龍葵E2泛素結(jié)合酶基因SorUBC克隆及表達(dá)特性分析

蔡佳文，金曉霞*，于麗杰，崔柏楊，魏迅，董延龍

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150025；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150069）

龍葵E2泛素結(jié)合酶基因SorUBC克隆及表達(dá)特性分析

蔡佳文1，金曉霞1*，于麗杰1，崔柏楊1，魏迅1，董延龍2

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150025；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150069）

對(duì)龍葵SorUBC基因克隆并分析其在多種非生物脅迫處理下表達(dá)特性，為E2泛素結(jié)合酶在植物逆境脅迫中應(yīng)用提供理論依據(jù)。試驗(yàn)采用電子克隆結(jié)合RT-PCR方法從龍葵中克隆得到泛素E2結(jié)合酶UBC基因編碼區(qū)序列，命名為SorUBC，登陸GenBank，編號(hào)：KU233684。SorUBC基因編碼區(qū)全長(zhǎng)888 bp，編碼295個(gè)氨基酸。進(jìn)化樹分析顯示，該基因編碼氨基酸序列與馬鈴薯、番茄同源性最高，為95%，其次是煙草，為91%。該蛋白在第266～284氨基酸位具有1個(gè)跨膜螺旋區(qū)域，泛素化位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明其含有8個(gè)泛素化位點(diǎn)。利用熒光定量PCR技術(shù)分析SorUBC基因在龍葵各器官表達(dá)特征和不同非生物脅迫處理下（干旱、鹽、堿、高溫和低溫）根部和葉片表達(dá)特性，同時(shí)測(cè)定龍葵葉片生理響應(yīng)。結(jié)果表明，SorUBC基因表達(dá)具有組織差異性，在葉片和果實(shí)中表達(dá)量較高。非生物脅迫處理（干旱、鹽、堿、高溫和低溫）后根部和葉片基因表達(dá)情況顯示該基因存在早期（3或5h）應(yīng)答上調(diào)表達(dá)，且根部與葉片基因表達(dá)量和變化趨勢(shì)差異顯著，根部表達(dá)量變化比葉片顯著，推測(cè)SorUBC基因在龍葵早期響應(yīng)干旱、鹽、堿、高溫和低溫非生物脅迫中起調(diào)控作用。生理特征數(shù)據(jù)表明，在干旱、鹽和高溫脅迫中龍葵葉片MDA含量變化差異不顯著，POD和SOD活性總體呈先降后升趨勢(shì)，說明其在脅迫后期（9 h）對(duì)活性氧造成的損傷起緩解作用。

龍葵；SorUBC；克??；表達(dá)分析；非生物脅迫；生理特性

龍葵（Solanum nigrum L.）為茄科一年生草本植物，在中國(guó)分布廣泛，富含生物堿，全株入藥，且抗性較強(qiáng)，是我國(guó)發(fā)現(xiàn)的Cd超積累植物[1-2]，無論苗期或成熟期，均表現(xiàn)鎘超積累植物具備的積累性和耐性特征[3]，是一種具有重金屬修復(fù)潛力的野生植物資源。龍葵干旱適應(yīng)性強(qiáng)[4]，生長(zhǎng)期極少有蟲害等[5]特性，是研究植物抗逆機(jī)制理想基因庫。

植物對(duì)非生物脅迫環(huán)境作出及時(shí)有效響應(yīng)對(duì)其生存至關(guān)重要。目前已確定多種調(diào)節(jié)干旱、鹽等脅迫相關(guān)基因[6-10]，其中，泛素/26S蛋白酶體途徑是目前已知最重要，有高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑。其通過調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)或降解不正常蛋白，調(diào)節(jié)多種代謝過程。泛素是一種高度保守且有76個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白，分子質(zhì)量約8.5 ku，廣泛存在于幾乎所有真核生物體內(nèi)[11]。泛素化是指泛素在一系列酶作用下對(duì)靶蛋白特異性修飾的過程，其中涉及E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶[12]，底物特異性主要取決于E2泛素結(jié)合酶（UBC）和E3泛素連接酶[13]。研究表明，該途徑廣泛參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14-16]、光形態(tài)建成[17-19]、自交不親和反應(yīng)[20-22]等生長(zhǎng)發(fā)育過程，并與植物對(duì)抗各種外界環(huán)境脅迫反應(yīng)相關(guān)[23-24]。

目前，對(duì)泛素E3連接酶研究較多，而對(duì)E2泛素結(jié)合酶研究相對(duì)較少，Wan等報(bào)道E2泛素結(jié)合酶（UBCs）在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育等多方面發(fā)揮重要作用，而在植物遭受非生物脅迫下響應(yīng)情況還有待進(jìn)一步研究[25]。王安邦等發(fā)現(xiàn)香蕉泛素結(jié)合酶MaUCE2基因表達(dá)受非生物脅迫誘導(dǎo)[26]。Chung等發(fā)現(xiàn)過表達(dá)綠豆泛素結(jié)合酶VrUBC1通過改變ABA相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥滲透脅迫抗性[27]。小白菜BcUBCE2基因在銅脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[28]。大豆泛素E2結(jié)合酶基因GmUBC2在擬南芥中過表達(dá)，可明顯提高擬南芥對(duì)干旱和高鹽抗性[12]；大豆GmUBC13基因在參與植物對(duì)干旱耐受作用時(shí)起正調(diào)控作用[29]；甜瓜CmUBC基因響應(yīng)干旱和鹽脅迫[30]等，而泛素E2結(jié)合酶UBC基因在茄科植物龍葵中作用卻未見報(bào)道。

本研究利用擬南芥泛素E2結(jié)合酶基因UBC32 mRNA全長(zhǎng)序列信息，從番茄基因組數(shù)據(jù)庫中釣取番茄泛素結(jié)合酶E2基因編碼區(qū)序列信息，根據(jù)該序列信息設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR技術(shù)克隆得到龍葵E2泛素結(jié)合酶SorUBC基因，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)龍葵SorUBC基因組織器官表達(dá)特征，同時(shí)結(jié)合生理響應(yīng)分析其在各種非生物脅迫處理（鹽堿、干旱、高溫、低溫）下表達(dá)特性，旨在揭示龍葵E2泛素結(jié)合酶基因SorUBC時(shí)空表達(dá)及其參與非生物脅迫響應(yīng)表達(dá)特征，為進(jìn)一步開發(fā)和利用龍葵SorUBC基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本試驗(yàn)以野生型龍葵為試驗(yàn)材料，草炭土培育，取成株期葉片作SorUBC基因克隆。取5葉期植株經(jīng)鹽、堿、干旱、高溫、低溫處理，具體方法見表1，獲取處理后不同時(shí)間段葉片和根部，立即液氮冷凍，存于-80℃，用于RNA提取。

表1 處理溶液濃度及溫度Table 1Concentration and temperature of treatment solutions

1.2 SorUBC克隆及測(cè)序分析

根據(jù)擬南芥泛素結(jié)合酶E2基因UBC32（XM_ 002882991.1）mRNA全長(zhǎng)序列，從番茄基因組數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）中釣取番茄泛素結(jié)合酶E2基因UBC（Solyc12g099310.1.1）基因信息，根據(jù)該基因信息設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增龍葵SorUBC基因序列，特異引物序列如下：

SorUBC-F：5'ATGGCGGAAGACAAGTATAAT CT 3'；

SorUBC-R：5'TACGATTCATCCATAAAGACA GC 3'。

試驗(yàn)使用TRlzon（康為世紀(jì)）提取龍葵成株總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO）合成第一條cDNA，以該條鏈為模版，SorUBC-F/SorUBC-R為上下游引物作PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳并回收產(chǎn)物與pUC-T載體（康為世紀(jì)）相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，選取白斑克隆，再次對(duì)菌液PCR和雙酶切初步鑒定，測(cè)序分析。

1.3 SorUBC基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)SorUBC氨基酸序列，利用NCBI-blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線分析軟件比對(duì)其與其他植物序列，為進(jìn)一步研究SorUBC蛋白氨基酸序列相似性及進(jìn)化關(guān)系，利用軟件DNAMAN對(duì)序列多重比對(duì)，再用軟件MEGA 4構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用TMPRED分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)；利用UbiPred預(yù)測(cè)基因編碼氨基酸存在的泛素化位點(diǎn)；利用SOPMA預(yù)測(cè)氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)[31-32]。

1.4 SorUBC基因在不同組織器官中的表達(dá)分析

根據(jù)龍葵SorUBC的cDNA序列設(shè)計(jì)UBC片段上下游引物C-Y2（見表2）。取成株期植株不同部位：根、莖、葉、花、果實(shí)，用于基因組織器官表達(dá)分析。提取各組織器官RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以龍葵β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，使用上下游引物C-Y2各0.5 μL，cDNA 1 μL，40個(gè)循環(huán)熒光定量PCR。

表2 引物名稱及序列Table 2Names and sequences of the primers

1.5 SorUBC基因在不同非生物脅迫處理下的表達(dá)分析

對(duì)5葉期龍葵作干旱、鹽、堿、高溫及低溫處理，分別在處理后0、1、3、5、9、12 h取植株根部和葉片，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用上下游引物C-Y2熒光定量PCR表達(dá)分析。

1.6 干旱、鹽、高溫脅迫下龍葵生理指標(biāo)測(cè)定

對(duì)成株期龍葵經(jīng)干旱、鹽及高溫處理（濃度同1.5），分別在0、1、3、5、9 h取植株葉片，測(cè)定部分生理活性物質(zhì)（MDA、POD、SOD）含量。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[33]；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定[34]。以上試驗(yàn)每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍葵SorUBC基因編碼區(qū)全長(zhǎng)克隆及測(cè)序分析

提取龍葵葉片RNA（見圖1），反轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，利用SorUBC-F/R為引物PCR擴(kuò)增，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)期大小條帶（見圖2）。將PCR產(chǎn)物回收，連接pUC-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑取白斑培養(yǎng)，菌液PCR，雙酶切鑒定（見圖3），表明目的基因已連接到克隆載體上，將獲得陽性克隆送往上海生工測(cè)序，獲得編碼區(qū)序列，全長(zhǎng)888 bp，登陸GenBank，編號(hào)為：KU233684。

圖1 龍葵RNA提取Fig.1Extraction of Solanum nigrum L.RNA

2.2 龍葵SorUBC氨基酸同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將克隆得到的cDNA序列作生物信息學(xué)分析，通過NCBI的ORF Finder程序分析，結(jié)果顯示開放讀碼區(qū)為888 bp，編碼295個(gè)氨基酸（見圖4），蛋白分子質(zhì)量為25 ku，理論等電點(diǎn)pI=5.23。

圖2 SorUBC基因全長(zhǎng)cDNA序列電泳結(jié)果Fig.2Agarose gel electrophoresis of the cDNA sequence of SorUBC gene

圖3 pUCT-SorUBC雙酶切鑒定Fig.3Identification of pUCT-SorUBC double digested

根據(jù)已克隆龍葵SorUBC基因氨基酸序列在NCBI上與其他植物同源氨基酸序列比對(duì)分析，結(jié)果表明（見圖5），龍葵SorUBC氨基酸序列與馬鈴薯、番茄一致性為95%，與煙草一致性為91%，與葡萄、芝麻、麻風(fēng)樹、梅、紅景天等植物為80%以上，說明SorUBC基因在這些植物中高度保守。

將上述氨基酸序列比對(duì)，構(gòu)建植物生成進(jìn)化樹，分析龍葵SorUBC蛋白與其他物種相關(guān)蛋白進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明（見圖6），龍葵SorUBC與馬鈴薯、番茄同屬1個(gè)分支；麻風(fēng)樹和梅UBC屬同1個(gè)分支；葡萄、芝麻、紅景天UBC屬同1個(gè)分支，其中芝麻和紅景天進(jìn)化關(guān)系較近。

圖4 SorUBC編碼區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列Fig.4Nucleotide and amino acid sequences of SorUBC coding regions

2.3 龍葵SorUBC蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.3.1 SorUBC蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用TMPRED預(yù)測(cè)SorUBC蛋白跨膜螺旋（見圖7、8），結(jié)果表明該蛋白具有1個(gè)跨膜螺旋區(qū)域，其相應(yīng)氨基酸位置是第266～284位。

2.3.2 SorUBC蛋白泛素化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用UbiPred在線預(yù)測(cè)分析SorUBC中泛素化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)SorUBC有8個(gè)泛素化位點(diǎn)，位置分別為第5、9、14、21、73、91、160、172位氨基酸。說明SorUBC蛋白可能通過相應(yīng)位點(diǎn)泛素化發(fā)揮作用（見表3）。

2.3.3 SorUBC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA預(yù)測(cè)SorUBC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖9。結(jié)果表明SorUBC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，h占25.91%，e占18.60%，t占5.32%，c占50.17%。由此推測(cè)，SorUBC蛋白含有大量α-螺旋和無規(guī)則卷曲。

2.4 龍葵SorUBC基因組織特異性表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)SorUBC基因在龍葵不同組織器官表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在龍葵根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，且差異較大，SorUBC基因在葉片與果實(shí)中表達(dá)量最高，莖中表達(dá)量為5倍，花中表達(dá)量為3倍，根中表達(dá)最弱，是葉片和果實(shí)中的1/10。說明SorUBC基因在龍葵中的表達(dá)具有組織特異性（見圖10）。

2.5 不同非生物脅迫處理下，龍葵SorUBC基因表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)成株期龍葵經(jīng)鹽、堿、干旱、高溫及低溫處理，檢測(cè)不同非生物脅迫處理下SorUBC基因在龍葵根部和葉片表達(dá)特性。結(jié)果表明，不同脅迫處理下SorUBC基因表達(dá)受不同程度影響（見圖11）。低溫處理下，從1 h起，SorUBC基因葉片表達(dá)量逐漸下降，僅12 h有一次上升，但總體含量低于對(duì)照組；而根中表達(dá)量呈先增后降趨勢(shì)，5 h時(shí)達(dá)最大值，是對(duì)照組的6.7倍（見圖11A）。高溫處理下，葉基因表達(dá)量明顯低于對(duì)照組；而根中表達(dá)量在處理5 h后已顯著上調(diào)表達(dá)，處理12 h時(shí)SorUBC表達(dá)量達(dá)最大，為對(duì)照組的30倍（見圖11B）。

圖5 龍葵SorUBC與其他物種UBC氨基酸序列保守區(qū)域多重比對(duì)Fig.5Alignment of conserved domains of SorUBC between Solanum nigrum L.and other plants

圖6 UBC氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6Phylogenetic tree of UBC amino acid sequences

圖7 SorUBC蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)Fig.7Predicted transmembrane domains of SorUBC protein

圖8 TMHMM預(yù)測(cè)SorUBC蛋白跨膜結(jié)構(gòu)Fig.8SorUBC transmembrane regional prediction by TMHMM

表3 SorUBC泛素化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 3Ubiquitinated site analysis on SorUBC

干旱脅迫下，SorUBC基因處理組葉片表達(dá)量一直低于對(duì)照組；而根部表達(dá)量在處理3 h時(shí)達(dá)到最大，為對(duì)照的9倍，隨后顯著下調(diào)后又上升，在12 h上調(diào)為3 h表達(dá)量的1/17（見圖11C）。鹽脅迫下，1 h時(shí)葉片中SorUBC表達(dá)量下降，處理3 h達(dá)到最低后又顯著上調(diào)，9 h葉表達(dá)量達(dá)到最大，是對(duì)照2倍；在根部該基因分別在3和9 h時(shí)達(dá)最大值，為對(duì)照的1.8倍和2倍，而在12 h表達(dá)量最低（見圖11D）。堿處理下，葉片中SorUBC表達(dá)量除9 h與對(duì)照基本持平外，表達(dá)量均下調(diào)；在根部，該基因表達(dá)量除在3 h有一次下調(diào)外，總體呈先升后降趨勢(shì)，9 h達(dá)到最大值，為對(duì)照組的2.5倍（見圖11E）。以上結(jié)果表明SorUBC基因在以上非生物脅迫處理下均存在不同早期應(yīng)答反應(yīng)，分別在3或5 h表達(dá)上調(diào)，且根部與葉片基因表達(dá)量和變化趨勢(shì)差異顯著，根部SorUBC基因表達(dá)變化比葉中更明顯，從基因表達(dá)量變化看SorUBC基因參與龍葵在非生物脅迫中的應(yīng)答反應(yīng)過程。

圖9 SorUBC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9Secondary structure prediction of SorUBC protein

圖10 龍葵SorUBC基因在不同器官中的表達(dá)Fig.10Expression of SorUBC in different organs of Solanum nigrum L.

圖11 非生物脅迫下龍葵SorUBC基因在根部和葉片的表達(dá)Fig.11Expression of SorUBC gene in roots and leaves of Solanum nigrum under abiotic stress

2.6 不同非生物脅迫對(duì)龍葵葉片生理特性影響

圖12A顯示干旱、高溫和鹽脅迫后龍葵MDA變化情況。干旱脅迫中，MDA含量總體呈先降后升再降趨勢(shì)，5 h時(shí)達(dá)到最大值，受損傷程度加劇。高溫脅迫中，MDA含量在1 h時(shí)含量較高，之后略有下降，且變化不顯著。鹽脅迫處理中，MDA含量呈先升后降趨勢(shì)，處理1 h時(shí)，MDA含量略微增加，膜脂過氧化程度增加。

圖12 非生物脅迫下龍葵葉片生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Fig.12Determination results of physiological index of leaves of Solanum nigrum under abiotic stress

過氧化物酶POD和超氧化物歧化酶SOD在植物中廣泛存在，是防御系統(tǒng)保護(hù)酶。圖12B顯示，干旱脅迫中，POD活性呈下降趨勢(shì)，5 h時(shí)葉中表達(dá)量最低，為對(duì)照組的1/5，之后活性增強(qiáng)，9 h時(shí)為5 h時(shí)的5倍，說明脅迫初期植株適應(yīng)性較差，后期POD活性增強(qiáng)，緩解干旱對(duì)植株活性氧的傷害。高溫脅迫中，POD活性呈先降后升趨勢(shì)，9 h達(dá)到最大值，為對(duì)照的1.3倍。POD活性在鹽脅迫處理中變化不明顯。從圖12C可知，龍葵葉片SOD活性總體呈先降后升趨勢(shì)。干旱、高溫脅迫中，SOD活性較對(duì)照組顯著下降，干旱脅迫5 h時(shí)與對(duì)照組相比下降5倍，之后活性略有上升，且均未高于對(duì)照組。鹽脅迫中，3 h時(shí)達(dá)最小值，為對(duì)照的1/2，之后SOD活性顯著上升，9 h時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照組的1.32倍。三種處理中，SOD活性均顯著低于對(duì)照。以上說明非生物脅迫初期，龍葵過氧化物酶POD和超氧化物歧化酶SOD活性不高，植株適應(yīng)調(diào)節(jié)能力較差，對(duì)植株造成一定傷害；脅迫后期（9 h），兩種酶活性增加，對(duì)活性氧造成的損傷起緩解作用。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)多種泛素結(jié)合酶基因在各器官中均有表達(dá)，例如E2泛素結(jié)合酶TaE2基因在小麥根、莖、葉和種子中均有表達(dá)[35]；SUMO E3連接酶SIZ1和E3泛素連接酶AtSAP5，在擬南芥根、莖、葉、花中均有表達(dá)[36-37]。Suzuki等研究也表明，E2泛素結(jié)合酶基因在調(diào)節(jié)植物光形態(tài)建成[38]、胚胎及器官形成[39]、維管束發(fā)育[40]等方面起一定作用。本研究在克隆獲得龍葵E2泛素結(jié)合酶SorUBC基因編碼區(qū)全長(zhǎng)基礎(chǔ)上，通過熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定龍葵不同組織器官SorUBC基因表達(dá)量，結(jié)果表明各組織中均有表達(dá)且差異顯著，SorUBC編碼的蛋白在龍葵各組織中普遍存在，且在葉片和果實(shí)中表達(dá)量顯著高于其他器官。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，受各種自然條件因素影響，當(dāng)這些因素超過一定范圍時(shí)即對(duì)植物構(gòu)成脅迫，以往研究表明泛素蛋白酶體途徑在植物受到非生物脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用[41-43]。而E2泛素結(jié)合酶在泛素化過程中扮演重要角色，提高植物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境能力。如大豆GmUBC2基因在擬南芥中過表達(dá)，明顯提高擬南芥對(duì)干旱和高鹽抗性[12]；甜瓜CmUBC基因響應(yīng)干旱和鹽脅迫[29]。本研究中，葉片在低溫、高溫和干旱處理后SorUBC基因處于下調(diào)狀態(tài)，在鹽、堿處理后呈下調(diào)后上調(diào)又下降趨勢(shì)。而根部在這些脅迫中SorUBC表達(dá)量大致呈兩次上升過程（除低溫、堿脅迫為一次上升過程）。徐東北等研究表明，GmUBC13基因在參與植物對(duì)干旱耐受作用時(shí)起正調(diào)控作用[30]；而本研究中，干旱處理下（見圖11C），根部SorUBC基因表達(dá)量在脅迫初期（3 h）呈一次明顯上升，表達(dá)量總體上與對(duì)照組相比呈上升趨勢(shì)。鹽堿脅迫下（見圖11D、E），基因表達(dá)量與低溫、高溫和干旱相比較低，鹽脅迫下根部SorUBC基因表達(dá)量在3、9 h與對(duì)照組相比處于上調(diào)狀態(tài)，堿脅迫在5、9、12 h處于基因上調(diào)表達(dá)狀態(tài)，說明SorUBC基因不同程度響應(yīng)干旱、鹽堿與高、低溫脅迫處理。Wan等研究表明，花生在受到由干旱、高鹽、低溫、施用外源ABA等引起的生理水脅迫時(shí)AhUBC2表達(dá)量增加[25]；而本研究中，低溫下（見圖11A）龍葵根部SorUBC基因表達(dá)量在5 h脅迫處理下呈最高值；高溫下（見圖11B），SorUBC基因隨處理時(shí)間變化表達(dá)量有所變化，且與對(duì)照組比較明顯呈上調(diào)趨勢(shì)。推測(cè)SorUBC基因可能在以上非生物脅迫中發(fā)揮作用，該基因是否具有以上功能需深入研究。

本試驗(yàn)還選取高溫、干旱和鹽三種非生物脅迫處理龍葵檢測(cè)其生理響應(yīng)。MDA是膜脂過氧化最終分解產(chǎn)物，其細(xì)胞內(nèi)濃度表示脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)傷害程度，是逆境生理中重要指標(biāo)[44]。POD和SOD是植物防御脅迫過程中重要保護(hù)酶。三種脅迫處理中，MDA含量變化差異不顯著，植物在高溫、干旱和鹽脅迫處理中未受明顯傷害。POD和SOD活性總體呈先降后升趨勢(shì)，說明其參與龍葵自身修復(fù)過程，脅迫后期（9 h）對(duì)活性氧造成損傷起緩解作用。

4 結(jié)論

本研究從龍葵中克隆到一個(gè)泛素結(jié)合酶E2基因SorUBC，SorUBC基因在馬鈴薯、番茄、煙草等植物中保守性較高。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明該蛋白具有1個(gè)跨膜螺旋區(qū)域，其相應(yīng)氨基酸位置是第266～284位，且該蛋白存在8個(gè)泛素化位點(diǎn)，可能通過相應(yīng)位點(diǎn)泛素化來發(fā)揮泛素結(jié)合酶E2功能。

泛素結(jié)合酶E2基因SorUBC在龍葵各組織中均有表達(dá)，在葉片和果實(shí)中表達(dá)量顯著高于其他組織。鹽、堿、高溫、低溫及干旱非生物脅迫處理下，龍葵SorUBC基因表達(dá)量均存在早期應(yīng)答上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，分別在3或5 h上調(diào)表達(dá)，且SorUBC基因在根部與葉片表達(dá)量和變化趨勢(shì)差異顯著，根部表達(dá)量明顯高于葉片表達(dá)量。三種脅迫處理（高溫、干旱和鹽）中，MDA含量變化差異不顯著；POD和SOD活性總體呈先降后升趨勢(shì)。

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Clone and expression pattern analysis of E2 ubiquitin-binding enzymegeneSorUBCinSolanum nigrumL./

CAI Jiawen1,JIN Xiaoxia1,YU Lijie1,CUI Baiyang1,WEI Xun1,DONG Yanlong2(1.School of Life Science and Technology,Harbin Normal University,Key Laboratory of Plant Biology,College of Heilongjiang Province,Harbin 150025, China;2.Horticulture Branch,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069, China)

In this researchSorUBCgene fromSolanum nigrumL.was cloned and the expression pattern under different abiotic stresses were detected.This would help us to predict the characteristics of E2 ubiquitin binding enzyme and provide theoretical basis for the application of E2 ubiquitin binding enzyme in plant stress.The research cloned E2 ubiquitin binding enzymeUBCgene full-length coding region sequence by electronic cloning and RT-PCR method fromSolanum nigrumL.,namedSorUBC,GenBank accession number：KU233684.The coding region sequence was 888 bp,encoded 295 amino acids.Phylogenetic tree analysis showed thatSorUBCamino acid sequence was homologous highest with potato and tomato,was 95%,followed by tobacco which was 91%.The protein was predicted to have one transmembrane helical regions in the 266-284 amino acid site,and the ubiquitin-based site prediction showed that it contained eight ubiquitin-based sites.The expression characteristics of SorUBCin various organs and in roots and leaves with abiotic stress treatments(drought,salt,alkali, high temperature and low temperature)ofSolanum nigrumL.were detected using quantitative PCR analysis,meanwhile physiological response of leaves inSolanum nigrumL.were determined.The results showed that the expression ofSorUBCgene were different in tissues,higher in leaves and fruits.Detection of gene expression in roots and leaves after abiotic stress treatments(drought,salt, alkali,high temperature and low temperature)showed that there was an early(3 or 5 h)response up regulation expression ofSorUBCgene,the expression levels and the trends of the gene in roots and leaves had significant difference,the expression in roots were more obvious than in leaves,suggesting thatSorUBCgene might play a regulatory role in early stage response to different abiotic stress such as drought,salt,alkali,high temperature and low temperature stress inSolanum nigrumL. Physiological characteristic data showed that no significant change of the MDA content in leaves of Solanum nigrumin drought,salt and high temperature stress,the activity of POD and SOD increased first and decreased afterward,indicated that they played a certain role in alleviating the damage caused by reactive oxygen species in the later stage of stress(9 h).

Solanum nigrumL.;SorUBC;clone;expression analysis;abiotic stress;physiological characteristics

Q785

A

1005-9369（2016）11-0026-11

時(shí)間2016-12-1 11:35:17[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161201.1135.006.html

蔡佳文,金曉霞,于麗杰,等.龍葵E2泛素結(jié)合酶基因SorUBC克隆及表達(dá)特性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(11)：26-36.

Cai Jiawen,Jin Xiaoxia,Yu Lijie,et al.Clone and expression pattern analysis of E2 ubiquitin-binding enzyme geneSorUBC inSolanum nigrumL.[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(11)：26-36.(in Chinese with English abstract)

2016-09-29

黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目（12531204，12531178）；“植物生物學(xué)”黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（ZK201205）；哈爾濱師范大學(xué)青年學(xué)術(shù)骨干資助計(jì)劃項(xiàng)目（KGB201218）

蔡佳文（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。E-mail:caimylove1991@126.com

*通訊作者：金曉霞，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。E-mail:xiaoxia6195@163.com