基于鰓的microRNA轉(zhuǎn)錄組研究中國(guó)蛤蜊對(duì)重金屬鎘的響應(yīng)

張晶晶 ，李宏俊 ，秦艷杰，劉敏 ，葉晟

(1. 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心 海洋生態(tài)室，遼寧 大連 116023；2. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

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基于鰓的microRNA轉(zhuǎn)錄組研究中國(guó)蛤蜊對(duì)重金屬鎘的響應(yīng)

張晶晶1,2，李宏俊1*，秦艷杰2，劉敏1,2，葉晟1,2

(1. 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心 海洋生態(tài)室，遼寧 大連 116023；2. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

中國(guó)蛤蜊(Mactrachinensis)是一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類，分布于我國(guó)的遼寧和山東。近年來(lái)，生境惡化和過(guò)度捕撈導(dǎo)致我國(guó)蛤蜊資源量減少。我們利用Illumina Hiseq-2500 平臺(tái)對(duì)中國(guó)蛤蜊鰓的microRNA轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用差異表達(dá)尋找對(duì)鎘刺激有響應(yīng)的功能microRNA。結(jié)果顯示對(duì)照組獲得了14 415 256條clean reads，實(shí)驗(yàn)組獲得了15 570 111條clean reads。在這些reads中一共存在14 584 077小RNA，包括1 898 035條unique小RNA，其中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組共有187 859條unique小RNA。兩個(gè)組的小RNA文庫(kù)的片段長(zhǎng)度分布是相似的，大部分小RNA長(zhǎng)度分布在26～27 nt。在對(duì)照組文庫(kù)中最豐富的片段長(zhǎng)度是27 nt，其次是28 nt、26 nt和23 nt。在實(shí)驗(yàn)組文庫(kù)中，數(shù)量最豐富的片段長(zhǎng)度是26 nt，其次是27 nt、28 nt和23 nt。經(jīng)過(guò)對(duì)序列前體以及結(jié)構(gòu)特征的分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)組中一共有50個(gè)microRNA，其中已知的是38個(gè)，新發(fā)現(xiàn)的是12個(gè)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組microRNA含量最豐富的片段長(zhǎng)度是23 nt。通過(guò)差異表達(dá)分析，5個(gè)microRNA基因具有顯著性差異且從對(duì)照組到實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量是上調(diào)的，其余45個(gè)沒(méi)有顯著性的差異。把這50個(gè)序列與中國(guó)蛤蜊轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對(duì)，一共找到了542個(gè)靶基因。5個(gè)具有表達(dá)差異的基因一共比對(duì)到11個(gè)靶基因。把這11個(gè)靶基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，4個(gè)靶基因在COG中得到注釋，1個(gè)靶基因在GO中得到注釋，6個(gè)靶基因在KEGG中得到注釋，11個(gè)靶基因在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，注釋到的基因有泛素蛋白連接酶E3，Wnt信號(hào)通路，G蛋白信號(hào)調(diào)控等。

中國(guó)蛤蜊；鎘；microRNA；差異表達(dá)；功能基因

1 引言

中國(guó)蛤蜊(Mactrachinensis)，又名飛蛤，屬軟體動(dòng)物門(mén)，瓣鰓綱，簾蛤目，蛤蜊科，蛤蜊屬，生活在潮間帶中沙區(qū)的細(xì)砂灘，至水深60 m的淺海區(qū)，在我國(guó)分布于遼寧、山東，在日本、朝鮮也有分布[1]。中國(guó)蛤蜊肉味鮮美，出肉率高，是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類。由于缺乏苗種，中國(guó)蛤蜊的灘涂養(yǎng)殖尚處于自然繁衍、保護(hù)資源的狀態(tài)[2]。近幾年來(lái)，海水的污染以及過(guò)度捕撈使中國(guó)蛤蜊野生資源缺乏，種質(zhì)資源退化。

鎘(Cadmium)是一種具有金屬光澤的非典型過(guò)渡型重金屬，是一種非必須元素。它是一種生物蓄積性強(qiáng)、具有“三致”作用、毒性持久的劇毒元素，攝入過(guò)量的鎘對(duì)生物體的危害極其嚴(yán)重，會(huì)導(dǎo)致腎臟、肺部、肝臟、骨骼、生殖器官的損傷，對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等具有毒性效應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)多種疾病。已有研究證明鎘對(duì)野生生物來(lái)說(shuō)是一個(gè)高毒性的物質(zhì)，并且能使人致畸致癌[3]。工業(yè)發(fā)展帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)的騰飛，但同時(shí)工業(yè)發(fā)展的廢棄物，如未經(jīng)處理的或者處理不達(dá)標(biāo)的包含有重金屬，有機(jī)化合物等的廢水等毀壞了中國(guó)東部海域的水質(zhì)[4-5]。中國(guó)生態(tài)標(biāo)準(zhǔn)(2001—2005)記載黃、渤海鎘污染嚴(yán)重，2013年海洋環(huán)境質(zhì)量公報(bào)報(bào)道遼東灣主要超標(biāo)要素之一是鎘。雙殼貝類習(xí)固著型的濾食生活且自身的用于代謝的混合氧化系統(tǒng)存在缺陷，導(dǎo)致體內(nèi)很容易富集環(huán)境中存在的重金屬離子[6-9]。貝類體內(nèi)富集的鎘含量與環(huán)境中鎘離子的濃度呈正相關(guān)[10-11,13]。張傳永和孫振興[14]等通過(guò)鎘對(duì)中國(guó)蛤蜊的急性試驗(yàn)研究表明鎘對(duì)中國(guó)蛤蜊的24 h、48 h、72 h、96 h的半致死濃度(LC50)分別為12.48 mg/L、7.06 mg/L、5.52 mg/L、4.22 mg/L；Cd2+對(duì)中國(guó)蛤蜊的安全質(zhì)量濃度為0.04 mg/L。Cd2+對(duì)中國(guó)蛤蜊的急性毒性作用較強(qiáng)；在Cd2+的慢性毒性脅迫下，中國(guó)蛤蜊的鰓和消化盲囊的SOD活性受到了抑制。

MicroRNA又稱miRNA，是一類長(zhǎng)度約為19～25 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，屬于小RNA的一種，廣泛存在與真核生物中，主要以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在，具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性[15-16]。MiRNA的生成始于核內(nèi)，通過(guò)Micro-processor復(fù)合體(Drosha和DGCR8)剪切后生成單鏈RNA前體。然后在Exportin5-Ran-GTP蛋白出核轉(zhuǎn)運(yùn)體的輔助下轉(zhuǎn)至胞質(zhì)。在胞質(zhì)中由Dicer酶剪切加工形成長(zhǎng)度在19～25 nt的成熟的miRNA。起初，成熟的miRNA與其互補(bǔ)的序列結(jié)合成雙螺旋結(jié)構(gòu)，隨后雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，其中一條結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RNA-induces Silencing Complex，RISC)上，該復(fù)合物以不完全配對(duì)的方式結(jié)合到靶mRNA的3`非編碼區(qū)(UTR)上，從而導(dǎo)致該基因被誘導(dǎo)或者抑制，甚至沉默。近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA還可以與mRNA的5’UTR和氨基酸編碼區(qū)(Coding Sequences，CDS)結(jié)合[17]。1993年，Lee等[18]在對(duì)秀麗新小桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegan)進(jìn)行突變體的遺傳分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種可時(shí)序調(diào)控胚胎后期發(fā)育且長(zhǎng)度約為22 nt的小分子非編碼RNA——lin-4，但是這個(gè)發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時(shí)并沒(méi)有引起人們的關(guān)注；直至2000年，Reinhart[19]等又在線蟲(chóng)(C.Elegan)中發(fā)現(xiàn)了let-7，miRNA才被科學(xué)界廣泛關(guān)注，let-7成為第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA基因。在過(guò)去的幾十年間，從不同的物種中鑒定出了大量的miRNA。據(jù)尹福強(qiáng)[20]介紹，從2002至2012年，miRNA的數(shù)量由215個(gè)增至25 141個(gè)，僅2011—2012年，測(cè)出miRNA的物種新增加了40個(gè)，說(shuō)明miRNA已經(jīng)受到人們的關(guān)注，成為熱門(mén)研究領(lǐng)域。

miRNA通常在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控其靶基因的表達(dá)，在機(jī)體生命活動(dòng)的各個(gè)過(guò)程，比如細(xì)胞增殖和分化，凋亡疾病的發(fā)生發(fā)展等中，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[15]。盡管軟體動(dòng)物作為海鮮在農(nóng)業(yè)中有著它們重要的價(jià)值，但對(duì)它們的miRNA的研究并沒(méi)有如植物、昆蟲(chóng)和重要?jiǎng)游锛纳x(chóng)的間接宿主研究的多[21]。在軟體動(dòng)物中，長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)[22]、泥蚶(Tegillarcagranosa)[23]和馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)[24]等已經(jīng)得到了miRNA的轉(zhuǎn)錄組并且得出一些與免疫反應(yīng)或者抗性有關(guān)的miRNAs，以及得出miRNA可能啟動(dòng)與之相關(guān)的反應(yīng)，比如吞噬、凋亡、氧化還原反應(yīng)，讓生物更好的適應(yīng)環(huán)境和生存的結(jié)論。本文通過(guò)鎘離子刺激中國(guó)蛤蜊的急性毒性試驗(yàn)以及運(yùn)用Illumina Hiseq2500 SE50測(cè)中國(guó)蛤蜊鰓的miRNA轉(zhuǎn)錄組，期望通過(guò)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的差異性表達(dá)分析，找到響應(yīng)鎘離子刺激的miRNA，并且希望為尋找中國(guó)蛤蜊響應(yīng)鎘離子刺激的抗性機(jī)制提供數(shù)據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2014年6月，于大連長(zhǎng)興市場(chǎng)購(gòu)買成熟的大小一致的中國(guó)蛤蜊，放置到4×100 L的水箱中暫養(yǎng)。7 d之后，對(duì)中國(guó)蛤蜊進(jìn)行Cd2+急性毒性試驗(yàn)，投毒試劑是CdCl2。100只中國(guó)蛤蜊平均分到2個(gè)水箱中，每個(gè)水箱代表一個(gè)處理，分別是空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，其濃度分別是0和2.76(1/2 LC50)mg/L。在養(yǎng)殖期間，每天投喂螺旋藻一次，換水兩次，溫度和鹽度分別控制在(20±1)℃和30。經(jīng)過(guò)48 h處理，分別解剖對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的3只中國(guó)蛤蜊，獲得鰓并組內(nèi)混合，分別命名為S01和S02，浸泡在RNA-EZ Reagents D RNA-Be-Locker A(購(gòu)于上海生工)，4℃過(guò)夜后，放于-80℃儲(chǔ)存，然后送北京百邁克測(cè)miRNA轉(zhuǎn)錄組。

2.2 小RNA文庫(kù)的構(gòu)建，庫(kù)檢和深度測(cè)序

用Trizol試劑提取總的RNA，隨后用瓊脂糖電泳和NanoDrop測(cè)試檢測(cè)RNA的純度，Qubit2.0檢測(cè)RNA的濃度，Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測(cè)RNA的數(shù)量。運(yùn)用NEB Multiple Small RNA Library Pre Set Kit for Illumina 試劑盒構(gòu)建小RNA文庫(kù)，質(zhì)量比較高的總RNA被用作構(gòu)建小RNA的原始材料。根據(jù)小RNA的序列末端的特征，其3’端被連接上與之配對(duì)的適用于Illumina測(cè)序的接頭，然后反轉(zhuǎn)錄得到第一條鏈；之后在序列的5’端加上另一個(gè)合適的接頭，以第一條鏈為模板反轉(zhuǎn)錄，完成了cDNA的合成。接下來(lái)用和接頭互補(bǔ)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；把產(chǎn)物通過(guò)6%的聚丙烯酰胺凝膠，分離目標(biāo)基因，切膠，然后用Plastic回收試劑盒純化回收得到小RNA文庫(kù)。得到小RNA文庫(kù)之后，首先運(yùn)用Qubit 2.0簡(jiǎn)單的計(jì)算小RNA文庫(kù)的濃度，當(dāng)濃度達(dá)到2 ng/μL，說(shuō)明用Agilent 2100檢測(cè)得到的文庫(kù)中的插入序列的大小的結(jié)果是正確的。這時(shí)，為了確保文庫(kù)的質(zhì)量，運(yùn)用ECO實(shí)時(shí)熒光定量PCR精確的計(jì)算文庫(kù)中基因的數(shù)量(有效的文庫(kù)濃度大于2 nmol/L)。如果質(zhì)量達(dá)標(biāo)，就運(yùn)用Illumina Hiseq2500 SE50對(duì)小RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用Illumina Hiseq2500 SE50測(cè)序之后需要對(duì)得到的小片段進(jìn)行加工。首先是過(guò)濾掉低質(zhì)量的片段、接頭序列、片段長(zhǎng)度大于30 bp和小于18 bp的序列，以及序列片段中含有N的序列。這些clean片段與Rfam和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到了ncRNA、rRNA、tRNA、snRNA、scRNA和snoRNA的注釋信息；與現(xiàn)有的中國(guó)蛤蜊基因組文庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得與miRNA有聯(lián)系的基因組序列。運(yùn)用miRDeep 2，依據(jù)miRNA的生物學(xué)的特性并且結(jié)合其環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特征及預(yù)測(cè)，在獲得的基因組序列中鑒定總miRNA及其保守和新的miRNA。運(yùn)用RNAhybrid[25]和miRanda[26]預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。

2.4 MiRNA的差異表達(dá)分析和預(yù)測(cè)的靶基因的注釋

為了得出S01和S02的差異表達(dá)數(shù)據(jù)，DESeq[27]被用于篩選具有差異表達(dá)量的miRNA序列，篩選的條件是同時(shí)滿足假陽(yáng)性率(FDR)小于0.01和fold change≥2，并且用Benjamini Hochber矯正過(guò)的P值校正FDR。Hierarchical cluster analysis被用于估算協(xié)同表達(dá)的趨勢(shì)和樣品之間miRNA的不同表達(dá)量。被預(yù)測(cè)到目的基因與NCBI常用數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到注釋信息。

3 結(jié)果

3.1 小RNA的測(cè)序

運(yùn)用Illumina Hiseq-2500 SE50平臺(tái)，一共得到34 590 000條原始reads，登錄號(hào)SRP075745，經(jīng)過(guò)過(guò)濾得到29 990 000條clean reads，其中S01和S02分別得到14 415 256和15 570 111條clean reads(表1)。把中國(guó)蛤蜊的鰓的S01和S02的clean reads與中國(guó)蛤蜊mRNA轉(zhuǎn)錄組，Rfam和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)之后，分別發(fā)現(xiàn)了1 124 747和623 018條genome，594 070和377 193條rRNA，322和266條snRNA，27和58條snoRNA，5 682和6 408條tRNA，3 457和2 520條重復(fù)序列，其他的分別是S01和S02的獲得的小RNA的88.01%和93.52%(表2)。rRNA在S01和S02文庫(kù)中clean reads的百分比分別是4.12%和2.42%，說(shuō)明這兩個(gè)文庫(kù)的質(zhì)量是可靠的。經(jīng)過(guò)拼接和比對(duì)，這兩個(gè)文庫(kù)一共得到14 584 077條小RNA，S01和S02共同擁有12 584 077條，S01特有1 306 643條，S02擁有772 379條(圖1)。聚類小RNA(Uniq小RNA)一共1 898 035條，S01和S02共同擁有187 859條，S01特有1 039 738條，S02特有670 438條(圖2)。這兩個(gè)文庫(kù)的小RNA的片段長(zhǎng)度大部分分布在26～27 nt(表3)，說(shuō)明這兩個(gè)文庫(kù)的片段的長(zhǎng)度分布是相似的。在S01文庫(kù)中最豐富的片段大小是在27 nt(173 373 條)，其次是28 nt(137 879條)，26 nt(135 169條)和23 nt(109 334條)。在S02文庫(kù)中，數(shù)量最豐富的片段長(zhǎng)度是26 nt(93 571條)，其次是27 nt(135 169條)，28 nt(73 418條)和23 nt(73 099條)。經(jīng)過(guò)與中國(guó)蛤蜊轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)比對(duì)，S01文庫(kù)中產(chǎn)生1 124 747 clean 片段，S02文庫(kù)中產(chǎn)生623 018 clean片段。這兩個(gè)文庫(kù)的疑似miRNA片段長(zhǎng)度分布在18～25 nt之間，S01和S02含量最豐富的片段是23 nt，分別是96 043條和64 491條，其次是22 nt(1 771和1 773條)和21 nt(1 133條和1 279條)。

表1 中國(guó)蛤蜊小RNA數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

圖1 中國(guó)蛤蜊總的小RNA的韋恩分布圖Fig.1 Wayne figure of total small RNA distribution of the Chinese surf clam

圖2 中國(guó)蛤蜊獨(dú)特的小RNA的維恩分布圖Fig.2 Wayne figure of unique small RNA distribution of the Chinese surf clam

類型S01數(shù)量百分比S02數(shù)量百分比genome11247477.80%6230184.00%rRNA5940704.12%3771932.42%scRNA00.00%00.00%snRNA3220.00%2660.00%snoRNA270.00%580.00%tRNA56820.04%64080.04%repbase34570.02%25200.02%other1268695188.01%1456064893.52%Cleanreads14415256100%15570111100.00%

2.2 miRNA及其靶基因的確認(rèn)

一共預(yù)測(cè)出了50個(gè)miRNA，包括38條保守的和12條新的miRNA。其中25條miRNA的長(zhǎng)度是22 nt，14條miRNA的長(zhǎng)度是21 nt，8條miRNA的長(zhǎng)度是23 nt。這些新的miRNA被預(yù)測(cè)了前體結(jié)構(gòu)，并且用miRDeep軟件進(jìn)行估計(jì)前體的分值，圖3是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA預(yù)測(cè)的前體結(jié)構(gòu)。在38條保守的序列中，其中的37條比對(duì)到了478條靶基因，12條新預(yù)測(cè)到的miRNA序列比對(duì)到了129條靶基因(表4)。

表3 疑似miRNA 長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)表

圖3 新發(fā)現(xiàn)的miRNA預(yù)測(cè)的前體結(jié)構(gòu)Fig.3 The predicted precursor structure of one novel miRNA

類型miRNA數(shù)有比對(duì)結(jié)果的miRNA靶基因保守miRNA3837478新預(yù)測(cè)的miRNA1212129總計(jì)5049542

2.3 miRNA的差異表達(dá)

運(yùn)用EcoTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR估計(jì)miRNA的表達(dá)量，在這50個(gè)miRNA中有5個(gè)差異表達(dá)基因，包括3個(gè)保守的miRNA基因(sme-miR-2202-5p，dme-miR-963-3p和 mmu-miR-216c-3p)和2個(gè)新的基因，并且這些基因的表達(dá)量是升高的(表5)。其余的45個(gè)基因中，17個(gè)表達(dá)趨勢(shì)是降低的，28個(gè)表達(dá)趨勢(shì)是升高的，但不符合FDR<0.01且fold change≥2(P<0)條件，即差異顯著性不明顯。圖4是篩選出的5個(gè)差異表達(dá)miRNA表達(dá)量的柱狀圖，從圖中可以看出S01的表達(dá)量高于S02的表達(dá)量。圖5是這兩個(gè)文庫(kù)表達(dá)水平的分析和展示，S02的log10rpkm的值高于S01，這也說(shuō)明這5個(gè)基因在S02的表達(dá)量要高于S01的表達(dá)量。

表5 5個(gè)顯著性差異的miRNA的靶基因的注釋

續(xù)表5

圖4 5個(gè)差異表達(dá)miRNA的柱狀圖Fig. 4 Expression profiles of the 5 differential expression miRNA

圖5 5個(gè)差異表達(dá)的基因在兩個(gè)文庫(kù)miRNA表達(dá)水平的分析與展示Fig.5 The analysis and show of the expression level of the 5 differential expression in two miRNA library

2.4 靶基因的注釋

使用BLAST軟件將預(yù)測(cè)得到的542個(gè)靶基因序列與NR、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得靶基因序列的注釋信息。最終獲得注釋信息的靶基因有91個(gè)。MiRNA靶基因注釋的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表6，在COG中注釋24條，GO中注釋23條，KEGG注釋34條，得到注釋的基因的長(zhǎng)度在1 000 bp之上的有61條，這個(gè)數(shù)值是片段300～1 000 bp被注釋數(shù)量的2倍。其中具有顯著表達(dá)差異的基因的注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表6，在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)到的靶基因數(shù)是4條，GO中1條，KEGG 5條，在nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)到的一共是11條。

表6 所有miRNA靶基因注釋統(tǒng)計(jì)表

表7 注釋的差異miRNA靶基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.4.1 差異表達(dá)miRNA靶基因的GO分類

GO數(shù)據(jù)庫(kù)適用于各個(gè)物種，能對(duì)基因、蛋白質(zhì)進(jìn)行限定和描述。GO分析按照細(xì)胞組分、分子功能、生理過(guò)程對(duì)基因進(jìn)行分類，從而展示出具有差異表達(dá)的與生物學(xué)功能顯著相關(guān)的miRNA靶基因。樣品S01與S02間差異表達(dá)miRNA靶基因GO分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖6。兩種不同的顏色代表所有靶基因以及差異表達(dá)靶基因的GO分類統(tǒng)計(jì)。差異表達(dá)miRNA分子功能中的catalytic activity、binding和生理過(guò)程的代謝過(guò)程，細(xì)胞過(guò)程，刺激響應(yīng)以及信號(hào)的靶基因的富集趨勢(shì)比所有靶基因的高，尤其是刺激響應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增高的趨勢(shì)更顯著，說(shuō)明這些靶基因參與中國(guó)蛤蜊對(duì)鎘離子的刺激響應(yīng)的過(guò)程。

2.4.2 差異表達(dá)miRNA靶基因的COG注釋

COG數(shù)據(jù)庫(kù)是基于細(xì)菌、藻類、真核生物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系構(gòu)建得到的，利用COG數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類。樣品S01與S02間差異表達(dá)miRNA靶基因COG分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖7。其中E、J、K、L、O、R、T對(duì)應(yīng)的功能基因表現(xiàn)出差異表達(dá)，分別代表的是氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)錄本，復(fù)制、重組和修復(fù)，后轉(zhuǎn)錄修復(fù)，蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶，通用功能預(yù)測(cè)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝。

圖6 5個(gè)差異miRNA靶基因GO注釋聚類圖Fig.6 The GO annotation cluster of 5 differential expression

圖7 5個(gè)差異miRNA靶基因COG注釋分類圖Fig.7 COG annotation of the target genes of 5 differential expression

2.4.3 差異miRNA靶基因的KEGG注釋

在生物體內(nèi)，通過(guò)不同基因相互協(xié)調(diào)來(lái)行使生物學(xué)功能。基于Pathway分析有助于進(jìn)一步解讀基因的功能。KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)。把5個(gè)具有顯著差異的miRNA的靶基因與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，最后的數(shù)據(jù)總結(jié)如表8。在KEGG通路中一共比對(duì)到5條通路，分別是Lysosome，Wnt signaling pathway，Ribosome biogenesis in eukaryotes，Ribosome，Ubiquitin mediated proteolysis。

表8 5個(gè)差異性表達(dá)miRNA的靶基因的KEGG注釋

3 討論

MiRNA是一大類小的非編碼的RNA，它們通過(guò)使目標(biāo)基因信使RNA的降解，抑制翻譯的方式阻止基因的表達(dá)。眾所周知，miRNA可以調(diào)節(jié)很多生理和病理的過(guò)程，比如宿主免疫反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)[28-29]。在本研究中，中國(guó)蛤蜊兩個(gè)處理組，經(jīng)Illumina Hiseq2500平臺(tái)測(cè)序，一共得到了34.59 M原始reads。經(jīng)過(guò)去掉低質(zhì)量的序列，接頭和長(zhǎng)度小于18 nt和大于30 nt的序列，獲得了29.99 M高質(zhì)量的序列。去掉rRNA、scRNA、snRNA、snoRNA、tRNA等，得到疑似是miRNA的序列173 583條，其中S01有102 228，S02有71 355條，最后一共預(yù)測(cè)得到了50個(gè)miRNA。最豐富的miRNA序列的長(zhǎng)度是22 nt(25條)，其次是21 nt(14條)，23 nt(8條)，24 nt(2條)和20 nt(1條)。這些結(jié)果和海參(Apostichopusjaponicus)[30]、 長(zhǎng)牡蠣(C.gigas)[22]、泥蚶(T.granosa)[23]和馬氏珠母貝(P.martensii)[24]基本一致。其他的研究認(rèn)為同一大類物種中的最主要的miRNA的長(zhǎng)度是一樣的，比如昆蟲(chóng)Blattellagermanica[31]、Locustamigratoria[32]和Aedesalbopictus[33]的最優(yōu)勢(shì)片段的大小是22 nt，植物Citrustrifoliate[34]、Cucumissativus[35]和Vitisvinifera[36]的最優(yōu)勢(shì)的片段是24 nt。但是在貝類中，馬氏珠母貝(P.martensii)[24]的最優(yōu)勢(shì)的片段長(zhǎng)度是22 nt，泥蚶(T.granosa)[23]的是21nt，長(zhǎng)牡蠣(C.gigas)[22]的是22 nt。

50個(gè)miRNA中38條可以注釋的序列稱為已知的miRNA，12條不能得到注釋稱為新的miRNA。中國(guó)蛤蜊鰓中的miRNA的數(shù)量與目前已得到miRNA的貝類相比較是最少的，長(zhǎng)牡蠣(C.gigas)[22]血細(xì)胞中含有199條miRNA，包括71條已知的和128條新的；馬氏珠母貝(P.martensii)[24]中含有258條miRNA，包括205條已知的和53條新的；泥蚶(T.granosa)[23]血細(xì)胞中含有254條miRNA，包括215條已知的和39條新的，這些差異除了與物種本身所含有的miRNA有關(guān)之外，可能也與小RNA不同的測(cè)序深度有關(guān)。這12條新的基因可能是中國(guó)蛤蜊獨(dú)有的，因?yàn)樵谄渌麍?bào)道中并沒(méi)有與這些基因相同的序列。在所有的miRNA中，cel-miR-34-5p，sme-miR-2202-5p，sma-miR-8478-5p，mmu-miR-216c-3p是對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中排名前5的最豐富的基因，它們的高的表達(dá)量暗示他們?cè)诰S持鰓的生理功能方面起到重要的作用[37]。但是，由NCBI小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)得出miR-2202-5p僅存在于渦蟲(chóng)中，cel-miR-34-5p存在于13種物種中，miR-8478-5p僅存在于曼氏裂體吸蟲(chóng)中，miR-216c-3p僅存在于小鼠中。有趣的是，中國(guó)蛤蜊的miRNA基因有6個(gè)miRNA至少有一個(gè)前體，暗示它們可以從不同的位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化并且有很多的啟動(dòng)子，這就賦予他們?cè)诙鄻訔l件下的轉(zhuǎn)錄水平中有更多的調(diào)控機(jī)制，并且有更多的機(jī)會(huì)參與生理學(xué)功能的調(diào)節(jié)[38]。

MiRNAs調(diào)控已經(jīng)被認(rèn)為在脊椎動(dòng)物的免疫和適應(yīng)階段是一個(gè)重要的調(diào)控原則[39]。為了檢測(cè)miRNA在中國(guó)蛤蜊免疫反應(yīng)中的潛在的作用，經(jīng)過(guò)鎘離子刺激之后，估算了鰓中經(jīng)過(guò)鎘離子極性毒理刺激之后的miRNA的表達(dá)水平。在50個(gè)miRNA中有18個(gè)表達(dá)水平是降低的，32個(gè)是升高的。其中有5個(gè)miRNA具有顯著差異，并且都是上調(diào)的，說(shuō)明這5個(gè)miRNA在中國(guó)蛤蜊抵御鎘離子反應(yīng)的過(guò)程中起到作用，猜測(cè)他們可能在免疫反應(yīng)中起到重要的調(diào)控的作用[40- 41]。

為了描述miRNA和靶基因在鎘離子刺激下的作用網(wǎng)絡(luò)圖以及獲得差異表達(dá)miRNA的更深刻的生物學(xué)意義，我們把與其對(duì)應(yīng)的靶基因與GO、KEGG、COG、nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，分析它們潛在的功能。50個(gè)miRNA在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)到了7條具有顯著性差異的基因功能束。說(shuō)明在鎘離子刺激下，中國(guó)蛤蜊的這些結(jié)構(gòu)和功能基因發(fā)生響應(yīng)。這7條基因功能束分別代表氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)錄本，復(fù)制、重組和修復(fù)，后轉(zhuǎn)錄修飾，蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶，通用功能預(yù)測(cè)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝。1個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了注釋，注釋為分子功能：protein serine/threonine kinase activity(GO:0004674)和ATP binding(GO:0005524)以及生理過(guò)程：protein phosphorylation(GO:0006468)和Wnt signaling pathway(GO:0016055)，這個(gè)基因在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)的是hypothetical protein CAPTEDRAFT_162678基因，可以猜測(cè)這個(gè)基因在GO注釋的這些功能中都起到了作用。Wnt信號(hào)通路是參與胚胎及器官發(fā)育的主要4大類信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，對(duì)胚胎及器官發(fā)育起著不可替代的作用，此外還參與一些疾病，比如腫瘤，心血管疾病和肝纖維化的調(diào)控[42]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，是由催化亞基C、結(jié)構(gòu)亞基A和多種調(diào)控B亞基組成的復(fù)合物。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)是真核生物中最主要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。PP2A在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)程、轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起著很重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)PP2A活性下降導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)重金屬的毒性敏感性增強(qiáng)，并證實(shí)PP2A通過(guò)介導(dǎo)AMP-激活蛋白激酶α(AMPKα)的去磷酸化來(lái)調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?heat shock proteins，HSP)中HSP70和HSP27的表達(dá)并參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。通過(guò)熒光定量發(fā)現(xiàn)，hypothetical protein CAPTEDRAFT_162678表達(dá)量是增加的，說(shuō)明這個(gè)基因在抵御鎘離子的刺激中起到重要的作用。這個(gè)基因所在的這些通路的相互作用形成中國(guó)蛤蜊抵御鎘離子刺激的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

5個(gè)基因注釋到KEGG，包括泛素和溶酶體等。泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin—proteasome pathway)和溶酶體途徑是真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)主要的蛋白酶解降解系統(tǒng)。通常情況下，細(xì)胞內(nèi)膜相關(guān)蛋白和某些在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以及通過(guò)內(nèi)吞過(guò)程從胞外攝取的蛋白質(zhì)等主要經(jīng)溶酶體降解；而泛素—蛋白酶體途徑則高選擇性地降解細(xì)胞在應(yīng)激和非應(yīng)激條件下產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)，對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能具有十分重要的意義。

泛素是一個(gè)由76個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的多肽，因其廣泛分布于各類細(xì)胞中而得名，被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)將被特異性地識(shí)別并被迅速降解．細(xì)胞中蛋白質(zhì)的降解是一個(gè)復(fù)雜的、被嚴(yán)密調(diào)控的過(guò)程，此過(guò)程在涉及細(xì)胞基本進(jìn)程(如DNA修復(fù)，細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞凋亡等)，抗原呈遞，炎癥反應(yīng)等一系列通路中扮演重要角色[43]．泛素連接酶E3是泛素化過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，介導(dǎo)活化的泛素從結(jié)合酶E2轉(zhuǎn)移到底物，不同的泛素連接酶作用于不同的底物蛋白，決定了泛素化修飾的特異性。

在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)到了G蛋白信號(hào)調(diào)控蛋白(RGS)，RGS負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的快速避開(kāi)G protein-coupled受體信號(hào)通路的主要機(jī)制。RGS蛋白通過(guò)GTPase蛋白激活RGS區(qū)域?qū)蛋白進(jìn)行負(fù)調(diào)控。分子伴侶是在生物大分子的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解等過(guò)程中起協(xié)助作用，參與協(xié)助抗原的呈遞和遺傳物質(zhì)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及構(gòu)象的確立，但自身并不發(fā)生任何變化的一大類廣泛存在于生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)分子?？傊@5個(gè)具有顯著差異的基因在中國(guó)蛤蜊抵御鎘離子刺激的作用下都能起到重要的作用。

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Identification and differential expression of gill microRNA in the Chinese surf clam (Mactra chinensis) with Cd2+exposure

Zhang Jingjing1,2, Li Hongjun1, Qin Yanjie2, Liu Min1,2, Ye Sheng1,2

(1.MarineEcologyDepartment,NationalMarineEnvironmentalMonitoringCenter,Dalian116023,China; 2.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China)

The Chinese surf clam (Mactrachinensis) is an economically important clam, distributed in Liaoning Province and Shandong Province. In recently years, because of coastal environmental deterioration and overfishing, the natural population ofM.chinensishave considerably declined. In this paper, we studied the microRNA transcriptome of gills, and control and experimental group were sequenced through Illumina Hiseq 2500 CE. The differential expression andlysis was used to find the functional microRNA response to the Cd2+exposure. Through Illumina Hi-seq 2500 CE, a total of 14 415 256 clean reads and 15 570 111 clean reads were yielded in the gill of control and experimental group respectively. A total of 14 584 077 small RNA, including 187 859 unique small RNA were yielded. The distribution of the small RNA length in the two library was similar, most of them were 26-27 nt. 27 nt was the most abundant length in control group, followded by 28 nt, 26 nt, and 23 nt; 26 nt was the most abundant length in experimental group, and followed by 27 nt, 28 nt and 23 nt. 50 microRNA was found in unique small RNA, including 38 conserved and 12 novel genes. The most abundant length of microRNA in the two library was the same, 23 nt. Through the analyze of differential expression analysis, the expression of 5 microRNA was induced with significantly difference, other 45 microRNA was regulated up or down without significantly difference. 542 target genes were yielded when the 50 microRNA were hit to mRNA genome. And the target genes of differential expression microRNA were annotated by hitting to the NCBI database, and 4 genes hit to the COG, 1 genes hit to the GO, 5 genes hit to the KEGG and 11 genes hit to the nr database. The genes hit to the NCBI database included E3 ubiquitin-protein ligase, Wnt signaling pathway and Regulator of G-protein signaling 22.

Mactrachinensis; cadmium ion; microRNA; differential expression; functional genes

2016-06-30；

2016-09-15。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31572595)；國(guó)家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(201511)。

張晶晶(1989— )，女，河南省周口市人，研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)學(xué)。E-mail：liutian.3090@163.com

*通信作者：李宏俊，博士，副研究員，研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài)學(xué)。E-mail：hjli@nmemc.org.cn

10.3969/j.issn.0253-4193.2016.12.012

S917.4

A

0253-4193(2016)12-0118-14

張晶晶，李宏俊，秦艷杰，等. 基于鰓的microRNA轉(zhuǎn)錄組研究中國(guó)蛤蜊對(duì)重金屬鎘的響應(yīng)[J].海洋學(xué)報(bào)，2016，38(12)：118—131,

Zhang Jingjing, Li Hongjun, Qin Yanjie, et al. Identification and differential expression of gill microRNA in the Chinese surf clam (Mactrachinensis) with Cd2+exposure[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(12)：118—131, doi:10.3969/j.issn.0253-4193.2016.12.012