徐詩(shī)文 林東強(qiáng) 姚善涇

(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310027)

布洛芬與人血白蛋白位點(diǎn)II動(dòng)態(tài)結(jié)合過程的分子模擬：一種結(jié)合途徑分析

徐詩(shī)文 林東強(qiáng)*姚善涇

(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310027)

人血白蛋白(HSA)主要有兩個(gè)藥物結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)I和位點(diǎn)II，許多小分子優(yōu)先結(jié)合在位點(diǎn)II上，包括抗炎類藥物布洛芬。本文采用分子模擬方法研究了布洛芬小分子與HSA位點(diǎn)II結(jié)合的動(dòng)態(tài)過程，探討了二者的結(jié)合機(jī)制。首先構(gòu)建了50個(gè)隨機(jī)分布的布洛芬與HSA復(fù)合物體系，經(jīng)50 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬，其中一個(gè)布洛芬分子穩(wěn)定結(jié)合于位點(diǎn)II?；谠摲肿拥倪\(yùn)動(dòng)軌跡分析，發(fā)現(xiàn)布洛芬的結(jié)合可分為四個(gè)階段，即遠(yuǎn)程吸引、表面結(jié)合調(diào)整、進(jìn)入位點(diǎn)II空腔和穩(wěn)定結(jié)合。比較范德華和靜電相互作用能，發(fā)現(xiàn)初期以靜電吸引為主，中期在HSA表面的兩個(gè)極性區(qū)域間調(diào)整，逐步轉(zhuǎn)移至位點(diǎn)II附近；然后在位點(diǎn)II入口處的極性殘基和附近疏水殘基的共同作用下，布洛芬進(jìn)入位點(diǎn)II空腔；進(jìn)入空腔后，靜電和疏水共同作用形成穩(wěn)定結(jié)合。在結(jié)合過程中，位點(diǎn)II附近的蛋白表面發(fā)生明顯改變，體現(xiàn)出一定的“誘導(dǎo)契合”作用，同時(shí)分子模擬得到的結(jié)合模式和布洛芬-HSA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)類似。結(jié)果表明，分子模擬可以輔助研究小分子和蛋白結(jié)合的動(dòng)態(tài)過程，從分子水平闡述相關(guān)結(jié)合機(jī)制。

人血白蛋白；位點(diǎn)II；布洛芬；動(dòng)態(tài)結(jié)合；分子模擬

1 引言

人血白蛋白(HSA)，是人血漿中含量最豐富的一種蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白含量的60%。HSA能與許多內(nèi)源性和外源性化合物結(jié)合，是一種重要的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，還具有維持血液滲透壓、組成緩沖體系和為細(xì)胞提供原料等諸多生理功能。HSA由585個(gè)氨基酸殘基組成，單鏈，呈心形，其中α螺旋約占67%，無β折疊，含有35個(gè)半胱氨酸，組成17對(duì)二硫鍵，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。HSA分子含有三個(gè)結(jié)構(gòu)類似的α螺旋區(qū)域，分別稱為域I、域II和域III，每個(gè)結(jié)構(gòu)域又可分為兩個(gè)亞域，見圖1。Sudlow等1指出HSA分子主要有兩個(gè)疏水性藥物結(jié)合位點(diǎn)，分別為位于域IIA的位點(diǎn)I(華法令結(jié)合位點(diǎn))和位于域IIIA的位點(diǎn)II(吲哚結(jié)合位點(diǎn))。其中位點(diǎn)II更接近分子表面，且活性較高，易于與小分子結(jié)合，許多藥物如布洛芬、洋地黃毒苷等優(yōu)先結(jié)合在位點(diǎn)II上2。位點(diǎn)II由六個(gè)α螺旋構(gòu)成一個(gè)獨(dú)特的空腔結(jié)構(gòu)，入口處由極性殘基組成，可提供靜電相互作用和氫鍵；空腔中部為疏水性殘基，可提供疏水作用；空腔底部可針對(duì)不同分子提供疏水、氫鍵和靜電等雜合作用。對(duì)于較大分子量的藥物，如地西泮，位II還存在一個(gè)由LEU387等側(cè)鏈偏轉(zhuǎn)形成的亞腔3。

布洛芬，化學(xué)名為α-甲基-4-(2-甲基丙基)苯乙酸，分子結(jié)構(gòu)式見圖1，是世界衛(wèi)生組織、美國(guó)FDA唯一共同推薦的兒童退燒藥，也是兒童首選抗炎藥，還適用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)炎等治療4。布洛芬的羧基在pH中性條件下解離，帶一個(gè)單位負(fù)電荷。布洛芬與HSA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)(PDB ID)為2BXG，存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中位點(diǎn)II最為常見，結(jié)合模式見圖1，由位點(diǎn)II入口到空腔內(nèi)部形成靜電、疏水和雜合的典型三層相互作用分布5。帶負(fù)電荷的羧基可與位點(diǎn)II空腔入口處三個(gè)帶正電荷的殘基發(fā)生靜電相互作用；布洛芬的苯環(huán)與空腔中部環(huán)狀分布的4個(gè)亮氨酸形成強(qiáng)疏水相互作用；布洛芬分子尾部的異丁基鏈可與空腔底部的疏水殘基發(fā)生作用。布洛芬與HSA位點(diǎn)II的穩(wěn)定結(jié)合，取決于布洛芬分子和位點(diǎn)II空腔的獨(dú)特結(jié)構(gòu)6－8，雖然最終結(jié)合方式目前已經(jīng)了解，但結(jié)合的動(dòng)態(tài)過程仍舊未知，HSA是如何吸引布洛芬分子，布洛芬分子又是如何進(jìn)入位點(diǎn)II的空腔口袋，這些信息的獲得將提高人們對(duì)HSA-小分子結(jié)合過程的機(jī)制認(rèn)識(shí)，有助于結(jié)合配基的優(yōu)化設(shè)計(jì)。

圖1 HSA(a),布洛芬(b)以及二者結(jié)合(c)示意圖Fig.1 HSA(a),ibuprofen(b),and the ibuprofen-HSA binding(c)

近些年來，隨著分子模擬技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的蛋白與小分子的結(jié)合模式和機(jī)理可以在分子水平上得到闡述，同時(shí)分子模擬的結(jié)果也為配基設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)，遺憾的是蛋白-小分子結(jié)合的動(dòng)態(tài)過程研究很少9－12。本文采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法，以布洛芬與HSA位點(diǎn)II的動(dòng)態(tài)結(jié)合過程為研究對(duì)象，分析結(jié)合途徑，考察結(jié)合過程的分子識(shí)別、分子相互作用、結(jié)合能量和蛋白構(gòu)象變化，探討主要作用力、關(guān)鍵殘基和結(jié)合機(jī)制，并與結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，獲得規(guī)律性認(rèn)識(shí)，為基于HSA位點(diǎn)II的配基設(shè)計(jì)和HSA分子改造提供指導(dǎo)。

2 分子模擬方法

HSA的晶體結(jié)構(gòu)從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank，http://www.rcsb.org/pdb/)下載，包括未結(jié)合小分子的HSA晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：1AO6)和HSA-布洛芬復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：2BXG)。采用H++在線平臺(tái)13(http://biophysics.cs.vt.edu/)計(jì)算HSA氨基酸殘基在pH 7.4生理?xiàng)l件下的質(zhì)子化狀態(tài)，鹽濃度設(shè)為0.15 mol·L－1，蛋白質(zhì)內(nèi)部介電常數(shù)為10，外部介電常數(shù)為80，其它參數(shù)為默認(rèn)。布洛芬分子由Discovery Studio 3.0(DS 3.0)14構(gòu)建，采用Dreiding力場(chǎng)優(yōu)化15，各原子的質(zhì)子化狀態(tài)依據(jù)Marvinsketch計(jì)算的pKa值確定16。

為了讓本文分子模擬工作更具有意義和挑戰(zhàn)，采用1AO6作為HSA的起始構(gòu)象，探討其與隨機(jī)分布的布洛芬分子的自由結(jié)合過程。布洛芬分子的隨機(jī)分布由packmol軟件17實(shí)現(xiàn)，以HSA為中心，在邊長(zhǎng)12 nm的立方體中隨機(jī)分布50個(gè)布洛芬分子構(gòu)建復(fù)合物體系，見Supporting Information中圖S1所示。

分子動(dòng)力學(xué)模擬采用Gromacs 4.5.4軟件18，溫度設(shè)為300 K，采用周期性邊界。具體模擬過程如下：首先添加GROMOS96的43a1力場(chǎng)，采用spc水模型進(jìn)行溶劑化19，最小邊界厚度為1 nm，添加Na+以中和系統(tǒng)中的負(fù)電荷；其次，采用最陡下降法(steepest descent)進(jìn)行5×104步能量最小化，再分別進(jìn)行100 ps的等溫等容平衡(NVT)和等溫等壓平衡(NPT)；最后，在常溫常壓下進(jìn)行50 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，前15 ns為50個(gè)布洛芬分子和HSA的完整體系模擬，后35 ns集中于位點(diǎn)II結(jié)合的布洛芬分子模擬。

分子模擬的參數(shù)設(shè)置如下：體系溫度采用V-rescale算法20，壓力采用Parrinello-Rahman算法21。遠(yuǎn)程范德華力(VDW)的閥值為1.4 nm，靜電相互作用采用Partical Mesh Ewald(PME)算法22，截?cái)喟霃街禐?.4 nm。采用LINCS算法23固定共價(jià)鍵，相對(duì)偏差為10－4。體系時(shí)間步長(zhǎng)為0.002 ps，每隔10 ps取一次坐標(biāo)和能量值。非鍵能量用g_energy模塊計(jì)算，其中LJ-(SR)和Coulomb-(SR)分別代表范德華能(ELJ)和靜電作用能(ECoul)，非鍵總能量(Etotal)為二者之和。

布洛芬與HSA晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：2BXG)的分子動(dòng)力學(xué)模擬步驟和參數(shù)同上，模擬時(shí)長(zhǎng)為5 ns，計(jì)算二者的ELJ、ECoul和Etotal，并與隨機(jī)分布的HSA-布洛芬模擬結(jié)果進(jìn)行比較。

所有分子模擬均在曙光工作站A620r-G上進(jìn)行。前15 ns，由于50個(gè)隨機(jī)分布的布洛芬-HSA模擬體系較大，共有近70萬(wàn)個(gè)分子，分子動(dòng)力學(xué)模擬運(yùn)行的速度約為0.2 ns/天；后期35 ns，單一布洛芬分子結(jié)合的模擬體系約有10萬(wàn)個(gè)分子，運(yùn)算速度約1 ns/天。一個(gè)批次50 ns分子模擬總耗時(shí)約110天。

3 結(jié)果和討論

3.1HSA分子的結(jié)構(gòu)分析

首先將未結(jié)合小分子的1AO6與結(jié)合有布洛芬的2BXG兩個(gè)HSA域IIIA結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于位點(diǎn)II空腔入口處的殘基差異較大，如Supporting Information中圖S2所示。對(duì)于1AO6，組成空腔入口處的殘基為ARG410、LEU387、SER489和LYS414等四個(gè)殘基，由于受ARG410殘基阻擋，空腔入口較??；而對(duì)于2BXG，ARG410殘基發(fā)生位移，增加兩個(gè)殘基ASN391和GLN390共同形成空腔入口，因此入口顯著增大，有利于小分子的結(jié)合。

為了讓本文布洛芬-HSA結(jié)合的分子模擬更加具有普遍性，以1AO6作為HSA的起始構(gòu)象，探討隨機(jī)分布的布洛芬分子的自由結(jié)合過程。

3.2布洛芬與HSA結(jié)合的動(dòng)態(tài)過程解析

分析50個(gè)隨機(jī)分布于HSA周圍的布洛芬分子在前15 ns分子模擬過程的運(yùn)動(dòng)軌跡，可以發(fā)現(xiàn)有6個(gè)分子結(jié)合到HSA表面，分別位于域IA(2個(gè))，域IIIA(2個(gè))和域IIIB(2個(gè))，其中一個(gè)布洛芬分子從HSA位點(diǎn)II距離3 nm外開始接近并最終結(jié)合于位點(diǎn)II。比較上述6個(gè)布洛芬分子在14－15 ns之間的平均結(jié)合能，發(fā)現(xiàn)結(jié)合于域IA的一個(gè)分子和位點(diǎn)II附近布洛芬的結(jié)合能較大，絕對(duì)值大于200 kJ·mol－1，但前者波動(dòng)較大，后者結(jié)合較為穩(wěn)定。因此，后續(xù)以該布洛芬分子運(yùn)動(dòng)軌跡作為一種可能的位點(diǎn)II結(jié)合途徑，進(jìn)行系統(tǒng)分析。

對(duì)于結(jié)合于位點(diǎn)II的布洛芬分子，其與位點(diǎn)II中心的距離、結(jié)合過程的靜電作用能、范德華能和總能量變化見圖2。仔細(xì)分析該布洛芬分子進(jìn)入位點(diǎn)II的運(yùn)動(dòng)軌跡和能量變化，可以發(fā)現(xiàn)布洛芬與HSA的結(jié)合過程可分為四個(gè)階段：遠(yuǎn)程吸引、表面結(jié)合調(diào)整、進(jìn)入位點(diǎn)II空腔和位點(diǎn)II穩(wěn)定結(jié)合。在前5.5 ns內(nèi)，二者間的距離波動(dòng)較劇烈，結(jié)合能較小，約4.8 ns時(shí)靜電作用能開始出現(xiàn)并持續(xù)增大，表明布洛芬分子受靜電吸引而接近HSA表面，即第一階段的遠(yuǎn)程吸引；5.5－16 ns之間，距離略有波動(dòng)然后穩(wěn)定，相互作用能也相應(yīng)持續(xù)負(fù)值增大后穩(wěn)定在－200 kJ·mol－1左右，形成第一個(gè)能量穩(wěn)定平臺(tái)，即第二階段的表面結(jié)合調(diào)整；16－18 ns之間，二者間的距離小幅持續(xù)增大，靜電作用能發(fā)生突變，由－200 kJ·mol－1變化到－400 kJ· mol－1后回落至－250 kJ·mol－1左右，分析軌跡發(fā)現(xiàn)此階段布洛芬分子進(jìn)入HSA位點(diǎn)II的空腔；18 ns后，二者間的距離基本穩(wěn)定，能量波動(dòng)較小，最后平穩(wěn)在更低的能量平臺(tái)上，約－280 kJ·mol－1。以下具體分析四個(gè)階段的動(dòng)態(tài)結(jié)合過程。

3.3階段I：遠(yuǎn)程吸引

圖2 布洛芬分子與位點(diǎn)II中心的距離及其與HSA結(jié)合的能量變化Fig.2 Distance between ibuprofen and the center of Site II and the interaction energies of ibuprofen on to Site II of HSA

分子模擬的初始階段(0－5.5 ns)，開始時(shí)HSA和布洛芬分子沒有明顯接觸，無明顯的非鍵相互作用，靜電作用能和范德華能基本為0。5.0 ns左右，布洛芬分子已經(jīng)接近HSA表面。從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，pH 7.4時(shí)，雖然HSA整個(gè)分子帶有6個(gè)凈負(fù)電荷，但是表面電荷分布不均勻，位點(diǎn)II附近存在明顯的正電區(qū)域。分析表明，布洛芬分子帶有負(fù)電荷，帶正電的LYS545可通過與布洛芬分子羧基的靜電吸引作用，將其“吸引”至HSA蛋白表面，因此靜電作用能急劇增大。當(dāng)布洛芬分子到達(dá)HSA表面后，位點(diǎn)II附近帶正電的LYS541同時(shí)發(fā)揮作用，靜電作用能持續(xù)增大，范德華能也逐步增大，促進(jìn)布洛芬分子穩(wěn)定結(jié)合于HSA表面。分析能量貢獻(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)該階段主要以長(zhǎng)程的靜電吸引力為主。

圖3 HSA表面電勢(shì)分布(pH 7.4)以及不同分子模擬時(shí)刻布洛芬的相對(duì)位置Fig.3 Isopotential surface of HSAat pH 7.4 and the position of ibuprofen molecule at different simulation time

3.4階段II：表面結(jié)合調(diào)整

該階段(5.5－16 ns)布洛芬分子已經(jīng)結(jié)合到HSA域III的表面，不過在兩個(gè)極性區(qū)域(域IIIB的LYS541/LYS545和域IIIA的ARG410/LYS414)之間波動(dòng)，范德華能和靜電能總體呈現(xiàn)逐步增大后趨于平穩(wěn)。

分析該階段不同氨基酸殘基和布洛芬分子的靜電相互作用能，發(fā)現(xiàn)4個(gè)殘基最為重要，分別為ARG410、LYS414、LYS541和LYS545，均帶正電荷，其中LYS541和LYS545位于域IIIB，ARG410和LYS414位于域IIIA，形成兩個(gè)極性正電區(qū)域。分別計(jì)算兩個(gè)極性區(qū)域的靜電作用能，結(jié)果見圖4?？梢园l(fā)現(xiàn)，初期(5.5－8 ns)主要由域IIIB的LYS541和LYS545控制，其中LYS545還可與布洛芬分子形成氫鍵(見圖5(a))；后期(8－16 ns)由域IIIA的ARG410和LYS414主導(dǎo)，ARG410也與布洛芬分子形成氫鍵(見圖5(b))。也就是說，布洛芬分子由域IIIB遷移到了域IIIA，接近位點(diǎn)II的空腔入口。該階段范德華能貢獻(xiàn)較大的殘基為ARG410、 LEU407、 LEU394、 GLN390 和ALA406，其中疏水殘基ALA406、LEU407和LEU394可與布洛芬的苯環(huán)發(fā)生疏水性作用；12 ns后，范德華能起主導(dǎo)作用為疏水殘基LEU407和LEU394。從圖2可以發(fā)現(xiàn)，6 ns時(shí)總結(jié)合能為－100 kJ·mol－1左右，6－16 ns期間持續(xù)負(fù)值增大，16 ns時(shí)達(dá)到－200 kJ·mol－1，說明經(jīng)過局部調(diào)整達(dá)到了更有利于布洛芬結(jié)合的狀態(tài)。此外，靜電作用能和范德華能同步負(fù)值增大，表面靜電和疏水相互作用共同促進(jìn)了布洛芬分子的表面結(jié)合調(diào)整。

3.5階段III：進(jìn)入位點(diǎn)II空腔

圖4 兩個(gè)極性區(qū)域的靜電相互作用能比較Fig.4 Comparition on the electrostatic interaction energies of two polar regions

圖5 6 ns(a)和16 ns(b)時(shí)布洛芬分子與HSA表面的結(jié)合示意圖Fig.5 Binding modes of ibuprofen on the surface of HSAat 6 ns(a)and 16 ns(b)

該階段主要集中于16－18 ns，布洛芬分子進(jìn)一步從ⅢA極性區(qū)域進(jìn)入到HSA位點(diǎn)II的空腔。從圖2可以看出，結(jié)合能量進(jìn)一步增大，其中靜電作用能變化劇烈，說明布洛芬分子的結(jié)合再次調(diào)整，而范德華能持續(xù)增大，從而形成更穩(wěn)定的結(jié)合。

分析該階段不同氨基酸殘基的靜電作用貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)位于前三位的是ARG410、LYS414和 TYR411，均位于位點(diǎn)II空腔的入口處。不過，三個(gè)殘基的靜電作用能變化體現(xiàn)出不同的規(guī)律，具體見圖6。ARG410帶有正電荷，與布洛芬分子的靜電作用能相對(duì)穩(wěn)定，平均約－73.2 kJ·mol－1，不過波動(dòng)較大，在－167.6到－10.4 kJ·mol－1范圍內(nèi)變動(dòng)，ARG410還可與布洛芬分子形成較穩(wěn)定的氫鍵；LYS414也帶有正電荷，靜電作用能變化劇烈，16.7 ns之前約為0 kJ·mol－1，16.7 ns時(shí)突然變化到－200 kJ·mol－1，18 ns左右又趨于－50 kJ·mol－1左右；而TYR411僅在17.8 ns左右開始發(fā)揮作用，由0突然變到－80 kJ·mol－1左右。仔細(xì)分析這些殘基的空間分布，可以詳細(xì)了解布洛芬分子如何從HSA表面進(jìn)入到位點(diǎn)II的空腔中。該階段3個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)(16.5、17.3和18 ns)的典型結(jié)合見圖7，可以發(fā)現(xiàn)ARG410、LYS414和TYR411的空間位置依次深入空腔內(nèi)部。前期為最外側(cè)的ARG410主導(dǎo)，布洛芬開始接近空腔；中期以LYS414主導(dǎo)，布洛芬逐步進(jìn)入空腔；后期TYR411貢獻(xiàn)的能量開始增大，同時(shí)布洛芬與ARG410的氫鍵斷裂并開始與TYR411形成氫鍵，促使布洛芬進(jìn)入了空腔的深處。

此外，范德華能貢獻(xiàn)較大殘基有LEU387、LEU394、LEU407和LEU430等4個(gè)亮氨酸和PHE488，其中LEU387和PHE488的范德華能逐漸增大并起主導(dǎo)作用。比較該階段的靜電作用能和范德華能數(shù)值，可以發(fā)現(xiàn)二者波動(dòng)較大，且絕對(duì)值均較第二階段變大，靜電作用變化更明顯，說明靜電作用和疏水作用共同促使小分子從位點(diǎn)II入口處進(jìn)入空腔?？偰芰恳策_(dá)到了更低的平臺(tái)，結(jié)合更加穩(wěn)定。

3.6階段IV：位點(diǎn)II穩(wěn)定結(jié)合

圖6 階段III中三個(gè)關(guān)鍵殘基的靜電作用能變化Fig.6 Electrostatic interaction energies of three key residues at the binding phase III

圖7 階段III中三個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)(16.5 ns(a)、17.3 ns(b)和18 ns(c))布洛芬與位點(diǎn)II入口殘基的結(jié)合示意圖Fig.7 Binding modes of ibuprofen on the entrance of site II atthebindingphaseIII(16.5ns(a),17.3ns(b),and18ns(c))

18 ns后，布洛芬分子進(jìn)入位點(diǎn)II的空腔，經(jīng)細(xì)微調(diào)整，形成了穩(wěn)定的結(jié)合。分析該階段布洛芬分子運(yùn)動(dòng)軌跡，發(fā)現(xiàn)波動(dòng)很小，說明了結(jié)合較為穩(wěn)定；靜電作用能和范德華能變化不大，基本保持在－150和－130 kJ·mol－1。

分析不同氨基酸殘基貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)靜電作用的主要?dú)埢蠥RG410、TYR411、ARG485和SER489，布洛芬分子的羧基與上述除ARG485外的三個(gè)殘基均形成了氫鍵，使結(jié)合更為穩(wěn)定。從范德華能貢獻(xiàn)上看，主要疏水殘基有LEU387、LEU407、VAL426、LEU430、LEU453、PHE488等6個(gè)。具體分析這些關(guān)鍵殘基的空間分布，可以發(fā)現(xiàn)靜電相互作用集中于位點(diǎn)II空腔的入口，而疏水作用分布于空腔的中部和深處，具體見圖8(a)。 ARG410、TYR411、ARG485和SER489等位于空腔入口處的極性殘基與布洛芬的羧基發(fā)生靜電相互作用；空腔中部的LEU387、LEU407和LEU430等疏水殘基主要與苯環(huán)發(fā)生疏水作用；而深處的VAL426、LEU453和PHE488等疏水殘基可與布洛芬的異丁基發(fā)生疏水作用。

對(duì)HSA-布洛芬結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：2BXG)也進(jìn)行5 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，并與前文布洛芬分子自由結(jié)合的分子模擬結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如圖8(b)。發(fā)現(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)中HSA-布洛芬結(jié)合能為－392.8 kJ·mol－1，其中靜電作用能－291.3 kJ· mol－1，范德華能－101.5 kJ·mol－1，總能量值絕對(duì)值比前文的模擬結(jié)果大，其中靜電作用能偏大，但范德華能稍小。不過，總相互作用能量排名前10位的殘基中有8個(gè)與前文分子模擬體系相同，其中提供靜電作用有4個(gè)相同(分別為ARG410、TYR411、ARG485和SER489)，主要與布洛芬的羧基發(fā)生靜電作用；范德華能中4個(gè)相同，分別為L(zhǎng)EU387、LEU407、LEU430和LEU453，圍繞在布洛芬的苯環(huán)周圍，主要貢獻(xiàn)了疏水作用。

圖8 布洛芬-HSA位點(diǎn)II結(jié)合比較Fig.8 Comparison on the binding modes of ibuprofen on site II of HSA

比較穩(wěn)定結(jié)合布洛芬后1AO6模擬體系和2BXG的HSA-布洛芬晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)二者位點(diǎn)II的均方根偏差在0.2 nm之內(nèi)，仔細(xì)比對(duì)空腔內(nèi)的殘基分布，發(fā)現(xiàn)基本一致。進(jìn)一步比較布洛芬分子發(fā)現(xiàn)，布洛芬頭部羧基均位于位點(diǎn)II空腔入口處的極性區(qū)域，但苯環(huán)及尾部側(cè)鏈的位置不同。晶體結(jié)構(gòu)中布洛芬分子的苯環(huán)進(jìn)入由4個(gè)LEU組成的環(huán)內(nèi)，而模擬體系的布洛芬分子則“停靠”在外側(cè)，4個(gè)LEU并沒有形成可以容納布洛芬苯環(huán)的環(huán)狀分布，而是處于4個(gè)LEU和VAL426、PHE488等疏水殘基組成的另一個(gè)疏水腔中，該疏水腔的疏水性略大于晶體結(jié)構(gòu)中四個(gè)LEU圍城的環(huán)狀疏水區(qū)域，因此也是一個(gè)潛在的結(jié)合狀態(tài)。

3.7結(jié)合過程中HSA分子的“誘導(dǎo)契合”效應(yīng)

在模擬體系的四個(gè)階段中，HSA域III多個(gè)殘基通過改變空間位置以適應(yīng)布洛芬分子的結(jié)合，Rehman等24也報(bào)道了HSA在結(jié)合小分子時(shí)結(jié)合部位殘基發(fā)生一定程度的結(jié)構(gòu)變化。第一階段，位于域IIIB極性區(qū)域的LYS541和LYS545帶正電的側(cè)鏈波動(dòng)較大，與布洛芬的羧基形成了靜電吸引作用，通過動(dòng)態(tài)調(diào)整而牽引布洛芬分子至蛋白表面，并與LYS545形成氫鍵；第二階段，域IIIA極性區(qū)域的帶正電殘基(ARG410和LYS414)開始與域IIIB極性區(qū)域競(jìng)爭(zhēng)布洛芬分子，此時(shí)ARG410、LYS414、LYS541和LYS545四個(gè)帶正電的殘基共同競(jìng)爭(zhēng)與布洛芬羧基的結(jié)合機(jī)會(huì)，通過側(cè)鏈的擺動(dòng)使布洛芬在域IIIB(LYS541和LYS545)和域IIIA (ARG410和LYS414)間不斷調(diào)整，最后IIIA極性區(qū)域起主導(dǎo)作用，布洛芬分子靠近位點(diǎn)II；第三階段，位點(diǎn)II空腔入口的3個(gè)帶正電殘基ARG410、LYS414和TYR411依次起到靜電吸引作用，三個(gè)殘基通過自身空間位置的變化以適應(yīng)布洛芬的結(jié)合，引導(dǎo)布洛芬分子逐步進(jìn)入空腔口袋，此時(shí)空腔深處的PHE488等疏水性殘基通過側(cè)鏈調(diào)整使空腔容積變大，促使布洛芬更容易進(jìn)入空腔；第四階段，結(jié)合能量趨于穩(wěn)定，位點(diǎn)II周圍的殘基運(yùn)動(dòng)幅度減小，布洛芬和位點(diǎn)II形成穩(wěn)定結(jié)合，布洛芬分子頭部的羧基與ARG410、TYR411、ARG485和SER489發(fā)生靜電作用，苯環(huán)與LEU387、LEU407、VAL426、LEU430、LEU453和PHE488等疏水殘基發(fā)生疏水作用。結(jié)合過程的熱點(diǎn)殘基與Dantas等25通過密度泛函理論計(jì)算出的布洛芬與位點(diǎn)II結(jié)合可能的關(guān)鍵殘基類似。布洛芬分子和HSA結(jié)合四個(gè)階段的動(dòng)態(tài)過程見視頻文件(Supporting Information)。整體而言，在布洛芬的動(dòng)態(tài)結(jié)合過程中，HSA位點(diǎn)II附近的氨基酸殘基通過不斷的動(dòng)態(tài)調(diào)整，適應(yīng)布洛芬分子的結(jié)合、遷移和進(jìn)入位點(diǎn)II空腔，體現(xiàn)一定的“誘導(dǎo)契合”作用。

4 結(jié)論

經(jīng)隨機(jī)分布的布洛芬分子動(dòng)力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)一個(gè)布洛芬分子與HSA位點(diǎn)II結(jié)合的可能途徑，通過分析運(yùn)動(dòng)軌跡，比較了范德華和靜電相互作用能，了解二者結(jié)合的動(dòng)態(tài)過程。發(fā)現(xiàn)布洛芬-HSA位點(diǎn)II結(jié)合可分為四個(gè)階段：遠(yuǎn)程吸引、表面結(jié)合調(diào)整、進(jìn)入位點(diǎn)II空腔和位點(diǎn)II穩(wěn)定結(jié)合，初期以長(zhǎng)程靜電吸引為主，中期在HSA域Ⅲ的兩個(gè)極性區(qū)域間波動(dòng)，逐步轉(zhuǎn)移至位點(diǎn)II附近；然后在位點(diǎn)II入口處的極性殘基和附近疏水殘基的共同作用下，布洛芬進(jìn)入位點(diǎn)II空腔；進(jìn)入空腔后，靜電和疏水共同作用形成穩(wěn)定結(jié)合。在結(jié)合過程中，位點(diǎn)II附近的關(guān)鍵氨基酸殘基波動(dòng)較大，蛋白表面發(fā)生明顯改變，通過“誘導(dǎo)契合”作用促使布洛芬分子進(jìn)入位點(diǎn)II空腔。比較發(fā)現(xiàn)，分子模擬得到的結(jié)合模式和布洛芬-HSA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)類似。結(jié)果表明，分子模擬可以用于探究小分子和蛋白結(jié)合的動(dòng)態(tài)過程，深入了解結(jié)合過程的微觀變化，從分子水平闡述結(jié)合機(jī)制，同時(shí)也可為特定位點(diǎn)的藥物和分離配基設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。

Supporting Information:50 ibuprofen molecules around HSA at the initial state of molecular simulation,the comparison on the surface of Site II of HSA(1AO6 and 2BXG)and a video of ibuprofen binding on Site II of HSA in 30 ns have been included.This information is available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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Molecular Simulations on Dynamic Binding of Ibuprofen onto Site II of Human Serum Albumin:One Potential Way Analysis

XU Shi-Wen LIN Dong-Qiang*YAO Shan-Jing
(Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education,College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University,Hangzhou 310027,P.R.China)

Human serum albumin(HSA)has two main drug binding sites termed SiteIand SiteII.Most small molecules like ibuprofen(a well-known anti-inflammatory drug)bind to SiteIIpreferentially.In this study, molecular simulation methods were used to investigate the dynamic binding process of ibuprofen to SiteII.A system of 50 ibuprofen molecules distributed randomly around HSAwas constructed.After a 50-ns molecular dynamics simulation,one ibuprofen molecule bound stably to SiteII.Based on trajectory analysis of this ibuprofen molecule,the binding process of ibuprofen onto SiteIIcan be divided into four phases:(i)long-range attraction;(ii)adjustment on the surface;(iii)entering to SiteIIpocket;and(iv)stable binding at SiteII.After evaluating van der Waals′and electrostatic interaction energies during the binding process,it was found that the initial major driving force involves electrostatic attractions.Subsequently,ibuprofen locks between two polar regions on the surface near SiteIIand then moves to SiteII.Ibuprofen then enters the pocket of SiteIIby combinatorial effects of polar and hydrophobic residues nearby the entrance of SiteII.Electrostatic and hydrophobic interactions form the stable binding of ibuprofen in SiteII.The molecular surface near SiteIIwas observed to change significantly during binding,which indicates an induced fit mechanism.The binding mode obtained with molecular simulations is consistent with the crystal structure of the ibuprofen-HSAcomplex.Theresults show that molecular simulations would help to evaluate the dynamic binding processes of small molecules to proteins and improve our understanding of the binding mechanisms at the molecular level.

Human serum albumin;SiteII;Ibuprofen;Dynamic binding;Molecular simulation

O641

10.3866/PKU.WHXB201609131

Received:May 25,2016;Revised:September 13,2016;Published online:September 13,2016.

*Corresponding author.Email:lindq@zju.edu.cn;Tel:+86-571-87951982.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21476198,21276228,21576233).

國(guó)家自然科學(xué)基金(21476198,21276228,21576233)資助項(xiàng)目