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      外泌體的分離鑒定

      2016-12-28 23:24:56李孟嬌
      中國科技博覽 2016年24期
      關(guān)鍵詞:分離鑒定外泌體

      李孟嬌

      [摘 ?要]外泌體,細(xì)胞間物質(zhì)信息的傳遞者,在細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)領(lǐng)域中,扮演著越來越重要的角色。然而目前對于外泌體的分離鑒定還存在一定的困難,因此本文對外泌體的分離鑒定方法進(jìn)行綜述,為外泌體的進(jìn)一步研究提供更有效的方法。

      [關(guān)鍵詞]外泌體;分離;鑒定;差速離心法

      中圖分類號:TU755 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1009-914X(2016)24-0193-01

      近年來,越來越多的證據(jù)表明外泌體對于細(xì)胞生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)研究方面具有重要的價值,而由于外泌體的體積結(jié)構(gòu)方面的因素,其分離純化還存在很大的困難,目前比較常用的分離方法有差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。

      1.差速離心法

      陳紹倩[1]等人以白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞為材料,采用多步離心的方法成功地提取到了的外泌體。此種實驗方法操作不是很復(fù)雜,實驗設(shè)備要求相對簡單,擁有超速離心機(jī)和細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備即可,是一種比較簡便的提取外泌體的方法,基本可以滿足實驗研究的要求。但分離純度不是很高,并且經(jīng)過多次離心對外泌體的理化性質(zhì)造成一定的影響。

      2.密度梯度離心法

      像所有的脂質(zhì)小囊泡一樣, 外泌體懸浮于特定密度梯度的蔗糖中,其密度范圍從 1.13g/ml到1.210g/ml,將細(xì)胞混懸液或勻漿置于蔗糖介質(zhì)的頂部,通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離,從而將外泌體從混雜的物質(zhì)如蛋白聚集物或細(xì)胞凋亡的核小體碎片等中分離出來[2]。崔焱[3]等人根據(jù)其這一特性,從大量培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞上清中分離純化外泌體,并對此進(jìn)行了電鏡鑒定;在得到大量較高純度的外泌體的基礎(chǔ)上,將其加入含有白細(xì)胞介素-2(1L-2)的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中,觀察其對淋巴細(xì)胞增殖的影響。

      3.超濾離心法

      王偉[4]等人以樹突狀細(xì)胞為實驗材料,基于對外泌體物理特性,大小以及密度的了解,將超濾離心分離外泌體的方法與傳統(tǒng)的分級離心法進(jìn)行了比較,通過實驗證明超濾離心法耗時少,產(chǎn)量和純度都得到了很大程度的提高,是一種比較高效的制備外泌體的方法。

      4.免疫磁珠法

      將具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗體,細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性抗體結(jié)合,在外加磁場中,通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中,無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與磁珠結(jié)合而不能在磁場中停留,從而使細(xì)胞得以分離。Richard Wubbolts[5]等人在對外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和生化分析的過程中,將外泌體的標(biāo)志性蛋白—抗MHCII抗體包被于磁珠表面,通過抗原抗體特異性識別的特性有效的將外泌體分離出來。

      無論采用哪種方法進(jìn)行分離,如果想對其進(jìn)行系統(tǒng)的研究都必須首先確定分離得到的產(chǎn)物是不是外泌體,其次要鑒定外泌體是否達(dá)到實驗所要求的純度和數(shù)量。因此,外泌體的鑒定是必不可少的。目前,常用的鑒定方法主要有電子顯微鏡觀察、動態(tài)光散射技術(shù)、Western blot、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)等。

      其中電子顯微鏡觀察法是從形態(tài)和大小上對外泌體進(jìn)行鑒定,但由于電鏡拍攝視野有限,因此這種方法只能對個別外泌體進(jìn)行觀察。而動態(tài)光散射技術(shù)則是從整體上對外泌體大小的分布情況進(jìn)行檢測,具有準(zhǔn)確、快速、可重復(fù)性好等優(yōu)點,但對于多分散的復(fù)雜外泌體樣本的測量還存在一定的問題。Western blot則是通過抗原抗體特異性結(jié)合的原理,對外泌體中的標(biāo)志蛋白進(jìn)行檢測,從蛋白質(zhì)組學(xué)方面對外泌體進(jìn)行鑒定。

      隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,納米顆粒跟蹤分析技術(shù)逐漸成為外泌體鑒定的新技術(shù),不但可以實時對外泌體進(jìn)行觀測,同時還可以對每個顆粒的布朗運動進(jìn)行追蹤和分析,從而計算出外泌體半徑和濃度。

      外泌體作為細(xì)胞間物質(zhì)信息的傳遞者,在細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)領(lǐng)域中,扮演著越來越重要的角色。因此,提高外泌體的分離純度,改進(jìn)外泌體的分離方法尤為重要。目前,雖然外泌體的分離與鑒定已經(jīng)擁有系統(tǒng)的理論基礎(chǔ),但實際操作起來依然存在很多困難,無論是哪種方法,都有各自的優(yōu)點和缺點,因此只有將各個方法有效的結(jié)合起來,例如差速離心法與免疫磁珠法、電鏡法與Western blot結(jié)合使用,才能達(dá)到更好的分離鑒定效果。

      參考文獻(xiàn):

      [1] 陳紹倩,杜英,王 鑫,顧巧麗,黃玉敏,董子明.多步離心法提取K526細(xì)胞外泌體.鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版) ,2006,41(3).

      [2] Thery C,Zitvogel L,Amigorena S.Exosomes:composition,biogenesis and function.Nat Rev Immunol,2002,2:569-579.

      [3] 崔焱,于津浦,李慧,楊莉莉,魏楓,安秀梅,任秀寶.腫瘤細(xì)胞來源胞外體的分離鑒定與功能檢測.天津醫(yī)藥,2009,37(12).

      [4] 王偉,連建奇,王平忠,潘蕾,姬新穎,白雪帆,賈戰(zhàn)生.樹突狀細(xì)胞胞外體(Exosome)的超濾離心法提取及形態(tài)觀察.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2007,23(12).

      [5] Wubbolts R1,Leckie RS,Veenhuizen PT,Schwarzmann G,M?bius W,Hoernschemeyer J,et al.Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their function and multivesicular body formation.J Biol Chem,2003,278(13):10963-72.

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