轉(zhuǎn)基因煙草在PEG6000模擬干旱脅迫條件下的生理響應(yīng)

陳 霞， 楊鵬軍， 張旭強(qiáng)， 楊 寧

( 西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 蘭州 730070 )

轉(zhuǎn)基因煙草在PEG6000模擬干旱脅迫條件下的生理響應(yīng)

陳 霞， 楊鵬軍， 張旭強(qiáng)， 楊 寧

( 西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 蘭州 730070 )

該研究以轉(zhuǎn)高山離子芥的CbPLDα、CbPLDβ基因煙草為材料，研究了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶系對(duì)PEG6000溶液模擬干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明：滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白分別以各自不同的響應(yīng)方式在干旱脅迫下增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性，且在所有濃度PEG6000模擬的干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量始終顯著高于野生型煙草(P<0.05)。說(shuō)明干旱脅迫下兩種轉(zhuǎn)基因煙草的滲透調(diào)節(jié)能力要強(qiáng)于野生型煙草。保護(hù)酶系中，超氧化物歧化酶(SOD) 和過(guò)氧化物酶(POD)在減輕干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草膜脂過(guò)氧化傷害中起到協(xié)同互補(bǔ)作用，而過(guò)氧化氫酶( CAT) 和抗壞血酸過(guò)氧化物酶( APX) 在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草清除過(guò)氧化氫機(jī)制中發(fā)揮主要作用，說(shuō)明保護(hù)酶系在抵制干旱脅迫和保護(hù)轉(zhuǎn)基因煙草免受干旱傷害方面具有重要的生物學(xué)功能，這從生理角度揭示了高山離子芥CbPLDα、CbPLDβ響應(yīng)干旱的生理生態(tài)機(jī)理。綜上，高山離子芥CbPLDα、CbPLDβ基因參與了干旱脅迫下煙草的膜穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和抗氧化酶系的調(diào)控。該研究結(jié)果為提高植物抗旱性研究及應(yīng)用提供了新的基因資源，對(duì)于加強(qiáng)PLD功能研究、補(bǔ)充植物抗干旱理論及抗低溫干旱育種種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

PEG6000模擬干旱脅迫，CbPLDα，CbPLDβ， 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)， 保護(hù)酶

高山離子芥(Chorisporabungean)是一種高抗逆的多年生高山草本植物,具有特殊的分子及生理抗逆響應(yīng)機(jī)制。Yang et al(2012, 2015)以高山冰緣植物中的高山離子芥為材料,克隆了高山離子芥的磷脂酶D基因，對(duì)高山離子芥的磷脂酶D基因在低溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明高山離子芥的磷脂酶D基因在抵御逆境脅迫中發(fā)揮了重要作用。磷脂酶D(phospholipose D，PLD)普遍存在于生物體中，PLD基因可以被逆境條件，如：干旱、滲透脅迫、低溫、機(jī)械損傷、病原菌刺激等因素迅速激活，從而引起細(xì)胞內(nèi)PLD活性的增加(Lee et al,1997)。PLD 各個(gè)家族成員具有不同的功能，磷脂酶類(lèi)編碼基因是參與植物脅迫應(yīng)答的重要基因之一。本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建了高山離子芥的CbPLDα(GenBank登錄號(hào)為KF248008)，CbPLDβ(GenBank登錄號(hào)為HM756247)基因的植物表達(dá)載體(楊寧等，2014)，使之在野生型煙草中正常表達(dá)后，獲得轉(zhuǎn)CbPLDα和CbPLDβ基因煙草。本研究以轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因煙草和野生型煙草為材料，在PEG6000模擬的干旱脅迫條件下，對(duì)煙草葉片的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶活性變化進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)CbPLDα、CbPLDβ基因是否參與了煙草抵御干旱脅迫的機(jī)制，為作物的抗旱育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料的培養(yǎng)

對(duì)轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因的煙草和野生型(CK)煙草種子進(jìn)行精選和表面消毒后，種植到MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草種子用Kan進(jìn)行培養(yǎng)篩選，CK種子置于不含Kan培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照16 h·d-1培養(yǎng)，待種子萌發(fā)至2 cm時(shí)移植到無(wú)菌生根培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)20 d。

1.2 材料處理

選擇大小一致、長(zhǎng)勢(shì)旺盛的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗接種于150 mL廣口三角瓶中，分別在廣口三角瓶中倒入含瓊脂的MS培養(yǎng)基各25 mL，用于固定幼苗，再向每個(gè)廣口瓶加入含10%、15%、20%、30%的PEG6000的MS液25 mL,進(jìn)行干旱脅迫處理6 d。在同樣條件下以不添加PEG6000的試管苗為對(duì)照組。收集處理過(guò)的煙草葉片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

電解質(zhì)滲透率(REC)測(cè)定參照Amako et al(1994)方法，可溶性蛋白(SP)測(cè)定參照考馬斯亮藍(lán)G-250法(楊穎麗等，2004)，可溶性糖(SS)含量測(cè)定采用苯酚比色法(王晶英等，2003)。游離脯氨酸(Pro)測(cè)定采用磺基水楊酸法(Bates, 1973)。丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法(張志良和瞿偉菁，2003),CAT活性、SOD活性和POD活性測(cè)定參照Shah et al(2001)的方法，APX活性測(cè)定參照Asada(1984)的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，采用Excel 2003軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片膜系統(tǒng)傷害程度指標(biāo)的測(cè)定

2.1.1 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響 干旱脅迫通常會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜損傷，表現(xiàn)在細(xì)胞膜的電導(dǎo)率增加和膜脂過(guò)氧化程度的增加。本研究分別測(cè)定了正常生長(zhǎng)條件下和干旱處理第6天植株的葉片細(xì)胞電導(dǎo)率和丙二醛的含量。在正常生長(zhǎng)條件下，CK和轉(zhuǎn)基因煙草的電導(dǎo)率差別不大，在8.7～ 9.96之間。干旱處理6 d后，隨著PEG6000濃度的增大，煙草植株的電導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因煙草葉片的電導(dǎo)率下降幅度顯著低于(P<0.05)CK煙草葉片的電導(dǎo)率，且10% PEG6000處理后，CK組葉片的電導(dǎo)率相較于轉(zhuǎn)基因煙草達(dá)到最大，是轉(zhuǎn)CbPLDα和CbPLDβ基因煙草葉片的1.6倍及1.3倍(圖1：A)。

2.1.2 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片MDA含量的影響 丙二醛(MDA)是表示植物膜脂氧化傷害程度的指標(biāo)之一。

圖 1 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)CbPLDα、 CbPLDβ基因煙草葉片電導(dǎo)率(A)、MDA含量(B)的影響Fig. 1 Effects of drought stress on Rate of electric conductance (REC) (A), MDA content (B) of CbPLDα and CbPLDβ transgenic tobacco leaves

圖 2 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因煙草游離脯氨酸含量的影響Fig. 2 Effects of drought stress on Pro content of CbPLDα and CbPLDβ transgenic tobacco leaves

圖 3 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因煙草葉片可溶性糖含量的影響Fig. 3 Effects of drought stress on SS content of CbPLDα and CbPLDβ transgenic tobacco leaves

圖 4 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因煙草可溶性蛋白的影響Fig. 4 Effects of drought stress on SP content of CbPLDα and CbPLDβ transgenic tobacco leaves

圖 5 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLD β基因煙草葉片SOD活性的影響Fig. 5 Effects of drought stress on SOD activity of CbPLDα and CbPLDβ transgenic tobacco leaves

圖 6 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因煙草POD活性的影響Fig. 6 Effects of drought stress on POD activity of CbPLDα、CbPLDβ transgenic tobacco leaves

圖 7 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因煙草CAT活性的影響Fig. 7 Effects of drought stress on CAT activity of CbPLDα and CbPLDβ transgenic tobacco leaves

圖 8 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因煙草APX活性的影響Fig. 8 Effects of drought stress on APX activity of CbPLDα and CbPLDβ transgenic tobacco leaves

從圖1：B可以看出，干旱處理后，CK組煙草葉片的MDA含量始終顯著高于轉(zhuǎn)基因煙草葉片的MDA含量，且20% PEG6000脅迫時(shí)，CK煙草葉片的MDA含量達(dá)到最大值，此時(shí)，CK煙草葉片的MDA含量分別是轉(zhuǎn)CbPLDα和CbPLDβ基因煙草葉片的2倍和1.2倍。PEG6000模擬干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草葉片電導(dǎo)率和MDA含量的影響表明，轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因煙草在抵御干旱脅迫方面處于優(yōu)勢(shì)。

2.2 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定

2.2.1 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片游離脯氨酸(Pro)含量的影響 Pro在保護(hù)植物滲透調(diào)節(jié)方面起到重要的作用。逆境條件下，如干旱、低溫、高溫、冰凍、鹽漬等都會(huì)造成植物體內(nèi)Pro含量的積累，并且積累的量與植物的抗逆性密切相關(guān)。因此，Pro常用來(lái)作為植物抗性的一項(xiàng)生理指標(biāo)。如圖2所示，轉(zhuǎn)基因煙草的Pro含量隨著PEG6000脅迫強(qiáng)度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，且轉(zhuǎn)CbPLDα基因煙草和轉(zhuǎn)CbPLDβ基因煙草的脯氨酸含量均在30% PEG6000脅迫時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)轉(zhuǎn)CbPLDα和CbPLDβ基因煙草的脯氨酸含量分別是野生型的1.3倍及1.2倍。

2.2.2 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片可溶性糖含量的影響 在干旱脅迫條件下，要維持植物正常生長(zhǎng)，就需要積累大量的可溶性糖來(lái)維持植物細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性。如圖3所示，經(jīng)一定強(qiáng)度的干旱處理后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的可溶性糖含量呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢(shì)，且在30% PEG6000脅迫時(shí)可溶性糖含量達(dá)到最大，此時(shí)，轉(zhuǎn)CbPLDα和CbPLDβ基因煙草的可溶性糖含量分別是野生型的1.20倍及1.21倍。

2.2.3 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片可溶性蛋白含量的影響 植物可溶性蛋白的含量與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透勢(shì)有關(guān)，越高含量的可溶性蛋白能夠使植物維持較低的滲透勢(shì)，從而幫助植物抵抗干旱帶來(lái)的脅迫。如圖4所示，隨著PEG6000脅迫強(qiáng)度的增加，轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢(shì)，且10% PEG6000脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性蛋白含量達(dá)到最大值，此時(shí)，轉(zhuǎn)CbPLDα和CbPLDβ基因煙草的可溶性蛋白含量分別是野生型的1.62和1.52倍。

2.3 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片抗氧化酶系的測(cè)定

2.3.1 對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片SOD活性和POD活性的影響 干旱脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制。圖5中，隨著PEG6000脅迫強(qiáng)度的增加，煙草的SOD活性呈波動(dòng)性變化，且在此變化過(guò)程中野生型煙草的SOD活性下降幅度顯著大于轉(zhuǎn)基因煙草的SOD活性(P<0.05)。當(dāng)受到20% PEG6000脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)CbPLDα和CbPLDβ基因煙草的SOD活性增加到最大值，分別是野生型煙草的1.3倍及1.51倍，30%PEG6000脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的SOD活性較之低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG6000脅迫呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但野生型煙草的SOD活性的下降幅度大于轉(zhuǎn)基因煙草。而轉(zhuǎn)基因煙草植株的POD活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在20% PEG6000脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的POD活性達(dá)到最大值，且兩種轉(zhuǎn)基因煙草的POD活性分別是野生型煙草的1.6倍和1.4倍，30%PEG6000脅迫下煙草的POD活性較之20%PEG6000脅迫有所下降,且野生型煙草POD活性的下降幅度高于轉(zhuǎn)基因煙草的POD活性變化(圖6)。

3 討論

3.1 PEG6000模擬干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片細(xì)胞中膜脂過(guò)氧化程度的變化

在逆境條件下植物細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平失衡，導(dǎo)致植物細(xì)胞膜遭到破壞。相對(duì)電導(dǎo)率的變化能夠反映細(xì)胞膜的傷害程度，本研究隨著PEG6000脅迫強(qiáng)度的增加，轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率始終低于野生型煙草，在一定程度上維持了細(xì)胞膜的透性，減少了細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)的外滲，降低了植物細(xì)胞內(nèi)外的水勢(shì)差，增強(qiáng)了耐旱性，這與張芳(2010)對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及抗旱性檢測(cè)中，干旱脅迫6 d后轉(zhuǎn)白沙蒿鐵蛋白基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于野生型煙草一致，表明高山離子芥的CbPLDα、CbPLDβ基因參與維持了轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞膜完整性，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱能力。MDA是植物細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平被打破的直接證據(jù)之一。MDA含量的高低反映了植物所處逆境環(huán)境的強(qiáng)弱，其增加速度也能反映植物在逆境中的生存時(shí)間長(zhǎng)短(徐秀梅等，2014)。吳茜等(2015)發(fā)現(xiàn)超表達(dá)擬南芥2-烯醛還原酶基因顯著降低了煙草在干旱脅迫下的MDA含量，保護(hù)了煙草細(xì)胞膜的完整性。本研究中，隨著PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，轉(zhuǎn)基因煙草的MDA較之正常條件有明顯增加，但在PEG6000處理下轉(zhuǎn)基因煙草MDA的增加幅度始終小于野生型煙草，即PEG6000模擬的干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的損害程度低于野生型煙草。

3.2 PEG6000模擬干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

滲透調(diào)節(jié)直接反映了是植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力(張海燕等，1998)。 大多植物遭受逆境脅迫后體內(nèi)會(huì)累積脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等物質(zhì), 它們對(duì)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)起重要作用(李?lèi)偟龋?011)。 植物中脯氨酸的累積與其逆境抗性呈正相關(guān)(Lutts et al,1996)。郭利娜等(2013)發(fā)現(xiàn)cyFBPase基因過(guò)表達(dá)提高了干旱脅迫下煙草的可溶性糖含量。本研究也發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可提高轉(zhuǎn)基因煙草葉片脯氨酸和可溶性糖的含量。本研究中，隨著脅迫強(qiáng)度的增加轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可溶性糖的含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且在此過(guò)程中轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸和可溶性蛋白的含量始終高于野生型煙草，表明高山離子芥CbPLDα、CbPLDβ提高了轉(zhuǎn)基因煙草的滲透調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性。

在逆境條件下，植物體為適應(yīng)逆境環(huán)境，維持自身細(xì)胞膜的完整，會(huì)通過(guò)積累蛋白或產(chǎn)生新蛋白的方法，來(lái)保護(hù)植物體不受逆境傷害(方志紅和董寬虎，2010；魏愛(ài)麗等，1997)。本研究中，轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性糖隨著脅迫強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，且在上升過(guò)程中轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性蛋白含量始終高于野生型煙草的蛋白含量。這與張執(zhí)金(2007)在ERF蛋白TERF1調(diào)控?zé)煵菀蚁┥锖铣刹⑻岣邼B透脅迫耐性的分子機(jī)理中轉(zhuǎn)基因煙草在滲透脅迫下可溶性蛋白含量的升高是一致的。表明轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ參與了煙草的抗旱機(jī)制。

3.3 PEG6000模擬干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片保護(hù)酶活性的變化

3.3.1 PEG6000模擬干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片SOD、POD活性的變化 在非逆境環(huán)境中，植物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)處于相對(duì)平衡，逆境脅迫打破了這種平衡，導(dǎo)致細(xì)胞中大量積累活性氧和自由基(曾韶西和王以柔，1990)。當(dāng)植物體內(nèi)的平衡狀態(tài)被打破后，植物細(xì)胞膜的完整性和透性就會(huì)被破壞，細(xì)胞內(nèi)的一系列反應(yīng)就不能正常發(fā)生，植物的正常生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制(艾立江·麥麥提等，2008)。植物體內(nèi)的SOD、POD等抗氧化物酶可以減輕活性氧對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用，增強(qiáng)植物在逆境條件下的生長(zhǎng)能力(李麗華等，2007)。保護(hù)酶系統(tǒng)中SOD、POD、CAT、APX等酶類(lèi)是細(xì)胞清除超氧自由基、過(guò)氧化物等活性氧的重要酶類(lèi)，在抵御活性氧方面起著重要作用。

本研究中，當(dāng)轉(zhuǎn)基因煙草受到不同強(qiáng)度的PEG6000模擬的干旱脅迫后SOD活性發(fā)生了變化，但在整個(gè)脅迫過(guò)程中，由于轉(zhuǎn)入了高山離子芥的CbPLDα和CbPLDβ基因煙草的抗旱性被顯著提高，這與王娟(2007)轉(zhuǎn)ZmPIS基因及聚合betA/TsVP基因提高棉花耐受性中轉(zhuǎn)基因棉花的SOD活性的升高的結(jié)果一致。而本研究轉(zhuǎn)基因煙草的POD活性在15% PEG6000脅迫下才顯著升高，表明轉(zhuǎn)基因煙草POD活性對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)要滯后于SOD，但隨著脅迫強(qiáng)度的增加轉(zhuǎn)基因煙草POD活性的增幅始終高于野生型煙草。

3.3.2 PEG6000模擬干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片CAT、APX活性的變化 在非逆境條件下，植物可以正常生長(zhǎng)依靠的是植物自身的調(diào)節(jié)能力，維持自身的氧化還原水平處于可調(diào)節(jié)的閾值之內(nèi)，但隨著逆境環(huán)境的加重，植物細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)能力不能維持自身的正常生長(zhǎng)，氧化和還原水平的平衡被打破就會(huì)使植物遭受生存威脅。本研究對(duì)CAT和APX響應(yīng)干旱脅迫結(jié)果表明，CAT和APX均積極參與了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)PEG6000模擬干旱脅迫的響應(yīng)，并隨脅迫強(qiáng)度的增加轉(zhuǎn)基因煙草CAT和APX活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，CAT和APX活性的升高可能是由于干旱脅迫使得活性氧不斷累積，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較多的CAT和APX，以保護(hù)自身免受傷害。郭慧娜(2007)以轉(zhuǎn)棗樹(shù)Zj-CP基因的擬南芥為材料，研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能增強(qiáng)CAT和APX的活性，降低活性氧對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的氧化損傷。楊曉健(2014)的研究表明，轉(zhuǎn)擬南芥VKOR基因的番茄在干旱脅迫下CAT和APX的活性均升高，顯著降低了番茄植株內(nèi)ROS的積累量，提高了轉(zhuǎn)基因番茄植株抵抗干旱脅迫的能力。本研究表明，高山離子芥CbPLDα、CbPLDβ基因參與了煙草抵抗干旱脅迫的機(jī)制，提高了轉(zhuǎn)CbPLDα、CbPLDβ基因煙草的抗旱性能。

綜上所述，高山離子芥的CbPLDα、CbPLDβ基因的轉(zhuǎn)入提高了煙草在干旱脅迫下的抗氧化物酶活性，增強(qiáng)了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)煙草細(xì)胞膜的保護(hù)能力。，從而提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株干旱脅迫的耐受性，表明高山離子芥的CbPLDα、CbPLDβ基因不僅響應(yīng)低溫脅迫(楊寧等，2014)，而且在煙草抵御干旱的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

AMAKO K, CHEN GX, ASADA K, 1994. Separae assays specific for ascordate preoxidase and guaiacol peroxidase and for the chloroplastic and cytosolicisozymse of ascarbate peroxidase in plants [J]. Plants Cell Physiol, 35(3): 497-504.

ASADA K, 1984. Formation of active oxygen and its scavenging [J]. Meth Enzymol, 105: 422-429.

BATES LS, 1973. Rapid determination of free proline for water stress studies [J]. Plant Soil, 39(1): 205-207. DU XM, YING WX, ZHAO YX, 2001. The production and scavenging of rezctive oxygen species in plants [J]. Chin J Biotechnol, 17(2): 121-125. [杜秀敏, 殷文璇, 趙彥修, 2001. 植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機(jī)制 [J]. 生物工程學(xué)報(bào), 17(2): 121-125.]

FANG ZH, DONG KH, 2010. Effects of NaCl stress on solube protein contents and solube carbohydrate contents ofArtemisiacnethifolia[J]. Chin Agric Sci Bull, 26(16): 147-149. [方志紅, 董寬虎, 2010. NaCl對(duì)堿蒿可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響 [J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 26(16): 147-149.]

GUO HN, 2013.JujubeZj2-CPgene plant expression vector construction and functional verification [D]. Taiyuan: Shanxi University. [郭慧娜, 2013. 棗樹(shù)Zj2-CP基因植物表達(dá)載體構(gòu)建與功能驗(yàn)證 [D]. 太原: 山西大學(xué).]

GUO LN, ZHANG R, SUN GQ, et al, 2013. Overexpression ofcyFBPgene can enhance the drought tolerance of transgenic tobacco [J]. Biotechnol Bull, 11(06): 63-68. [郭利娜, 張銳, 孫國(guó)清, 等, 2013. cyFBPase基因過(guò)表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性 [J]. 生物技術(shù)通報(bào)2013, 11(06): 63-68.]AI LJMMT, QI MYNSG L, 2008. Effects of NaCl stress on lipid peroxidation and antioxidant enzymes inElaeagnusoxycarpa[J]. J Friut Sci, 25(4): 531-536. [艾立江·麥麥提, 齊曼. 尤努斯, 公勤, 2008. NaCl脅迫對(duì)尖果沙棗實(shí)生苗膜脂過(guò)氧化與抗氧化酶系的影響 [J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 25(4): 531-536.]LI LH, 2007. Discussion on drought tolerance analysis of transgenic tobaccogalEgene and its possible mechanism [D]. Jinan: Shandong University. [李麗華, 2007. 轉(zhuǎn)galE基因煙草的耐旱性分析及其可能的機(jī)理的探討 [D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué).]LUTTIS S, KINET J, 1996. Bouharmont J. Effects of salt stress on growth, mineral nutrition and proline accumulation in relation to osmotic adjustment in rice (OryzasativaL. ) cultivars differing in salinity resistance [J]. Plant Growth Regul, 19(3): 207-218.

LIU SP, 2006. Simulated drought stress on antioxidant system jujube seedlings and osmotic adjustment [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin, 9(10): 26-29. [劉世鵬, 2006. 模擬干旱脅迫對(duì)棗樹(shù)幼苗的抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)的影響 [J]. 西北植物學(xué)報(bào), 9(10): 26-29.]

LEE S, SUH S, KIM S, et al, 1997. Systemic elevation of pphosphatidic acid and lysophos-pholipid levels in wounded plants [J]. Plant J, (12): 547-556. LI Y, CHEN ZL, WANG J, et al, 2011. Effects of salt stress onSuaedaheteropteaKitagawa growth and osmosis-regulating substance concentration [J]. Chin J Ecol(生態(tài)學(xué)雜志), 30(1): 72-76. [李?lèi)? 陳忠林, 王杰, 等, 2011. 鹽脅迫對(duì)翅堿蓬生長(zhǎng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的影響 [J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 30(1): 72-76.]

SHAH K, KUMAR RG, VERMA S, et al, 2001. Effect of cadmium on lipid peroxidation, superoxide anion generation and activities of antioxidant enzymes in growing rice seedlings [J]. Plant Sci, 161(6): 135-144.

SREENIVASULU N, GRIMM B, WOBUS U, et al, 2000. Different response of antioxidant compounds to salinity in salt-tolerant and salt sensitive seeding of foxtail millet [J]. Physiol Plant, 109(4): 435-442.

WEI AL, YANG C, CHEN YZ, 1997. The study of soybean callus small true page change soluble protein content under salt stress [J]. J Shanxi Agric Univ, 17(4): 318-321. [魏愛(ài)麗, 楊臣, 陳云昭, 1997. 鹽脅迫下大豆小真葉愈傷組織可溶性蛋白含量變化的研究 [J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 17(4): 318-321.]

WANG J, 2007. The study of enhancement of drought tolerance in cotton by transgene ofZmPISand transgene pyramiding ofbetA/TsVP[D]. Jinan: Shandong University. [王娟, 2007. 轉(zhuǎn)ZmPIS基因及聚合betA/TsVP基因提高棉花耐受性 [D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué).]

WANG JY, A0 H, ZHANG J, et al, 2003. Principles and techniques of plant physiological and biochemical experiment [M]. Haerbing: Northeast Forestry University Press: 12-13. [王晶英 , 敖紅, 張杰, 等, 2003. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)與原理 [M]. 哈爾濱: 東北林業(yè)大學(xué)出版社: 12-13.]

WU Q, WANG SW, CAO D, et al, 2015. Influence of overexpression of 2-alkenal reductase gene on drought resistance in tobacco [J]. Acta Bot Boreal-Occidental Sin, 35(6): 166-172. [吳茜, 王世穩(wěn), 曹丹, 等, 2015. 超表達(dá)擬南芥2-烯醛還原酶基因?qū)煵菘购敌缘淖饔脵C(jī)理分析 [J]. 西北植物學(xué)報(bào), 35(6): 166-172.]

XI LH, 2011. The analysis of turn Lea-bZIP bivalent transgenic tobacco drought and salt tolerance [D]. Harbin: Northeast Forestry University. [錫林呼, 2011. 轉(zhuǎn)Lea-bZIP雙價(jià)基因煙草抗旱、耐鹽性分析 [D]. 哈爾濱: 東北林業(yè)大學(xué).]

XU XM), ZHANG XH, WANG HJ, 2004. Physiological property in drought resistance ofAtriplexcanescens[J]. J Nanjing For Univ (Natl Sci Ed), (5): 54-58. [徐秀梅, 張新華, 王漢杰, 2004. 四翅濱藜抗旱生理特性研究 [J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), (5): 54-58.]YANG N, DING FX, WU GF, et al, 2015. Phospholipase Dα fromChorisporabungeana: cloning and partial function characterization [J]. Plant Growth Regul, 75(2): 511-520.

YANG N, DING FX, WANG CL, et al, 2014. Effects of low temperature stress onosmatic and protective enzyme system inChorisporabungeanaplantletsin vitro [J]. J Sichuan Univ (Nat Sci

(Continueonpage1467)(Continuefrompage1504)

Ed), 51(2): 385-390. [楊寧, 丁芳霞, 王程亮, 等, 2014. 低溫脅迫對(duì)高山離子芥試管苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及保護(hù)酶系的影響 [J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 51(2): 385-390.]

YANG N, QIANG ZQ, CHEN X, 2014. The coding sequence clone and expression vector construction of PLDα gene fromChorisporaBungeana[J]. J NW Norm Univ (Nat Sci Ed), 50(3): 94-98. [楊寧, 強(qiáng)治全, 陳霞, 等, 2014. 高山離子芥磷脂酶Dα編碼區(qū)基因序列克隆與表達(dá)載體構(gòu)建 [J]. 西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 50(3): 94-98.]YANG N, YUEXL, ChEN XL, et al, 2012. Molecular cloning and partial characterization of a novel phospholipase D gene fromChorisporabungeana[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult, 108(2): 201-212.

YANG XJ, 2014. Plant VKOR redox function of essential amino acids and resilience [D]. Taian: Shandong Agriculture University. [楊曉健, 2014. 植物VKOR氧化還原功能必須氨基酸及抗逆功能的研究 [D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué).]

YANG YL, YANG N, WANG L, et al, 2007. Effect of salinty on the physiological characteristic in two wheat cultivars [J]. J Lanzhou Univ (Nat Sci Ed), 43(2): 30. [楊穎麗, 楊寧, 王萊, 等, 2007. 鹽脅迫對(duì)小麥幼苗生理指標(biāo)的影響 [J]．蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 43(2): 30.]

ZHANG F, 2010. Sphaerocephala ferritin gene intoNicotianatabacumand drought detection [D]. Lanzhou: Lanzhou Univercity. [張芳, 2010. 白沙蒿鐵蛋白基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化及抗旱性檢測(cè) [D]. 蘭州: 蘭州大學(xué).]

ZHANG HY , ZHAO KF , 1998. Effects of salt and water stress on osmoticS.salsamoderating [J]. J Plant, 40 (1): 56-61. [張海燕, 趙可夫, 1998. 鹽分和水分脅迫對(duì)鹽地堿蓬幼苗滲透調(diào)節(jié)效應(yīng)的研究 [J]. 植物學(xué)報(bào), 40 (1): 56-61.]

ZHAO LY, DENG XP, SHAN L, 2005. The response mechanism of active oxygen species removing system to drought stress [J]. Acta Botanica Boreal-Occident Sin, 25(2): 413-418. [趙麗英, 鄧西平, 山侖, 2005. 活性氧清除系統(tǒng)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 25(2): 413-418.]

ZENG SX, WANG YR, 1990. Effects of low temperature stress onCucumberascorbate peroxidase activity and glutathione content [J]. Acta Phytophysiol Sin, 16(1): 37-42. [曾韶西, 王以柔, 1990. 低溫脅迫對(duì)黃瓜子葉抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性和谷胱甘肽含量的影響 [J]. 植物生理學(xué)報(bào), 16(1): 37-42.]

ZHANG ZJ , 2007. ERFERF protein TERF1 ethylene biosynthesis and regulation of tobacco increase osmotic stress tolerance molecular mechanism [D]. Beijing: China Agriculture Univercity. [張執(zhí)金, 2007. ERFERF蛋白TERF1調(diào)控?zé)煵菀蚁┥锖铣刹⑻岣邼B透脅迫耐性的分子機(jī)理 [D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué).]

ZHANG ZL, QU WQ, 2003. The direction of plant physiological experiment [M]. Beijing: Higher Education Press: 101-102. [張志良, 瞿偉菁, 2003. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) [M]. 北京: 高等教育出版社: 101-102.]

Physiological response of transgenic tobacco to drought stress simulated by PEG6000

CHEN Xia, YANG Pen-Jun, ZHANG Xu-Qiang, YANG Ning

( College of life Sciences, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China )

Chorisporabungeanais a rare alpine subnival plant species, the extremely harsh living environment makes it become a new plant for study the responses of drought stress. In this study we usedCbPLDα,CbPLDβtransgenic tobacco plants as material to find the mechanism of plants response drought stress, and we also detected the osmolytes content and protective enzymes activity inCbPLDα,CbPLDβtransgenic tobacco plants, using the ways of the drought stress simulated by PEG6000. The results showed that proline, solube sugar and soluble protein involved in strengthening resistance ofCbPLDα,CbPLDβtransgenic tobacco to drought stress simulated by PEG6000，and in different concentrations of PEG6000 simulate drought stress,CbPLDα,CbPLDβtransgenic tobacco proline, soluble sugar and soluble protein content were always significantly higher than that of wild type tobacco plants (P<0.05). This indicated that osmotic adjustment ability of drought stress inCbPLDαandCbPLDβtransgenic tobacco was stronger than the wild type tobacco plants. In the protective enzymes, Superoxide dismutase(SOD) and Peroxidase (POD) have significant complementary effects on mitigating the injury of membrane lipid peroxidation of transgenic tobacco; Catalase (CAT) and Ascorbate peroxidase (APX) played major roles in the mechanism of removal of hydrogen peroxide. SOD,POD,CAT and APX had higher activity inCbPLDα,CbPLDβtransgenic tobaccos than in wild tobacco plants (P<0.05). All of these results indicated that protective enzymes had important biological function in protecting transgenic tobacco from drought stress simulate by PEG6000. It partly revealed the physiological and ecological mechanisms of theCbPLDα,CbPLDβgenes responding to drought environment inC.bungeana. The results showed that bothCbPLDαandCbPLDβtransgenic tobaccos involved in the regulation pathway of membrane stability, osmotic adjustment and the regulation of anti-oxidative system.CbPLDαandCbPLDβgenes can provide powerful genetic resources for improving drought resistance of plants. The results strengthen the PLD for functional studies, supplementary plant resistance to drought stress and drought resistance theory breeding germplasm development and utilization, has important theoretical value and practical significance.

drought stress simulated by PEG6000,CbPLDαandCbPLDβ, osmolytes, protective enzyme

10.11931/guihaia.gxzw201510024

2015-10-19

2016-02-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160087, 31360061)[Supported by the National Natural Science Foundation of China (31160087, 31360061)]。

陳霞(1989-)，女，甘肅蘭州人，碩士研究生，主要從事植物分子細(xì)胞生物學(xué)研究，(E-mail)1102729599@qq.com。

*通訊作者： 楊寧，博士，教授，主要從事植物分子細(xì)胞生物學(xué)研究，(E-mail)xbsd-yn@163.com。

Q945

A

1000-3142(2016)12-1498-08

陳霞， 楊鵬軍， 張旭強(qiáng)， 等. 轉(zhuǎn)基因煙草在PEG6000模擬干旱脅迫條件下的生理響應(yīng)發(fā)[J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1498-1504

CHEN X, YANG PJ, ZHANG XQ， et al. Physiological response of transgenic tobacco to drought stress simulated by PEG6000 [J]. Guihaia， 2016， 36(12):1498-1504