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO41 g/L，MnSO41 g/L，pH=6時，QL-9204菌株經(jīng)種子擴培后接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)5 d，濾除菌體的粗酶液中加入80 mg/L的根皮苷，于30 ℃，250 r/min轉(zhuǎn)化14 h后，根皮素的轉(zhuǎn)化得率可達90.3%.利用紫變青霉菌QL-9204發(fā)酵制備的粗酶液轉(zhuǎn)化根皮苷制備根皮素，具有方法簡單、轉(zhuǎn)化得率高和成本低的優(yōu)勢，有潛在的工業(yè)化應(yīng)用價值.

根皮素；根皮苷；生物轉(zhuǎn)化；紫變青霉

根皮素(phloretin)，又名三羥苯酚丙酮，化學名3-(4-羥基苯基)-1-(2,4,6-三羥基苯基)-1-丙酮，屬于二氫查爾酮化合物.根皮素廣泛存在于荔枝、蘋果、梨等水果以及多種蔬菜中，因在這些植物的根莖或根皮中含量較為集中而得名[1].根皮素具有較好的抗氧化、抗自由基作用，能抑制黑色素細胞活性，對色斑有很好的淡化作用[2]；不僅如此，根皮素還具有很好的抗炎和免疫抑制作用[3-4]；最新研究表明根皮素還具有抗腫瘤及抗癌活性[5-7].從天然植物中提取根皮素，收率往往較低，得到的多是其糖苷形式，即根皮苷(phlorizin)[8-9].根皮苷可以經(jīng)酸堿水解得到根皮素.采用酸堿水解法雖然具有成本低的優(yōu)勢[10-11]，但存在轉(zhuǎn)化專一性差、產(chǎn)品需脫色和易造成環(huán)境污染等不足，應(yīng)用有一定的限制；采用生物法轉(zhuǎn)化天然產(chǎn)物，往往具有轉(zhuǎn)化專一性高、條件溫和及產(chǎn)品純度高等優(yōu)點[12-13].采用生物轉(zhuǎn)化根皮苷制備根皮素，使用純化的糖苷酶[14]，因酶不能回收重復(fù)利用，必然導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高.如果利用微生物發(fā)酵制備含糖苷酶的粗酶液來轉(zhuǎn)化天然糖苷，只要避免雜酶對苷元結(jié)構(gòu)的水解，就能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化目標，則省去酶的分離和純化步驟，可以突破酶制劑成本較高的瓶頸[15].

筆者篩選出轉(zhuǎn)化專一性較好的微生物菌株，發(fā)酵制備含糖苷酶的粗酶液，在粗酶液中加入根皮苷，就能轉(zhuǎn)化為根皮素，且根皮素不會被水解，可以獲得較高的轉(zhuǎn)化得率，可以克服酸堿水解和純酶水解法的不足，具有反應(yīng)條件溫和、專一性強、生產(chǎn)成本低和環(huán)境友好的優(yōu)點.

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1200型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，色譜柱為Phenomenex Luna C18鍵合硅膠柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；YXQ-LS-70A高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)；SW-CJ-1BU超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；DHP-9402恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；HZ-9311K恒溫振蕩培養(yǎng)箱(太倉華利達實驗設(shè)備有限公司)以及其他常規(guī)實驗儀器.

根皮苷和根皮素標準品(西安開來生物工程有限公司，批號分別K141013和K141101，純度98%)，以及各類常用的市售色譜純或分析純商品試劑.

1.2 培養(yǎng)基

平板和斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，種子培養(yǎng)基采用馬鈴薯培養(yǎng)基(PDB)[16]；初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成：蔗糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO41 g/L，MnSO41 g/L，pH=6.所有培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.3 方 法

1.3.1 菌種的富集與分離

250 mL三角瓶中加入約50 g經(jīng)粉碎的新鮮蘋果皮，置于28 ℃的恒溫箱培養(yǎng)5 d.用無菌水將長滿霉菌的富集物稀釋106～107倍后，涂布于PDA上，于28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取顏色和形態(tài)不同的霉菌菌落轉(zhuǎn)接PDA斜面培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，得孢子豐富的純種菌株斜面.

1.3.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)

菌種篩選時，用接種環(huán)挑取分離得到的菌株孢子直接接種100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基；產(chǎn)酶條件優(yōu)化時，挑取菌種斜面孢子接種PDB種子培養(yǎng)基，于30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，再移取種子液5 mL接種100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基.接種后的產(chǎn)酶培養(yǎng)基于30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d.

1.3.3 根皮苷的生物轉(zhuǎn)化

微生物產(chǎn)酶培養(yǎng)物用4層紗布過濾，濾液即為粗酶液.取50 mL粗酶液于250 mL三角瓶中，根皮苷用甲醇配制成10 g/L的溶液加入粗酶液中，于30 ℃，250 r/min振蕩轉(zhuǎn)化8～15 h.

1.3.4 根皮素和根皮苷的質(zhì)量濃度分析

轉(zhuǎn)化結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液10 mL用同等體積的乙酸乙酯萃取2 次，合并乙酸乙酯，45 ℃下減壓蒸干，用1 mL甲醇溶解殘留物，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾.用HPLC分析甲醇溶液中根皮苷和根皮素的質(zhì)量濃度.色譜檢測條件：流動相為V(甲醇)∶V(水)=7∶3，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，進樣量10 μL，由相同分析條件下的根皮苷和根皮素質(zhì)量濃度—峰面積標準曲線計算樣品中的兩者的質(zhì)量濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化菌株的篩選

蘋果皮中根皮苷含量較高，且天然蘋果皮中本身帶有大量的微生物，其中可能會有可以轉(zhuǎn)化根皮苷的微生物存在，所以用蘋果皮作為微生物分離源，篩選能轉(zhuǎn)化根皮苷為根皮素的微生物菌株.從蘋果皮富集物中分離到11 個霉菌菌株，利用這些菌株發(fā)酵制備的粗酶液轉(zhuǎn)化根皮苷，在底物質(zhì)量濃度為20 mg/L時，不同菌株轉(zhuǎn)化根皮苷生成根皮素得率見表1.

表1 不同分離菌株轉(zhuǎn)化根皮苷生成根皮素的得率

Table 1 The yield of phloretin from phlorizin after bioconversion by different isolated strains %

由表1可知：大部分菌株轉(zhuǎn)化能力較弱，僅有QL-9204，QL-9004，QL-0906菌株轉(zhuǎn)化能力較好，其中QL-9204菌株最佳，根皮素的轉(zhuǎn)化得率達到32.7%.雖然根皮素轉(zhuǎn)化得率不高，但轉(zhuǎn)化體系中還有大量根皮苷存在(HPLC分析圖譜見圖1)，根皮苷和根皮素的總摩數(shù)未降低，說明兩者未被水解，進一步優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)化條件，轉(zhuǎn)化得率能夠得以提高.

1—根皮苷和根皮素標準品；2—轉(zhuǎn)化0 h對照；3—QL-9204菌株轉(zhuǎn)化樣品圖1 根皮苷生物轉(zhuǎn)化為根皮素HPLC分析圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of phlorizin and phloretin after bioconversion

2.2 QL-9204菌株的鑒定

QL-9204菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d后，平板表面長出白色絮狀的菌絲體，氣生菌絲長度在1～2 mm，菌落邊緣呈鋸齒狀不整齊，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，菌落正面逐漸變灰綠色，背面逐漸變?yōu)樽霞t色.顯微鏡下觀察菌絲孢子絲呈掃帚狀，1～2 層小梗，分生孢子串呈不分枝的鏈狀，橢圓形，淡黃色，表面粗糙.符合青霉屬(Penicillium)菌株的形態(tài)特征.該菌株交由生工生物工程(上海)有限公司進行18S rDNA測序，測得序列長度為1 318 bp.將該序列在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行BLAST比對，與30 株以上的紫變青霉菌株的18S rDNA序列有99%以上的相似度.綜合QL-9204菌株的形態(tài)特征和18S rDNA的序列分析，可以確定QL-9204菌株為一株紫變青霉(Penicilliumpurpurogenum)，該菌株提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號CCTCC No: M 2015781.

2.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基碳源種類及質(zhì)量濃度

考察了產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳源種類對根皮素得率的影響，將初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的蔗糖分別替換為5 g/L的葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖和果糖.QL-9204菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)制備的粗酶液轉(zhuǎn)化根皮苷，在底物質(zhì)量濃度為20 mg/L時，根皮素的轉(zhuǎn)化得率見圖2.

圖2 培養(yǎng)基碳源種類對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響Fig.2 Effects of different carbon source on the yield of phloretin

由圖2可知：在產(chǎn)酶培養(yǎng)基碳源為單糖葡萄糖時，QL-9204菌株產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化根皮苷生成根皮素的得率最低，甚至低于不加碳源時的得率；而碳源為二糖或多糖時，根皮素得率則顯著提高，說明轉(zhuǎn)化根皮苷為根皮素的糖苷酶需要含糖苷鍵的糖類誘導(dǎo)生成.在碳源為蔗糖時，根皮素得率最高，達到39.3%，進而考察了蔗糖質(zhì)量濃度對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響，結(jié)果見圖3.

圖3 蔗糖質(zhì)量濃度對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響Fig.3 Effects of sucrose concentration on the yield of phloretin

由圖3可知：當蔗糖質(zhì)量濃度為2 g/L時，根皮素的轉(zhuǎn)化得率最高，達到了42.2%.當蔗糖質(zhì)量濃度提高時，菌體生物量雖然有明顯增加，但根皮素的轉(zhuǎn)化得率反而降低，這可能是因為菌體生長過旺，產(chǎn)生的水解酶對根皮素的降解作用增強.

2.3.2 培養(yǎng)基氮源種類與質(zhì)量濃度

考察了不同種類的氮源對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響.選取蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉膏、(NH4)2SO4和NaNO3作為培養(yǎng)基中的氮源，不同氮源的培養(yǎng)基含氮質(zhì)量濃度均配制為1 g/L.QL-9204菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)制備的粗酶液轉(zhuǎn)化根皮苷，在底物質(zhì)量濃度為20 mg/L時，根皮素的轉(zhuǎn)化得率見圖4.

圖4 培養(yǎng)基氮源種類對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響Fig.4 Effects of different nitrogen source on the yield of phloretin

由圖4可知：產(chǎn)酶培養(yǎng)基氮源為(NH4)2SO4時(質(zhì)量濃度為4.72 g/L)，根皮素的轉(zhuǎn)化得率最高，達到51.9%.進而考察了產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4質(zhì)量濃度對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響，結(jié)果見圖5.

圖5 (NH4)2SO4的質(zhì)量濃度對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響Fig.5 Effects of (NH4)2SO4 concentration on the yield of phloretin

由圖5可知：在(NH4)2SO4質(zhì)量濃度從1 g/L增加到6 g/L時，根皮素的轉(zhuǎn)化得率隨(NH4)2SO4質(zhì)量濃度增加而提高，之后便不再增加，所以最佳的(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為6 g/L，此時根皮素的轉(zhuǎn)化得率為52.7%.

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH

不同初始pH對微生物的生長和產(chǎn)酶活性有很大的影響，便考察了產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH對根皮素得率的影響.在產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為蔗糖2 g/L，(NH4)2SO46 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO41 g/L，MnSO41 g/L時，用濃度為2 mol/L的HCl或NaOH將培養(yǎng)基初始pH調(diào)成4～7.QL-9204菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)制備的粗酶液轉(zhuǎn)化根皮苷，在底物質(zhì)量濃度為20 mg/L時，根皮素的轉(zhuǎn)化得率見圖6.

圖6 培養(yǎng)基初始pH對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響Fig.6 Effects of initial medium pH on the yield of phloretin

由圖6可知：在培養(yǎng)基初始pH對QL-9204菌株產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化根皮苷為根皮素的得率有顯著影響，在初始pH低于6時，隨初始pH的升高，根皮素轉(zhuǎn)化得率顯著提高；初始pH為6時，得率最高；初始pH高于6之后，轉(zhuǎn)化得率便顯著下降.

2.4 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.4.1 底物的質(zhì)量濃度

為了提高轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率，首先對底物根皮苷質(zhì)量濃度進行優(yōu)化，底物的添加質(zhì)量濃度分別為20，40，60，80，100，120 mg/L.QL-9204菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)制備的粗酶液轉(zhuǎn)化根皮苷，根皮素的轉(zhuǎn)化得率見圖7.

圖7 根皮苷的質(zhì)量濃度對根皮素轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effects of phlorizin concentration on the yield of phloretin

由圖7可知：在根皮苷的質(zhì)量濃度達到80 mg/L之前，根皮素的轉(zhuǎn)化得率均能達到50%以上，之后便迅速下降，所以底物根皮苷的質(zhì)量濃度需在80 mg/L以下.

2.4.2 轉(zhuǎn)化時間

考察了轉(zhuǎn)化時間對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響，QL-9204菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)制備的粗酶液轉(zhuǎn)化根皮苷，在底物質(zhì)量濃度為80 mg/L時，根皮素的轉(zhuǎn)化得率見圖8.

圖8 轉(zhuǎn)化時間對根皮素轉(zhuǎn)化得率的影響Fig.8 Effects of bioconversion time on the yield of phloretin

由圖8可知：隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，根皮素的得率逐漸提高，轉(zhuǎn)化14 h時，根皮素的得率達到最高，達90.3%；之后在顯著下降，說明QL-9204菌株的粗酶液中存在根皮素的水解酶，轉(zhuǎn)化時間過長則導(dǎo)致根皮素的水解.

考察轉(zhuǎn)化溫度和振蕩轉(zhuǎn)速對根皮素得率的影響，結(jié)果表明最佳轉(zhuǎn)化溫度仍然為30 ℃，振蕩速度對轉(zhuǎn)化得率無顯著影響.重復(fù)批次實驗結(jié)果表明：在底物根皮苷質(zhì)量濃度為80 mg/L，30 ℃，250 r/min條件下轉(zhuǎn)化14 h，根皮素的得率均能在90%以上.

3 結(jié) 論

近些年來，生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在天然產(chǎn)物化學中的應(yīng)用，取得了豐碩的研究成果.將生物轉(zhuǎn)化技術(shù)運用于中藥成分的結(jié)構(gòu)修飾，可以提高一些中藥成分的生物活性或降低毒性和副作用，是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的重要途徑之一.糖苷類化合物是許多中藥的主要有效成分，但糖苷類化合物分子具有極性大、脂溶性差和分子量大的特點，不易透過腸壁粘膜被吸收.去除糖基的苷元產(chǎn)物極性小、脂溶性增加，更容易透過腸壁進入血液循環(huán)，進而發(fā)揮更好的藥效.根皮苷大量存在于一些植物中，但生物活性遠遠不如根皮素，所以采用生物轉(zhuǎn)化法將根皮苷轉(zhuǎn)化為根皮素，是生產(chǎn)根皮素的有效途徑之一.本研究從蘋果皮微生物富集物中篩選到一株紫變青霉菌QL-9204菌株，該菌株能專一性的轉(zhuǎn)化根皮苷生成根皮素，但幾乎不產(chǎn)生水解苷元結(jié)果的酶，經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，在底物根皮苷濃度為80 mg/L，根皮素的轉(zhuǎn)化得率可達90.3%，顯著高于已有的報道的59.01%轉(zhuǎn)化率[17](底物質(zhì)量濃度60 mg/L)，所以本工藝具有方法簡單、轉(zhuǎn)化得高和成本低的優(yōu)勢，進一步研究可以增加底物質(zhì)量濃度，提高產(chǎn)量，便具有一定的工業(yè)化應(yīng)用價值.

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(責任編輯：陳石平)

Bioconversion of phlorizin to phloretin by a selectedPenicilliumpurpurescensstrain QL-9204

MEI Jianfeng, LI Liang, YI Yu, CHEN Jianshu, ZHANG Yanlu, YING Guoqing

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

A bioconversion process was developed for the production of phloretin from phlorizin. First, microbial strains were isolated and screened from the enrichment of apple peel, and then the main composition and initial pH of the medium for producing enzyme, and bioconversion conditions were optimized for improving the bioconversion yield of phloretin. Some desired results were achieved. A strain ofPenicilliumpurpurescensdesignated as QL-9204 was selected from 11 fungus strains, which can specifically produce enzyme for bioconversion of phlorizin to phloretin. The optimum medium for producing enzyme was composed of 2 g/L sucrose, 6 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L NaCl, 5 g/L KH2PO4,1 g/L MgSO4and 1 g/L MnSO4with the initial pH of 6. The strain QL-9204 after seed cultivation was inoculated in the medium and cultured for 5 d. The filtrate of the culture was collected and 80 mg/L of phlorizin was added in. The bioconversion was performed at 30 ℃, 250 r/min for 14 h. The molar of phlorizin could reach 90.3%. The developed process shown in this paper has advantages of simple operations, high productivity and low cost, which may be an effective way for the production of phloretin in the pharmaceuticals industry.

phloretin; phlorizin ; bioconversion;Penicilliumpurpurescens

2016-03-05

梅建鳳(1973—)，男，安徽天長人，副教授，博士，主要從事生物制藥方向的研究，E-mail：mrion@zjut.edu.cn.

Q814.9

A

1006-4303(2016)06-0660-05