水產品組織中硝基呋喃類代謝物殘留檢測方法優(yōu)化研究

吳明媛，韋信賢，童桂香，蘭柳春，楊姝麗

(廣西水產科學研究院，廣西 南寧 530021)

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水產品組織中硝基呋喃類代謝物殘留檢測方法優(yōu)化研究

吳明媛，韋信賢，童桂香，蘭柳春，楊姝麗*

(廣西水產科學研究院，廣西 南寧 530021)

優(yōu)化改進液相色譜-串聯(lián)質譜法測定水產品組織中硝基呋喃類代謝物殘留的方法，用0.3 mol/L鹽酸對樣品進行水解，2-硝基苯甲醛進行衍生化，37 ℃避光振蕩16 h后用磷酸氫二鉀與氫氧化鈉混合溶液調節(jié)水解液pH為7.0～8.0，利用乙酸乙酯進行萃取。萃取液氮吹至干，用甲醇溶液定容，用作HPLC-MS/MS測定。結果表明，4種硝基呋喃代謝物在1～500 ng/mL范圍內線性關系良好，加標回收率為92.1 %～103 .0 %，相對標準偏差均小于10.0 %。方法檢測下限為0.1 μg/kg。試驗證明，該方法穩(wěn)定可靠，提高了樣品處理效率，解決了陽性樣品檢測值偏低的問題。

硝基呋喃類代謝物；水產品；液相色譜-串聯(lián)質譜法；優(yōu)化

硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，因價格較低廉且療效佳，被廣泛應用于畜禽和水產養(yǎng)殖。硝基呋喃類藥物具有遺傳毒性可能導致基因變異，其原型藥在動物體內代謝迅速，穩(wěn)定性只有數(shù)小時，但其代謝物能與蛋白質緊密結合，形成穩(wěn)定的殘留物，殘留時間達數(shù)周之久[1-5]。歐盟從1997年起，禁止在動物飼料中添加任何硝基呋喃類藥物。我國也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令[6]。日本在2006年5月29日起實施食品中農業(yè)化學品殘留“肯定列表制度”，對硝基呋喃及其代謝物殘留制定新的檢測限0.5 μg/kg[7]。

硝基呋喃類藥物主要有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林，其對應的代謝物分別為：3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基-嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-2-內酰脲(AHD)和氨基脲(SEM)[8-9]。一般判定動物源性食品中硝基呋喃類藥物的殘留狀況都是通過檢測其中硝基呋喃類代謝產物的含量作為依據(jù)[10]。

硝基呋喃類代謝物殘留檢測手段主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)[11-12]。高效液相色譜-串聯(lián)質譜法因高靈敏度，定性定量準確已成為主要檢測方法。但在按照我國農業(yè)部發(fā)布的液相色譜-串聯(lián)質譜法相關標準[13]進行大批量樣品檢測時發(fā)現(xiàn)存在陽性樣品檢測值偏低的情況。本研究擬通過對樣品前處理進行優(yōu)化，為解決陽性樣品檢測值偏低的問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試儀器：Thermo TSQ Quantum Access MAX液相色譜質譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司)，配電噴霧離子源(ESI)；供試藥劑：呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)、呋喃妥因代謝物(AHD)、呋喃西林代謝物(SEM)(Dr.Ehrenstorfer公司)；AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM.HCl-13C15N2(Witega公司)；鹽酸、2-硝基苯甲醛、二甲基亞砜、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、甲醇。

本研究中使用的組織樣品為實驗室中未檢出4種硝基呋喃類代謝物的鰻鱺、羅非魚和對蝦作為陰性樣品，以及實驗室中檢出有硝基呋喃類代謝物的鰻鱺，對蝦作為陽性樣品進行研究。

1.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18液相色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.9 μm)；流速：200 μl/min；柱溫：30 ℃；樣品盤溫度10 ℃；進樣量：20 μl；流動相：A相為甲醇，B相為5 mM乙酸胺 + 0.1 %甲酸水溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；噴霧電壓：3500 V；毛細管溫度：350 ℃；鞘氣：氮氣，50 bar；輔助氣：氮氣，10 bar；碰撞氣：氬氣，1.5 mTorr；選擇反應監(jiān)測掃描模式(SRM)，參數(shù)見表2。

1.4 試驗方法

稱取2 g均質后的樣品于50 mL離心管中，加入50 μl混合內標工作液，加入5 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液和150 μl 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛，混勻后置于恒溫振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。取出離心管避光冷卻至室溫，加入4 mL pH調節(jié)劑(1 M磷酸氫二鉀∶1 M氫氧化鈉=1∶3)，調節(jié)pH至7.0～7.5，混勻后加入8 mL乙酸乙酯，振蕩5 min，4000 r/min離心5 min。取4 mL上層清液至5 mL玻璃管中，50 ℃下氮吹至干，用5 %甲醇溶液1 mL漩渦混合溶解殘留物后，如油脂過多可4000 r/min離心10 min，下層液體過0.22 μm濾膜，待分析。

表1 流動相梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 水解鹽酸濃度的影響

分別用0.1、0.2、0.3 和0.4 mol/L鹽酸對陽性樣品進行水解，同批樣品添加2.5 μg/kg及10 μg/kg兩個水平的質控樣進行跟標監(jiān)控，在質控樣的加標回收率在90 %～110 %的情況下，由陽性樣品檢測結果(表3)可以看出，陽性樣品在0.1 mol/L鹽酸里的只有部分進行了水解，隨著鹽酸的濃度加大，水解效率不斷增加，當鹽酸濃度達到0.3 mol/L是達到一個峰值，繼續(xù)增加鹽酸的濃度，水解效率有所下降。因此只有當鹽酸濃度達到0.3 mol/L時，陽性樣品中的目標物才能完全水解，否則會導致陽性樣品最終檢測結果偏低。

2.2 衍生化時間的影響

由于4種硝基呋喃類代謝物的分子量為75～201，在此范圍背景干擾大，離子化效率低，碎片不具有特征性，因此采用2-硝基苯甲醛對4種代謝物的自由氨基進行衍生化，形成一個具有較好質譜特性的化合物[14-16]。在酸性條件下，親核基團R-NH2很快游離出來與2-硝基苯甲醛的羰基發(fā)生反應[17]。由表4看出，標準溶液和質控樣品衍生化1 h后就可以得到一個比較固定的數(shù)值，而陽性樣品1 h只能衍生化出一部分目標物，隨著時間的增加檢測結果增大，16 h后達到峰值。因此，樣品必需在37 ℃下反應16 h才可以得到穩(wěn)定且響應值最高的結果，如果時間不夠會造成檢測結果偏低。但對于標準溶液及加標質控樣的衍生，由于不需要經(jīng)過蛋白質水解，在1 h內可以衍生化完畢。

表2 選擇反應監(jiān)測掃描模式(SRM)質譜參數(shù)

注：*為定量離子。

Note：*mean quantitative ion.

表3 水解鹽酸濃度對硝基呋喃類代謝物陽性樣品結果的影響

表4 衍生化時間對硝基呋喃類代謝物結果的影響

2.3 水解衍生化后調節(jié)pH值的影響

5 ppb硝基呋喃代謝物、50 ppb硝基呋喃類代謝物內標物加入陰性組織中按1.4步驟進行水解衍生后，用pH調節(jié)劑調至不同pH值后測定，從結果(圖1)可以看出，水解液pH值在7～8時，響應值RSD在15 %內，靈敏度變化不大，而且內標法定量采用的定量離子與內標物離子響應值比率RSD在5 %內，對定量影響很小。本研究結果表明，用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH容易過高，磷酸氫二鉀調節(jié)pH消耗量過大，用磷酸氫二鉀與氫氧化鈉混合溶液調節(jié)pH消耗量小且pH不易過高。處理大批量樣品時并不需要對每個樣品精確調節(jié)pH，可提高實驗效率。

圖1 pH對4種硝基呋喃代謝物的影響Fig.1 Effects of pH values on response signals of nitrofuran metabolites

2.4 線性關系、檢出限和回收率

分別采用4種硝基呋喃代謝物的同位素標記物作為內標物，減少了水解衍生、調節(jié)pH等步驟對回收率的影響，使定量更加準確。以各特征離子質量色譜峰面積與相應內標物的峰面積比為縱坐標，對照溶液的濃度為橫坐標制作標準曲線，其相應的回歸方程和相關系數(shù)(表5)如下：由回歸方程及相關系數(shù)表明，4種硝基呋喃代謝物在1～100 ng/mL范圍內線性關系良好，4種被測物檢測下限均為0.1 μg/kg。

對水產品組織樣品進行3個添加水平測試(表6)，在不同加標水平處理下，AOZ在3組水產品陰性組織中的回收率為95.2 %～103.0 %，其中加標0.5 μg/kg處理下回收高于其它兩個加標水平處理；AMOZ在3組水產品陰性組織中的回收率為94.3 %～101.0 %；AHD在3組水產品陰性組織中的回收率為94.3 %～100.0 %；SEM在3組水產品陰性組織中回收率為92.1 %～102.0 %，相對標準偏差(RSD)均在10.0 %以下，說明肌肉組織中的4種硝基呋喃代謝物的陰性樣品加標檢測都能得到一個穩(wěn)定可靠的回收率，說明該方法對組織中4種硝基呋喃代謝物能進行穩(wěn)定的檢測。

3 討論與小結

硝基呋喃類代謝物殘留量的測定—(液相色譜—串聯(lián)質譜法)標準[13]是近年來水產品中硝基呋喃代謝物檢測的主要依據(jù)，在按照此標準檢測樣品時發(fā)現(xiàn)，即使同批樣品的質控回收率滿意，陽性樣品仍有可能因為水解不完全而結果偏低很多，這是由于樣品檢測過程中質控措施是在組織樣品中加入一定量硝基呋喃代謝物標準溶液，這樣添加的硝基呋喃代謝物并不會與蛋白質結合，即使鹽酸濃度太低，衍生化時間不長也可以達到滿意的回收率。但是對于內源性的硝基呋喃代謝物，由于已經(jīng)與蛋白質結合，鹽酸濃度較低時可能出現(xiàn)水解不完全，檢測結果偏低的情況。本研究在該方法的基礎上，對高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定水產品組織中硝基呋喃類代謝物的樣品前處理方法各環(huán)節(jié)進行了優(yōu)化比較，試驗證明影響陽性樣品檢測值偏低的主要原因是鹽酸濃度偏低及水解時間不夠。樣品檢測過程中質控措施是在組織樣品中加入一定量標準溶液，這樣添加的硝基呋喃代謝物并不會與蛋白質結合，低濃度的鹽酸和短時間的水解反應也可以達到較為滿意的回收率，而對于陽性樣品，由于硝基呋喃代謝物已經(jīng)與蛋白質結合，酸濃度要達到0.3 mol/L時且樣品在37 ℃下需反應16 h才可以達到完全水解。硝基呋喃代謝物殘留量的測定[13]要求調節(jié)衍生化后的水解液的pH為7.0～7.5，但經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)水解液的pH為7.0～8.0時，對樣品的回收率沒有太大的影響，因此在處理大批量樣品時并不需要精確的調節(jié)每個的pH值，只需要調節(jié)前面幾個樣品后固定給后面的每個樣品加入同樣劑量的磷酸氫二鉀與氫氧化鈉混合溶液即可。經(jīng)改進后該方法穩(wěn)定可靠，可提高樣品處理效率，并有效解決陽性樣品檢測值偏低的問題。

表5 回歸方程和相關系數(shù)

表6 陰性肌肉組織樣品加標回收率及相對標準偏差(n=6)

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(責任編輯 汪羽寧)

Optimization Study on Determination of Residual Metabolites of Nitrofuran in Aquatic Products

WU Ming-yuan, WEI Xin-xian, TONG Gui-xiang, LAN Liu-chun, YANG Shu-li*

(Guangxi Academy of Fishery Sciences，Guangxi Nanning 530021，China)

An improved method for the determination of metabolites of nitrofuran in aquatic products tissues by HPLC-MS/MS was proposed. Samples were hydrolyzed with 0.3 mol/L HCl，and derivatized at 37 ℃ for 16 h with 2-nitrobenzaldenhyde.Hydrolyzed solution was adjusted to pH 7.0-8.0，extracted with ethyl acetate. The analytes were separated and detected by HPLC-MS/MS. The limits of quantification for four nitrofuran metabolites in samples were 0.1 μg/kg. The matrix-matched calibration curve showed good linearity in the range of 1-500 ng/mL. The mean recovery was between 92.1 %-103.0 % and RSD less than 11.1 %.

Metabolites of nitrofuran; Aquatic products; HPLC-MS/MS;Optimization

1001-4829(2016)07-1750-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.044

2016-01-12

廣西水產畜牧獸醫(yī)局科研專項基金(桂漁牧發(fā)[2015]11號)

吳明媛(1980-)，女，廣西南寧人，工程師，主要從事水產品質檢工作，*為通訊作者，E-mail：garnet.y@gmail.com。

O657.63

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