安碩++王思琦
[摘 ?要]DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,因此DNA的提取液是分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作之一?;蚪MDNA提取應保證核酸一級結構的完整性并且排除其他分子的污染,使下游實驗順利進行。不同植物的組成成分不同,同一植物個體的不同發(fā)育時期其組織細胞中的組成成分也不同,需要根據(jù)具體情況選擇適宜的提取方法。
[關鍵詞]基因組,DNA,提取
中圖分類號:TD327.3 文獻標識碼:A 文章編號:1009-914X(2016)24-0261-01
基因組(Genome)是一個細胞或者生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列,包括全套基因和間隔序列??墒腔蚪M測序的結果發(fā)現(xiàn)基因編碼序列只占整個基因組序列的很小一部分。因此,基因組應該指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子。說的更確切些,核基因組是單倍體細胞核內的全部 DNA分子。線粒體基因組則是一個線粒體所包含的全部DNA分子。葉綠體基因組則是一個葉綠體所包含的全部DNA分子。
基因組DNA提取應保證核酸一級結構的完整性,因為遺傳信息全部貯存在核酸的一級結構中,故完整的一級結構是保證核算結構與功能研究的基礎;應排除其他分子如蛋白、多糖、脂類、有機溶劑等的污染,使下游實驗順利進行。植物多樣性豐富,不同植物中的水分、多糖和酚類物質含量差別較大,尤其是植物組織中的多糖和酚類物質對隨后的酶切、PCR反應等實驗有較大的影響,提取時應注意去除。因為植物組織細胞內外的組成成分復雜多樣,所以使得植物基因組DNA的提取相對于動物等其他生物材料來說更為繁瑣、困難。不同植物的組成成分不同,同一植物個體的不同發(fā)育時期的組織細胞中的組成成分也不同,需要根據(jù)具體情況選擇適宜的提取方法。常用的制備植物基因組的方法有很多,常用到的方法有CTAB法等;對于植物基因組DNA的分離純化可以選擇已經(jīng)商品化的試劑盒(本實驗采用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒)。
目前,以人類基因組課題為契機,發(fā)達國家及部分發(fā)展中國家均在不遺余力地推進基因組科學的發(fā)展。對某些原生動物和真菌等小型基因組的分析已經(jīng)取得重大突破,整個研究領域正迎來后基因組科學(post-genome?science)時代。然而,植物基因組分析特別
是木本植物基因組分析起步較晚,現(xiàn)階段主要還是圍繞擬南芥(Arabidopsis?thaliana)、水稻(Oryza?sativa)和玉米(Zea?mays)等草本模式植物展開。
1 實驗材料
植物種類繁多,一般情況下選用健康的嫩葉(或幼芽)為宜。健康的嫩葉(或幼芽)不僅含有較少的代謝產物,而且細胞數(shù)量更多。通常情況下,在采集健康的嫩葉(或幼芽)之前將植物置于暗處一日為宜,這樣可以有效地減少代謝產物的產生。如果所采集的植物材料不能立刻用于基因組DNA提取實驗,可以將樣品保存于4℃冰箱中24h,超過24h時應置于-80℃中保存。注意樣品應避免反復凍融,以防止提取的DNA講解。
2 實驗試劑及器材
植物基因組DNA提取試劑盒、液氮、β-巰基乙醇、苯酚、氯仿、無水乙醇
研缽(需預冷)、移液器、1.5mL離心管(需滅菌)、低溫高速離心機、恒溫水浴鍋、4℃冰箱、-80℃冰箱、電泳儀
3 操作步驟
①取健康的植物嫩葉(或幼芽)適量(約0.1g)置研缽中,于加入液氮迅速充分研磨至粉末狀。
②將研磨成粉末的樣品加到700uL 65℃預熱緩沖液GP1(預先加入β-巰基乙醇)的離心管中,65℃水浴20min。
③加入700uL氯仿,充分混合均勻,置于低溫高速離心機中,4℃、10000rpm下離心5min。
④將上層水相(約取400uL)轉入一個新的離心管中,加入700uL緩沖液GP2,充分混合均勻。
⑤將混勻的液體轉入吸附柱CB3中,4℃、10000rpm離心30s,低調廢液。
⑥加入500uL去蛋白液GD,13000rpm離心30s,棄掉廢液。
⑦加入700uL漂洗液GW,13000rpm離心30s,棄掉廢液。
⑧加入500uL漂洗液GW,13000rpm離心30s,棄掉廢液。
⑨ 再次13000rpm離心2分鐘,將吸附柱置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘。
⑩將吸附柱轉入干凈離心管中,加50-200uL(干重組織加30-50uL)洗脫緩沖液TE室溫置于2-5min,12000rpm離心30s。
11離心得到的溶液再加入吸附柱中,室溫放置2min,13000rpm離心2min,即可得到高質量植物基因組DNA。
4 基因組DNA提取常見問題
①基因組DNA的得率較低或無基因組DNA
②提取的基因組DNA有降解
③提取的基因組DNA中有RNA的污染
④提取的基因組DNA不能順利進行后續(xù)實驗
5 紫外分光光度計檢測DNA濃度與純度
DNA在OD260處有顯著吸收峰,OD260值為1相當于大約50ug/mL雙鏈DNA。一般用OD260/OD280值檢測DNA樣品的純度:正常OD260/OD280值約為1.7-1.9,說明DNA純度較好;小于1.7可能有蛋白質污染;大于2.0,說明有RNA污染或者DNA已經(jīng)降解。注意:因為pH值和離子會影響光吸收值,因此注意洗脫時不適用洗脫緩沖液,而使用去離子水,OD260/OD280值可能會略微偏低,但并不表示純度低。
參考文獻
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