兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清在Marc-145細(xì)胞上對(duì)病毒復(fù)制影響

趙孟孟，孫龍，陳耀，張雅，張二芹，馮松林，張桂紅*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清在Marc-145細(xì)胞上對(duì)病毒復(fù)制影響

趙孟孟1,2，孫龍2，陳耀2，張雅1，張二芹1，馮松林2，張桂紅2*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

制備兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗血清，探索其對(duì)病毒復(fù)制影響，通過(guò)大量培養(yǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒XH-GD株病毒，高速離心后蔗糖梯度純化濃縮并免疫新西蘭大白兔，4免后采集抗血清，ELISA法測(cè)定效價(jià)。同時(shí)將抗血清與病毒共同孵育接種Marc-145細(xì)胞，熒光定量PCR和TCID50測(cè)定病毒復(fù)制情況。成功制備兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗血清，效價(jià)達(dá)1∶640，抗血清可以在mRNA水平和TCID50上降低病毒滴度。結(jié)果表明，兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗血清可以在Marc-145細(xì)胞上抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；抗血清；Marc-145細(xì)胞；復(fù)制；滴度

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種接觸性傳染病，主要特征為母豬厭食、發(fā)熱、產(chǎn)弱仔、流產(chǎn)等繁殖障礙和仔豬及各年齡段豬只呼吸道癥狀。PRRSV根據(jù)抗原性差異分為歐洲型和美洲型，我國(guó)主要流行美洲型。豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組主要編碼10個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）[1-3]。從5'端到3'端依次為ORFla、ORFlab和ORF2～ORF7，ORF2～ORF7編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，其中ORF2～ORF5編碼病毒的糖基化蛋白，ORF6編碼膜基質(zhì)蛋白，ORF7編碼核衣殼N蛋白。ORF1a可繼續(xù)水解為Nsp1a，Nsp1b，Nsp2～Nsp6，Nsp7a，Nsp7b，Nsp8，ORFlab水解為Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12[4-6]。

PRRSV自1987年美國(guó)首次報(bào)道后[7]，1996年我國(guó)首次報(bào)道[8]，2006年暴發(fā)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。主要病原是Nsp2缺失30氨基酸的變異株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒[9-11]，2015年我國(guó)出現(xiàn)新NVDC-30毒株[12]。該病毒GP5蛋白、Nsp2不斷變異，非結(jié)構(gòu)蛋白變異較少[13-15]，新的亞型使該病難以診斷和防控；抗體依賴增強(qiáng)（ADE）效應(yīng)[16]，疫苗研發(fā)受阻，缺少高效藥物和疫苗。

目前國(guó)內(nèi)主流檢測(cè)方法主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)方法，主要依賴進(jìn)口，成本較高，國(guó)產(chǎn)試劑穩(wěn)定性較差，批間差異大，其他診斷方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、間接免疫熒光（IFA）、病毒分離、LAMP檢測(cè)方法、免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）方法、血清中和試驗(yàn)、膠體金免疫層析方法、基因芯片技術(shù)等。其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）主要針對(duì)病毒核酸，不能鑒別病毒活性，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性等問(wèn)題，病毒分離方法雖準(zhǔn)確可行，但繁瑣且用時(shí)較長(zhǎng)。LAMP檢測(cè)方法容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，IPMA方法受人為影響因素大，血清中和試驗(yàn)敏感性較差，不適用急性感染。膠體金免疫層析方法在豬繁殖與呼吸綜合征病毒上因?yàn)槊舾行院吞禺愋砸约安荒軝z測(cè)歐洲株病毒等原因尚未大范圍推廣?；蛐酒夹g(shù)對(duì)設(shè)備要求較高。間接免疫熒光方法主要特異針對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，特異性和免疫原性良好，為多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用，是官方檢測(cè)方法之一。針對(duì)N蛋白、Nsp9蛋白、Nsp7蛋白的間接免疫熒光檢測(cè)方法，僅針對(duì)特定蛋白而非全病毒，病毒感染量低則很難檢測(cè)，臨床樣品獲得的豬陽(yáng)性血清可能污染其他病毒，影響檢測(cè)結(jié)果。

為更加準(zhǔn)確、簡(jiǎn)易診斷該病，本試驗(yàn)將高致病性毒株純化后制備成油佐劑抗原免疫新西蘭大白兔，獲得抗血清，一方面避免豬源病毒污染，另一方面覆蓋多個(gè)病毒蛋白表位，減少假陰性概率，鑒定病毒抑制作用，為準(zhǔn)確診斷豬繁殖與呼吸綜合征奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PRRSVXH-GD種毒（GenBank登錄號(hào)EU624117）、豬陽(yáng)性血清、陰性血清、兔陰性血清、Mac-145細(xì)胞由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)動(dòng)物為4只新西蘭大白兔購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶，雙抗購(gòu)自Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，山羊抗豬IgG，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，山羊抗豬IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；脫脂奶粉，TMB，4%多聚甲醛，Trition-X 100,DAB顯色液，考馬斯亮藍(lán)G-250，脫色液以及國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┵?gòu)自北京鼎國(guó)生物有限公司；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，SYBR?Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），dNTP購(gòu)自Takara公司；TRIzol購(gòu)自Life Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒培養(yǎng)

將Marc-145細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中單層培養(yǎng)，生長(zhǎng)至80%并且狀態(tài)較好時(shí)，以1個(gè)病毒感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）劑量接種PPRRV XH-GD毒株，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，PBS清洗3次，之后加入含2%胎牛血清（FBS）維持液，48 h之后反復(fù)3次凍融細(xì)胞，4℃10 000 r·min-1離心30 min，棄沉淀和細(xì)胞碎片，收集上清中病毒液，-80℃保存。

1.2.2 病毒濃縮與純化

取上述病毒培養(yǎng)液4 L，高速離心機(jī)中40 000 r·min-1速度離心5 h，參照文獻(xiàn)[17]制備20%、35%、50%濃度蔗糖溶液各2 mL，注射器注入10 mL離心管中，將超離后重懸液1 mL加入梯度蔗糖上層，4℃、40 000 r·min-1離心4 h，收集各層溶液至新離心管，添加PBS至10 mL，4℃、50 000 r·min-1離心1 h去蔗糖，沉淀用1 mL PBS重懸，純化后病毒用于SDS-PAGE蛋白電泳分析，并分別和等量弗氏完全佐劑與不完全佐劑混合制成免疫用抗原。

1.2.3 SDS-PAGE蛋白電泳分析

配制12%分離膠和5%積層膠，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。將瞬時(shí)離心后樣品用微量移液器加樣，每個(gè)泳道最大上樣量為20 μL。樣品在積層膠為恒壓80 V，待染料進(jìn)入分離膠后電壓加至120 V，直到染料抵達(dá)分離膠底部，斷開(kāi)電源。電泳結(jié)束后，取出凝膠，做好標(biāo)記，考馬斯亮藍(lán)G-250染色液緩慢震蕩染色1 h，棄去染液，將凝膠在清水中漂洗數(shù)次，加入考馬斯亮藍(lán)脫色液。為脫色完全，脫色過(guò)程需更換脫色液數(shù)次，脫色完畢后將凝膠在清水中漂洗數(shù)次，觀察分析結(jié)果。

1.2.4 免疫接種

參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行免疫，每只新西蘭大白兔免疫100 μg，初免后2周二免，二免后2周三免，三免后2周四免，四免后心臟采血，37℃靜置20 min，分離血清。

1.2.5 ELISA效價(jià)測(cè)定

①發(fā)包被：用包被液將上述純化樣品稀釋至10 μg·mL-1作為抗原，于酶標(biāo)板中每孔加入200 μL，蓋好，4℃條件下過(guò)夜。②洗滌：次日，除去孔內(nèi)抗原溶液，每孔加入洗滌液200 μL，震蕩1 min，甩干洗滌液，重復(fù)3～4次。③加入一抗：將血清（對(duì)照血清和免疫血清）用稀釋液作10倍倍比稀釋，然后于每孔內(nèi)分別依次加入不同稀釋倍數(shù)抗體稀釋液200 μL，蓋好，平板置37℃溫箱保溫2～3 h。④洗滌：反應(yīng)完畢，洗滌液洗孔4次。甩干洗滌液。⑤加入酶標(biāo)二抗：用稀釋液將酶標(biāo)二抗1∶20 000倍稀釋，置37℃溫箱保溫1 h。反應(yīng)完畢如前所述，洗滌液洗板4次。⑥顯色：根據(jù)TMB底物顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)配制TMB顯色工作液。每孔加入100 μL底物顯色工作液，室溫避光孵育30 min，反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色。每孔加50 μL終止液，此時(shí)藍(lán)色產(chǎn)物變?yōu)榱咙S色。⑦讀數(shù)：將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，450 nm波長(zhǎng)下讀取數(shù)據(jù)。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）測(cè)定抗血清特異性

將PRRSV病毒XH-GD毒株以1個(gè)病毒感染復(fù)數(shù)（MO）劑量感染長(zhǎng)至約80%的Marc-145細(xì)胞，24 h后，4%多聚甲醛固定20 min，0.25%Triton-x100通透細(xì)胞20 min，5%脫脂奶粉封閉1h之后將抗血清1: 100稀釋后作為一抗，二抗為1∶100稀釋異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃反應(yīng)1 h，通過(guò)IFA試驗(yàn)驗(yàn)證抗血清特異性，同時(shí)設(shè)置豬血清陽(yáng)性對(duì)照和各陰性血清對(duì)照，方法同上，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）試驗(yàn)測(cè)定抗血清特異性

將PRRSV病毒XH-GD毒株以1個(gè)病毒感染復(fù)數(shù)劑量感染長(zhǎng)至約80%的Marc-145細(xì)胞，24 h之后，4%多聚甲醛固定20 min，0.25%Trition-x100通透細(xì)胞20 min，然后5%脫脂奶粉封閉1 h，將抗血清1∶150倍稀釋后作為一抗，二抗為1∶200稀釋辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃反應(yīng)1 h，通過(guò)IPMA驗(yàn)證抗血清的特異性，同時(shí)設(shè)置豬血清陽(yáng)性對(duì)照和各種陰性血清對(duì)照，方法同上，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8 抗血清與病毒孵育

將抗血清與PRRSV XH-GD株以同等劑量混合，37℃反應(yīng)1 h，之后以1個(gè)MOI的劑量混合孵育接種長(zhǎng)滿單層的Marc-145細(xì)胞，吸附2 h后棄上清，PBS清洗3次，加入2%維持液。

1.2.9 熒光定量PCR測(cè)定病毒N蛋白mRNA表達(dá)水平

接毒36 h后，細(xì)胞單層加入750 μL TRizol試劑，置于DEPC水處理1.5 mL滅菌離心管中，按照Invitrogen公司Trizol?Reagent RNA提取試劑的使用說(shuō)明書(shū)操作，提取病毒總RNA。反轉(zhuǎn)錄參照寶生物工程（大連）有限公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄：RNA 9.5 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，5× MLV Buffer 4.0 μL，dNTPs 4.0 μL，M-MLV 1.0 μL，反轉(zhuǎn)錄引物1.0 μL。混勻后，置42℃水浴1 h，冰浴2 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）直接進(jìn)行qPCR反應(yīng)或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以反轉(zhuǎn)錄樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR體系20 μL：SYBR?Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。另外PRRSV N蛋白熒光定量引物為qN-F：5' AAACCAGTCCAGAGGCAAGG 3'，qN-R：5'GCAAA CTAAACTCCACAGTGTAA 3'，甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH熒光定量引物為qGAPDH-F：5'CTGCCG CCTGGAGAAACCT 3'，qGAPDH-R：5'GCTGTAG CCAAATTCATTGTCG 3'，上述引物均由上海立菲生物科技有限公司合成。

1.2.10 病毒滴度TCID50測(cè)定

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種Marc-145細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%以上用樣品接種。每個(gè)樣品做10倍梯度的倍比稀釋（即10-1～10-8倍比稀釋，每個(gè)稀釋度接種8孔，100 μL·孔-1）。接毒后，將細(xì)胞板放置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。孵育完畢后棄去病毒液，補(bǔ)入含2%新生牛血清的DMEM，放置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)觀察2～7 d，記錄每個(gè)稀釋度發(fā)生細(xì)胞病變孔數(shù)，重復(fù)3次求平均值，按照Reed-Muench法計(jì)算各樣品TCID50。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

熒光定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法計(jì)算,熒光定量和TCID50數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5軟件分析，*代表P＜0.05，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞病變與離心結(jié)果

PRRSV接種到長(zhǎng)滿單層的Marc-145細(xì)胞，36 h后Marc-145細(xì)胞出現(xiàn)病變，與對(duì)照組相比，主要表現(xiàn)為細(xì)胞聚集，破裂，分布不均勻，結(jié)果見(jiàn)圖1。病毒濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)與病毒結(jié)構(gòu)蛋白大小相似的條帶，表明病毒純化結(jié)果較好，與預(yù)期一致，其中病毒結(jié)構(gòu)蛋白主要集中在15～30 ku。

圖1 Marc-145細(xì)胞病變圖Fig.1CPE of Marc-145 cells

2.2 抗血清效價(jià)與間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果

間接ELISA測(cè)定結(jié)果表明抗血清效價(jià)為1∶640，間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明以豬陽(yáng)性血清對(duì)照為一抗的細(xì)胞出現(xiàn)可見(jiàn)綠色熒光，以豬陰性血清為一抗的對(duì)照無(wú)可見(jiàn)熒光，以兔高免血清為一抗的細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，主要圍繞在細(xì)胞核附近，以兔陰性血清為一抗的細(xì)胞樣品無(wú)綠色熒光。結(jié)果表明陰陽(yáng)對(duì)照組成立，制備的抗血清可以和病毒感染的Marc-145反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 IPMA試驗(yàn)結(jié)果

IPMA試驗(yàn)結(jié)果表明以豬陽(yáng)性血清對(duì)照為一抗細(xì)胞出現(xiàn)可見(jiàn)棕色陽(yáng)性細(xì)胞，以豬陰性血清為一抗對(duì)照無(wú)可見(jiàn)棕色陽(yáng)性細(xì)胞，以兔陽(yáng)性血清為一抗細(xì)胞樣品出現(xiàn)棕色陽(yáng)性細(xì)胞，以兔陰性血清為一抗細(xì)胞樣品無(wú)棕色陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果表明陰陽(yáng)對(duì)照組成立，結(jié)果可靠，制備的抗血清可和病毒感染的Marc-145反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4 TCID50變化

高免血清和病毒孵育結(jié)束后接毒Marc-145細(xì)胞，36 h后收集細(xì)胞上清作TCID50試驗(yàn)，與陰性血清孵育的對(duì)照組相比，孵育高免血清Marc-145細(xì)胞上病毒滴度低于孵育陰性血清細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.5 PRRSV N蛋白mRNA表達(dá)水平變化

高免血清和病毒孵育結(jié)束后接毒Marc-145細(xì)胞，36 h后收集單層細(xì)胞作熒光定量試驗(yàn)，與陰性血清孵育的對(duì)照組相比，孵育高免血清的Marc-145細(xì)胞上的病毒N蛋白mRNA水平低于孵育兔陰性血清細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，M結(jié)果見(jiàn)圖16。

圖2 純化病毒粒子的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.2Results of SDS-PAGE of purified virus virions

圖3 抗血清間接免疫熒光圖結(jié)果Fig.3IFA result of hyper-immune serum

圖4 抗血清IPMA結(jié)果Fig.4IPMA result of hyper-immune serum

圖5 病毒滴度差異Fig.5Variance of viral titer

圖6 N蛋白mRNA水平變化Fig.6mRNA level of N gene

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖后，經(jīng)乳化制成油佐劑抗原多次免疫兔子，獲得兔抗PPRSV效價(jià)達(dá)1∶640抗血清，該抗血清可識(shí)別感染細(xì)胞天然病毒，與病毒孵育后可抑制病毒在細(xì)胞中復(fù)制，為建立準(zhǔn)確、快速、敏感的PRRSV檢測(cè)方法并確定檢測(cè)試劑奠定基礎(chǔ)。

將全病毒免疫兔子后產(chǎn)生針對(duì)PRRSV抗體，病毒內(nèi)部部分蛋白在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體抑制病毒，中和抗體抑制PRRSV活性，抑制病毒在Marc-145中復(fù)制。該蛋白可能是GP5蛋白，也可能是其他中和蛋白或多種蛋白混合物，也可能是抗血清封閉受體結(jié)合位點(diǎn)，阻礙病毒入侵[19]。

IFA和IPMA兩種方法的靈敏度存在差異，IFA靈敏度高于IPMA，可能與各方法顯色差異相關(guān)，比較后可知IFA發(fā)熱靈敏度略高于IPMA方法。

特異性抗血清制備方法上，一般抗原制備純度決定特異性優(yōu)劣，如果純化不完全，會(huì)降低抗血清特異性，制備單克隆抗體同理[20]。無(wú)高純度抗原，不利于制備高純度免疫產(chǎn)物。

在大量制備病毒過(guò)程中，病毒滴度影響病毒完整性或免疫原性，因此應(yīng)保持較好細(xì)胞狀態(tài)以利病毒復(fù)制，另外收毒時(shí)間最好控制在一半細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，一般為36或48 h，此時(shí)滴度處于較高水平，細(xì)胞較少脫落，比較適宜收毒。

在測(cè)定抗血清對(duì)病毒復(fù)制影響方面，本試驗(yàn)采用TCID50結(jié)合熒光定量方法測(cè)定PRRSV N蛋白mRNA水平，結(jié)果表明均明顯抑制，由于熒光定量方法敏感，操作要求較高，因此在操作過(guò)程中應(yīng)多次重復(fù)試驗(yàn)。如果病毒滴度差異較大，通過(guò)TCID50可比較差異。如果差異較小，因操作問(wèn)題無(wú)法獲得明顯差異，需通過(guò)噬斑試驗(yàn)準(zhǔn)確測(cè)定病毒粒子數(shù)目得出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本試驗(yàn)得到的抗血清可在體外抑制PRRSV復(fù)制，在疾病發(fā)生過(guò)程中緊急接種抗血清可控制疾病蔓延。如果證明有效，分離有效成分，可在一定程度上抑制PRRSV傳播。設(shè)計(jì)針對(duì)病毒蛋白的藥物和制劑將成為未來(lái)控制PRRSV的新方向[21-24]。

本試驗(yàn)成功制備兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抗血清，可識(shí)別感染細(xì)胞的天然病毒，也可中和病毒，為建立診斷方法奠定基礎(chǔ)。

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Effect of antiserum of PRRSV on the replication of PRRSV in Marc-145 cells/

ZHAO Mengmeng1,2,SUN Long2,CHEN Yao2,ZHANG Ya1,ZHANG Erqin1,FENG Songlin2,ZHANGGuihong2(1.Schoolof AnimalScienceandVeterinaryMedicin,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province,National Engineering Research Center for Breeing Swine Industry,School of Veterinary,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

In order to verify whether hyper-immune serum of PRRSV has an influence on the replication of PRRSV,hyper-immune serum was prepared,PRRSV XH-GD strain were cultured,then centrifuged with high speed,the purified viruses were used to immunize the New Zealand rabbits to raise antibody.New Zealand rabbits were immunized intraperitoneally(i.p.)plus Freund's complete adjuvant.Antiserum was collected from the rabbits that had been placed under terminal halothane anesthesia.Antiserum titer was 1：640,the antiserum was incubated with virus,then qPCR and TCID50 used to evulate the titer of virus.The results showed that antiserum could inhibit the replication of PRRSV at the mRNA lever,so hyper-immune serum of PRRSV was able to inhibit the replication ofPRRSV in Marc-145 cells.

PRRSV;hyper-immune serum;Marc-145 cells;replication;titer

S852.6

A

1005-9369（2016）11-0052-07

時(shí)間2016-12-1 14:48:30[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161201.1448.020.html

趙孟孟,孫龍,陳耀,等.兔抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清在Marc-145細(xì)胞上對(duì)病毒復(fù)制的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016, 47(11)：52-58.

Zhao Mengmeng,Sun Long,Chen Yao,et al.Effect of antiserum of PRRSV on the replication of PRRSV in Marc-145 cells [J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(11)：52-58.(in Chinese with English abstract)

2016-09-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272564）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201203039）；國(guó)家生豬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2016YFD0500707）

趙孟孟（1986-），男，博士，研究方向?yàn)樨i繁殖與呼吸綜合征病毒的致病機(jī)理。E-mail:zhaomengmeng502@163.com

*通訊作者：張桂紅，教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病，E-mail:guihongzh@scau.edu.cn