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      植物基因組DNA提取

      2016-12-28 17:53:32安碩王思琦
      中國科技博覽 2016年24期
      關鍵詞:提取基因組

      安碩++王思琦

      [摘 ?要]DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,因此DNA的提取液是分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作之一?;蚪MDNA提取應保證核酸一級結構的完整性并且排除其他分子的污染,使下游實驗順利進行。不同植物的組成成分不同,同一植物個體的不同發(fā)育時期其組織細胞中的組成成分也不同,需要根據(jù)具體情況選擇適宜的提取方法。

      [關鍵詞]基因組,DNA,提取

      中圖分類號:TD327.3 文獻標識碼:A 文章編號:1009-914X(2016)24-0261-01

      基因組(Genome)是一個細胞或者生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列,包括全套基因和間隔序列??墒腔蚪M測序的結果發(fā)現(xiàn)基因編碼序列只占整個基因組序列的很小一部分。因此,基因組應該指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子。說的更確切些,核基因組是單倍體細胞核內的全部 DNA分子。線粒體基因組則是一個線粒體所包含的全部DNA分子。葉綠體基因組則是一個葉綠體所包含的全部DNA分子。

      基因組DNA提取應保證核酸一級結構的完整性,因為遺傳信息全部貯存在核酸的一級結構中,故完整的一級結構是保證核算結構與功能研究的基礎;應排除其他分子如蛋白、多糖、脂類、有機溶劑等的污染,使下游實驗順利進行。植物多樣性豐富,不同植物中的水分、多糖和酚類物質含量差別較大,尤其是植物組織中的多糖和酚類物質對隨后的酶切、PCR反應等實驗有較大的影響,提取時應注意去除。因為植物組織細胞內外的組成成分復雜多樣,所以使得植物基因組DNA的提取相對于動物等其他生物材料來說更為繁瑣、困難。不同植物的組成成分不同,同一植物個體的不同發(fā)育時期的組織細胞中的組成成分也不同,需要根據(jù)具體情況選擇適宜的提取方法。常用的制備植物基因組的方法有很多,常用到的方法有CTAB法等;對于植物基因組DNA的分離純化可以選擇已經(jīng)商品化的試劑盒(本實驗采用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒)。

      目前,以人類基因組課題為契機,發(fā)達國家及部分發(fā)展中國家均在不遺余力地推進基因組科學的發(fā)展。對某些原生動物和真菌等小型基因組的分析已經(jīng)取得重大突破,整個研究領域正迎來后基因組科學(post-genome?science)時代。然而,植物基因組分析特別

      是木本植物基因組分析起步較晚,現(xiàn)階段主要還是圍繞擬南芥(Arabidopsis?thaliana)、水稻(Oryza?sativa)和玉米(Zea?mays)等草本模式植物展開。

      1 實驗材料

      植物種類繁多,一般情況下選用健康的嫩葉(或幼芽)為宜。健康的嫩葉(或幼芽)不僅含有較少的代謝產物,而且細胞數(shù)量更多。通常情況下,在采集健康的嫩葉(或幼芽)之前將植物置于暗處一日為宜,這樣可以有效地減少代謝產物的產生。如果所采集的植物材料不能立刻用于基因組DNA提取實驗,可以將樣品保存于4℃冰箱中24h,超過24h時應置于-80℃中保存。注意樣品應避免反復凍融,以防止提取的DNA講解。

      2 實驗試劑及器材

      植物基因組DNA提取試劑盒、液氮、β-巰基乙醇、苯酚、氯仿、無水乙醇

      研缽(需預冷)、移液器、1.5mL離心管(需滅菌)、低溫高速離心機、恒溫水浴鍋、4℃冰箱、-80℃冰箱、電泳儀

      3 操作步驟

      ①取健康的植物嫩葉(或幼芽)適量(約0.1g)置研缽中,于加入液氮迅速充分研磨至粉末狀。

      ②將研磨成粉末的樣品加到700uL 65℃預熱緩沖液GP1(預先加入β-巰基乙醇)的離心管中,65℃水浴20min。

      ③加入700uL氯仿,充分混合均勻,置于低溫高速離心機中,4℃、10000rpm下離心5min。

      ④將上層水相(約取400uL)轉入一個新的離心管中,加入700uL緩沖液GP2,充分混合均勻。

      ⑤將混勻的液體轉入吸附柱CB3中,4℃、10000rpm離心30s,低調廢液。

      ⑥加入500uL去蛋白液GD,13000rpm離心30s,棄掉廢液。

      ⑦加入700uL漂洗液GW,13000rpm離心30s,棄掉廢液。

      ⑧加入500uL漂洗液GW,13000rpm離心30s,棄掉廢液。

      ⑨ 再次13000rpm離心2分鐘,將吸附柱置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘。

      ⑩將吸附柱轉入干凈離心管中,加50-200uL(干重組織加30-50uL)洗脫緩沖液TE室溫置于2-5min,12000rpm離心30s。

      11離心得到的溶液再加入吸附柱中,室溫放置2min,13000rpm離心2min,即可得到高質量植物基因組DNA。

      4 基因組DNA提取常見問題

      ①基因組DNA的得率較低或無基因組DNA

      ②提取的基因組DNA有降解

      ③提取的基因組DNA中有RNA的污染

      ④提取的基因組DNA不能順利進行后續(xù)實驗

      5 紫外分光光度計檢測DNA濃度與純度

      DNA在OD260處有顯著吸收峰,OD260值為1相當于大約50ug/mL雙鏈DNA。一般用OD260/OD280值檢測DNA樣品的純度:正常OD260/OD280值約為1.7-1.9,說明DNA純度較好;小于1.7可能有蛋白質污染;大于2.0,說明有RNA污染或者DNA已經(jīng)降解。注意:因為pH值和離子會影響光吸收值,因此注意洗脫時不適用洗脫緩沖液,而使用去離子水,OD260/OD280值可能會略微偏低,但并不表示純度低。

      參考文獻

      [1] 李金璐,王碩,于婧,王玲,周世良.一種改良的植物DNA提取方法.植物學報,2013,48(1):72-78.

      [2] 遲婧,耿麗麗,高繼國,束長龍,張杰.植物葉片基因組DNA快速提取方法.生物技術通報,2014,9:51-57.

      [3] 陳昆松,李方,徐昌杰,張上隆,傅承新.改良CTAB法用于多年生植物組織基因組DNA的大量提取.遺傳,2004,26(4):529-531.

      [4] 陳建軍,王瑛.植物基因組大小進化的研究進展.遺傳,2009,31(5):464-470.

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