廉 琳 馬東紅 郭明好 郭醉爽 周一龍 許清玉 劉 云

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)453100)

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原發(fā)性膜性腎病患者外周血及腎組織Th17、Treg的變化及其意義①

廉 琳 馬東紅 郭明好②郭醉爽③周一龍 許清玉 劉 云

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)453100)

目的：探討原發(fā)性膜性腎病(PMN)患者外周血及腎組織Th17/Treg的變化及其對治療的指導意義。 方法：選取PMN患者，流式細胞儀測外周血Th17、Treg，健康志愿者作對照。部分患者通過免疫組化觀察腎組織內(nèi)Th17、Treg的表達。隨訪部分患者，給予激素聯(lián)合他克莫司治療，分析治療前后外周血Th17、Treg的變化。結(jié)果：(1)和健康對照組相比，PMN患者外周血Treg%降低，Th17%升高，均有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.01)。(2)激素聯(lián)合他克莫司治療3月、6月后，Treg%逐漸升高，Th17%逐漸降低，兩組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，且和初始相比亦有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。(3)和健康對照組相比，PMN患者CD4+/CD8+、CD19+細胞計數(shù)輕度升高(P<0.05)，治療后下降，但無統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：PMN患者體內(nèi)存在Treg、Th17免疫失衡，監(jiān)測PMN患者外周血Treg、Th17的變化可能有助于指導治療。

原發(fā)性膜性腎?。籘reg；Th17；淋巴細胞；他克莫司

原發(fā)性膜性腎病(Primary membranous nephropathy，PMN)是成人腎病綜合征的常見類型之一[1]。關于PMN的發(fā)病機制，目前在靶抗原、免疫介導、遺傳學等方面都有一定的進展，但仍不完全明確。國內(nèi)外有研究表明Treg、Th17參與PMN的發(fā)病，治療后隨訪情況鮮有報道。PMN患者多采用激素聯(lián)合免疫抑制劑治療，近年來已有不少學者報道應用他克莫司治療PMN[2]。但他克莫司對PMN患者體內(nèi)淋巴細胞亞群的影響如何，尚未見此方面的研究報告。因此，本研究通過觀察PMN患者外周血及腎組織Th17、Treg的表達，及應用激素聯(lián)合他克莫司治療后3個月、6個月時上述指標的變化，探討PMN患者外周血及腎組織Th17、Treg的變化及其對治療的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選取2014年12月至2015年10月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎病科排除繼發(fā)性膜性腎病，腎穿刺活檢術(shù)確診PMN，24 h尿蛋白定量≥4 g的患者40例(男性21例，女性19例)，平均年齡(43.4±16.85)歲，同時選取40例體檢健康成年人為作對照組，其中男20例，女20例，平均年齡(44.7±9.51)歲,PMN患者較健康對照組尿蛋白增加，血漿白蛋白水平下降(見表1)。

選取其中15例依從性好的PMN患者[男8例，女7例，平均年齡(49.47±17.72)歲]作為隨訪對象，醋酸潑尼松片[0.5 mg/(kg·d)]聯(lián)合他克莫司[起始劑量 0.03～0.15 mg/(kg·d)]，根據(jù)血藥濃度和療效調(diào)整劑量，濃度維持在5～10 ng/ml 治療(見表1)。分別于入組時、治療3月、6月收集24 h尿蛋白定量、血白蛋白、肝腎功能、外周血檢測淋巴細胞亞群及Th17、Treg等資料。本研究得到新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 儀器及試劑 美國BD公司的FACSCalibur流式細胞儀，抗人CD4單克隆抗體(APC anti-CD4)、抗人CD25單克隆抗體(APC anti-CD25)、抗人IL-17A單克隆抗體(FITC anti-IL-17A)、抗人CD127單克隆抗體(PE anti-CD127)、抗人CD4單克隆抗體(FITC anti-CD4)購自美國Biolegend公司，IL-17 Polyclonal Antibody、Poxp3 Polyclonal Antibody購自Proteintech中國分公司武漢三鷹公司等。

1.2 方法

1.2.1 Th17檢測 取2 ml外周血，提取單個核細胞后，加RPMI1640并接種于孔板，同時加入離子霉素、BMA、BFA，37℃孵育3 h。離心后棄上清，加RPMI1640、APC anti-CD4，避光孵育20 min，離心，棄上清。再分別經(jīng)Cell Staining Buffer、Fixation Buffer、Permealization Wash Buffer處理后，加FITC anti-IL-17，避光孵育20 min。再加Permealization Wash Buffer離心棄上清后，加PBS緩沖液重懸細胞，待流式細胞儀檢測。

1.2.2 Treg檢測 取100 μl外周血，加FITC anti-CD4、APC anti-CD25、APC anti-CD127各5 μl，避光孵育15～20 min。加1 ml溶血素，離心，棄上清。加1 ml PBS緩沖液洗滌，棄上清，重復洗滌一次。加500 μl PBS緩沖液重懸，待流式細胞儀檢測。

1.2.3 腎臟組織檢測Th17、Treg的表達 選取10例隨訪PMN患者的腎組織標本，同時選取同期因腎腫瘤行腎切除術(shù)的非腫瘤區(qū)腎組織標本10例為對照組。制備石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，乙醇系列水化(100%、95%、80%、60%×5 min)。3%過氧化氫溶液浸泡10 min,濃度為0.5 mg/ml的蛋白酶消化10 min。蒸餾水沖洗后，用PBS洗4次×3 min。加血清，待10 min后，加入兔抗一抗[IL-17/Foxp3(1∶100)Proteintech中國分公司武漢三鷹公司]，4℃過夜。恢復至室溫后，PBS漂洗3次×3 min，加二抗室溫15 min。加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間。分別經(jīng)過Lillie-Mayar蘇木精、1%鹽酸酒精分化液、Scott促藍液浸泡。沖洗后待組織切片烘干后，封片，顯微鏡下觀察。采用Image-pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，進行圖像采集和分析。先在低倍鏡下觀察，每例患者腎組織切片隨機選取5～10個視野，于視野中央在×200鏡下采集圖像，分析每個視野下棕黃色面積占整個視野面積的百分比，計算均值。

2 結(jié)果

2.1 PMN患者外周血Treg、Th17的變化 和健康對照組相比，PMN患者Treg%降低(t=-7.372，P<0.01)，Th17%升高(t=4.906，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義。激素聯(lián)合他克莫司治療后3個月、6個月時，隨著蛋白尿逐漸減少，血漿白蛋白逐漸升高，外周血中Treg%逐漸升高，Th17%逐漸降低，與0月相比及兩組之間相比，差距均有明顯統(tǒng)計學意義(P=0.000<0.01)。見表2、圖1、2。

15例隨訪PMN患者激素聯(lián)合他克莫司治療3個月后，有0例患者完全緩解，有14例患者部分緩解，剩余1例患者(Treg、Th17無明顯變化)治療無效；治療6個月后，有1例患者完全緩解，有14例患者部分緩解。

2.2 PMN患者腎組織IL-17的表達 正常腎組織IL-17著色不明顯。PMN患者腎組織中IL-17著色明顯，腎小球內(nèi)、腎小管上皮細胞胞漿和腎間質(zhì)均有著色。腎小管上皮細胞胞漿著色最明顯。PMN組IL-17染色視野下平均(30.54±4.91)%，較對照組(3.96±0.51)%明顯升高(t=11.017,P<0.01)，兩組間有統(tǒng)計學意義。見圖3。

表1 原發(fā)性膜性腎患者24 h尿蛋白及血漿白蛋白的變化

Tab.1 Changes of 24-hours proteinuria and plasma-albumin in patients with PMN

Healthygroup(n=40)PMNgroup(n=40)0monthgroup(n=15)3monthsgroup(n=15)6monthsgroup(n=15)24hpro(g)009±013683±3261)677±381244±1052)128±0702)ALB(g/L)4635±3552551±6601)2426±7963703±4852)4093±4652)

Note：Compared with healthy group,1)P<0.01；compared with 0 month group,2)P<0.01.

表2 原發(fā)性膜性腎病患者外周血Treg、Th17的變化

Tab.2 Changes of peripheral blood Th17,Treg in patients with PMN

Healthygroup(n=40)PMNgroup(n=40)0monthsgroup(n=14)3monthsgroup(n=15)6monthsgroup(n=15)Th17%073±010132±0751)137±080104±0422)075±0092)3)Treg%376±035275±0801)274±078320±0262)350±0192)3)

Note：Compared with healthy group,1)P<0.01；compared with 0 month group,2)P<0.01；compared with 3 months group,3)P<0.01.

圖1 Th17流式細胞檢測圖Fig.1 Flow cytometry figure of Th17Note: A.Healthy group;B.0 month group;C.3 months group;D.6 months group.

圖2 Treg流式細胞檢測圖Fig.2 Flow cytometry figure of TregNote: A.Healthy group;B.0 month group;C.3 months group;D.6 months group.

圖3 免疫組化檢測腎臟Th17 (IHC×200)Fig.3 Immunohistochemistry figure of Th17 inrenal tissue(IHC×200)Note: A.Negative control group;B.Healthy group;C.PMN group.

圖4 免疫組化檢測腎臟Treg (IHC×200)Fig.4 Immunohistochemistry figure of Treg in renal tissue(IHC×200)Note: A.Negative control group;B.Healthy group;C.PMN group.

2.3 PMN患者腎組織Foxp3+的表達 正常腎組織Foxp3+著色不明顯。PMN患者腎組織中Foxp3+著色明顯，腎小球內(nèi)未見明顯著色，腎小管上皮細胞胞漿、腎間質(zhì)均有著色。腎小管上皮細胞胞漿著色最明顯。PMN組Foxp3+染色視野下平均(68.36±4.81)%較對照組(6.29±0.57)%明顯升高(t=40.505,P<0.01)，兩組間有統(tǒng)計學差異。見圖4。

2.4 PMN患者外周血淋巴細胞亞群的變化 和健康對照組相比，PMN患者外周血CD3+、CD8+細胞計數(shù)輕度降低,CD4+細胞計數(shù)輕度升高,均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。而CD4+/CD8+細胞計數(shù)明顯升高，有統(tǒng)計學差異(t=-3.806，P<0.05)。外周血CD16+CD56+細胞計數(shù)明顯降低,CD19+細胞計數(shù)明顯升高，和對照組相比，均有統(tǒng)計學差異(t=3.206，P<0.05)。激素聯(lián)合他克莫司治療后3個月、6個月，上述異常的指標均有所恢復，和0月相比均無統(tǒng)計學無意義。見表3。

表3 原發(fā)性膜性腎病患者外周血淋巴細胞亞群的變化

Tab.3 Changes of peripheral blood lymphocyte subgroups in patients with PMN

Healthygroup(n=40)PMNgroup(n=40)0monthgroup(n=15)3monthgroup(n=15)6monthgroup(n=15)CD3+/CD45+6985±3796855±1072716±10627280±6277173±373CD3+CD8+/CD45+2718±4682443±9682573±9992753±10452987±795CD3+CD4+/CD45+387±5464090±9084100±11013987±2883993±373CD4+/CD8+115±074178±0731)133±062153±052153±106CD16+CD56+/CD45+605±090428±3921)307±602540±135587±119CD19+/CD45+1493±2361913±7941)158±6581700±6551633±607

Note：Compared healthy group,1)P<0.05.

3 討論

原發(fā)性膜性腎病是成人腎病綜合征的常見類型之一，有逐年增加和年輕化的趨勢。關于PMN的確切發(fā)病機制尚未明確，目前認為免疫異常是主要原因[3]。近年來的研究也證實，免疫復合物激活補體形成膜攻擊物C5b-9引起足細胞損傷方面有重要作用[4]。腎組織免疫復合物的沉積與B淋巴細胞的有關，研究表明CD19可以用來標記B細胞。B淋巴細胞的調(diào)控與CD4+輔助性T細胞(T helper cells，Th,包括Th1和Th2兩個細胞亞群)有關。近年來又發(fā)現(xiàn)了輔助性T細胞17(T helper 17 cells，Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)兩個細胞亞群。Th17與Treg分化過程和功能相互對抗，它們在維持機體免疫平衡方面起重要作用。有研究結(jié)果表明，可以用抗體CD4、CD25、CD127來標記Treg細胞，從而觀察Treg細胞的變化。Foxp3是一種轉(zhuǎn)錄因子，存在于細胞質(zhì)內(nèi)，調(diào)控著CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的功能[5]。Treg細胞主要功能是抑制機體的免疫反應和抑制機體對移植物的排斥作用。有研究表明，Treg細胞對自身免疫性疾病的治療具有廣闊的應用前景[6]。Th17細胞主要分泌IL-17。IL-17與內(nèi)皮細胞、上皮細胞、成骨細胞和造血細胞等表面的IL-17R結(jié)合，產(chǎn)生炎癥趨化因子，聚集粒細胞、單核細胞，參與局部炎癥反應[7]。Th17/Treg免疫失衡在炎癥、感染、腫瘤、自身免疫性疾病等多種疾病狀態(tài)中的報道已有不少，但在PMN中變化少見報道[8-10]。

在2011年頒布的KDIGO臨床實踐指南關于PMN的治療中明確指出“不推薦激素單藥”[11]。近些年，神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(環(huán)孢素、他克莫司等)在PMN的治療中也有較好的療效。由于環(huán)孢素副作用大，治療期間應監(jiān)測血藥濃度及腎功能，保證療效，減少副作用，對于腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化的患者不推薦使用[13]。他克莫司是具有強效、選擇性抑制T淋巴細胞增殖和活化的免疫抑制劑，且副作用較小。

本研究通過檢測外周血Th17、Treg、淋巴細胞(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+、CD19+)的表達，和健康對照組相比，發(fā)現(xiàn)外周血Th17表達增加，Treg表達減少，CD19+標記的B細胞表達增加，CD4+/CD8+比值升高，NK細胞減少，血漿白蛋白減少，尿蛋白增加，表明PMN患者體內(nèi)確實存在淋巴細胞異常表達。通過免疫組化檢測PMN患者腎臟Treg、Th17的表達，較健康對照組表達明顯增多，進一步證實了PMN患者體內(nèi)存在Treg、Th17的免疫紊亂?？紤]外周血的Treg減少可能因為部分浸潤到組織；外周血Th17的表達增加，可能導致腎組織浸潤增多，需進一步證實想法。因臨床收集資料的局限性，如患者依從性差、地域距離遠等因素，選擇15例依從性好、能減少各種原因退組的PMN患者進行隨訪。經(jīng)過他克莫司治療3個月后，1例無效，且患者體內(nèi)Treg、Th17與其0月無明顯變化；治療6個月后，所有患者外周血Treg、Th17接近健康對照組均值，Th17的表達減少，Treg表達增加，其中1例完全緩解，余均為部分緩解。其緩解率與收集隨訪數(shù)較少、隨訪時間較短有一定影響，可繼續(xù)增加樣本數(shù)、延長隨訪時間，進一步研究統(tǒng)計。隨著治療3個月、6個月，盡管PMN患者外周血Treg的表達逐漸增加，Th17表達的減少，尿蛋白減少，但是對于尿蛋白的多少與Treg及Th17表達量的進一步關系，本實驗未進一步驗證、證實相關性，但本研究結(jié)果仍可表明對治療可能是有一定的指導性意義。有研究提示，Th17和Treg，CD4+和CD8+兩組對立細胞的平衡也是患者對治療和預后的相關因素，可能對治療有指導意義[5]。另外，也有研究表明，PMN患者出現(xiàn)明顯B細胞異常及CD4+/CD8+偏移[14]。但由于本實驗研究樣本量較小，隨訪時間不長，外周血淋巴細胞的表達，未提示明顯的意義。本研究結(jié)果PMN患者體內(nèi)Th17、Treg表達異常，證實其參與原發(fā)性膜性腎病的發(fā)病機制。NK細胞是先天性免疫系統(tǒng)中的重要成分，本研究結(jié)果提示PMN患者組的NK細胞(CD16+CD56+標記)較健康對照組輕度降低。針對NK細胞在自身免疫性疾病中作用的研究很多，但以動物為主，且結(jié)果不十分一致[15]。綜上所述，本研究結(jié)果顯示PMN患者外周血存在Treg、Th17、淋巴細胞亞群表達異常，且經(jīng)過他克莫司治療后Treg、Th17有所改善，監(jiān)測PMN患者外周血Treg、Th17的變化可能有助于指導治療。

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[收稿2015-12-18 修回2016-01-13]

(編輯 張曉舟)

Changes of peripheral blood and renal tissues Th17，Treg in patients with primary membranous nephropathy and its significance

LIAN Lin,MA Dong-Hong,GUO Ming-Hao,GUO Zui-Shuang，ZHOU Yi-Long,XU Qing-Yu,LIU Yun.

The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Xinxiang 453100,China

Objective:To explore the changes of Th17,Treg in peripheral blood and renal tissues for the patients with primary membranous nephropathy(PMN) and analyze the significance of etiological therapy.Methods: Cases of PMN were selected.Th17 and Treg in peripheral blood were detected by flow cytometry.And healthy volunteers were selected as the control group.The expression of Th17 and Treg in renal tissues of some selected patients were observed by immuohistochemistry.Some cases from the group of PMN were chosen and given them hormone and FK506 therapy.After therapy,the changes of Th17 and Treg were analyzed.Results: (1)Compared with the healthy control group,the Th17 cell ratio was increased and the Treg cell ratio was decreased,and they all had statistically significant differences(P<0.01).(2)After cured with hormone and FK506 for 3 and 6 months,the ratio of Treg gradually increased and Th17 gradually decreased.They had statistically significant differences(P<0.01),and compared to initial data ,they all had statistically significant differences else (P<0.01).(3)Compared with the healthy control group,the CD4+/CD8 and the CD19+cell levels had a rising trend (P<0.05).After cured,the data was reduced,but compared to initial data,they had no statistically significant differences.Conclusion: There are abnormalities of Th17,Treg for the patients with primary membranous nephropathy(PMN)，and to nonitor Th17,Treg in peripheral blood with PMN is meaningful in etiological therapy.

Primary membranous nephropathy；Treg；Th17；Lymphocyte；FK506

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.022

廉 琳(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事膜性腎病方面的研究。

及指導教師：郭明好(1965年-)，男，碩士，教授，主任醫(yī)師，副院長，碩士生導師，主要從事膜性腎病、原發(fā)性腎小球疾病的基礎與臨床研究，E-mail:guomh@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)11-1667-05

①本文為河南省科技發(fā)展計劃項目(142102310300)。

②新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)453100。

③鄭州大學第二附屬醫(yī)院,鄭州450000。