杜學(xué)海，漫曉丹，寧彩波，周成利，王寶東，劉紅林*

（1.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站，遼寧 沈陽 110032；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

低氧促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡

杜學(xué)海1，漫曉丹2，寧彩波2，周成利1，王寶東1，劉紅林2*

（1.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站，遼寧 沈陽 110032；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

為研究低氧是否能促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，將體外培養(yǎng)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞分成對照組和低氧處理組。對照組的細(xì)胞一直在常規(guī)的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，低氧處理組的細(xì)胞先在常規(guī)二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一段時間后放入三氣培養(yǎng)箱內(nèi)（1%的氧氣，5%的二氧化碳，94%的氮氣）培養(yǎng)，一定時間后收集兩組細(xì)胞樣：用流式細(xì)胞儀結(jié)合Annexin V/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡情況；用熒光定量PCR檢測HIF1α及BNIP3基因在兩組細(xì)胞中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；用TUNEL染色法檢測兩組細(xì)胞的DNA斷裂情況；在小鼠顆粒細(xì)胞中過表達(dá)HIF1α，檢測BNIP3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果表明：與對照組相比，低氧處理能夠顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡；低氧處理組HIF1α和BNIP3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組；低氧處理的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)有明顯的核固縮現(xiàn)象，但DNA斷裂多發(fā)生在胞質(zhì)內(nèi)；在小鼠顆粒細(xì)胞中過表達(dá)HIF1α能夠引起B(yǎng)NIP3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高。這些結(jié)果表明低氧處理能促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞內(nèi)HIF1α與BNIP3基因的表達(dá)量升高；由低氧處理后小鼠卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂多發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，推測低氧引起小鼠顆粒細(xì)胞凋亡可能是通過線粒體凋亡途徑實現(xiàn)的。

低氧；HIF1α；BNIP3；小鼠卵泡顆粒細(xì)胞；凋亡機制

低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor1，HIF1）是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動物的生長發(fā)育、生理和病理反應(yīng)過程中起著重要作用[1]。HIF1由HIF1α和HIF1β兩個亞單位組成，其中HIF1α是主要的氧調(diào)節(jié)亞基，也是功能亞基，一般認(rèn)為HIF1β在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量是恒定的，HIF1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量主要有HIF1α決定[2]。在低氧條件下，HIF1α很穩(wěn)定，并會移位到細(xì)胞核中，與核中的HIF1β結(jié)合形成異二聚體HIF1發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[3]，研究發(fā)現(xiàn)HIF1調(diào)控的下游靶基因近80種，主要與血管生成、細(xì)胞糖代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為有關(guān)[4]。在常氧條件下，HIF1通過泛素-蛋白酶體路徑迅速降解，所以低氧誘導(dǎo)被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生HIF1α應(yīng)答的主要原因[5]。BNIP3是一種促凋亡蛋白，屬于Bcl-2家族成員的BH3-only促凋亡蛋白亞類，其分子中僅含有BH3結(jié)構(gòu)域和羥基末端的跨膜結(jié)構(gòu)TM[6]。BNIP3可通過BH3結(jié)構(gòu)與抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL等形成異二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]；也可依賴于其羥基末端TM結(jié)構(gòu)的線粒體錨定作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。BNIP3啟動子區(qū)含有一個與HIF1轉(zhuǎn)錄相關(guān)的功能結(jié)合位，即缺氧反應(yīng)元件（hypoxia-respome element，HRE），其在低氧條件下與HIF1發(fā)生緊密結(jié)合[8]；在細(xì)胞系內(nèi)過表達(dá)HIF1α能促進(jìn)BNIP3的表達(dá)[8]，低氧處理牛黃體細(xì)胞48 h可見明顯核固縮和DNA碎片等細(xì)胞凋亡特征以及BNIP3和caspase-3的表達(dá)增加[9]。這些研究報道表明BNIP3是一種低氧應(yīng)答基因，且受HIF1（HIF1α）的直接調(diào)控[8]。動物機體內(nèi)各組織器官常因供血不足而引發(fā)低氧應(yīng)激并進(jìn)一步誘發(fā)包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的多種細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)[7]。哺乳動物卵泡發(fā)育過程中也存在低氧應(yīng)激，卵泡在發(fā)育過程中會逐漸變大并在其內(nèi)部形成很大的腔隙，腔隙中存在大量卵泡液，卵丘顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞就被卵泡液包裹其中，被卵泡液包裹的卵丘顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞周圍的脈管分布減少，供血迅速下降，形成低氧環(huán)境[5]。那么低氧應(yīng)激能否直接促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，如果能

1.1試驗材料

1.1.1 試驗動物 試驗所用小鼠為3～4周齡健康雌性昆明白小白鼠，購自南京市青龍山動物繁殖中心。

1.1.2 主要試驗試劑 熒光定量試劑盒購、大腸埃希菌（Escherichiacoli，E.coli）DH 5α、T4DNA連接酶、PCR產(chǎn)物擴增酶以及所用限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；pcDNA3.1由本實驗室保存；DNA產(chǎn)物純化與質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN生物公司；PMSG購自寧波第二激素場；點突變試劑盒購自諾唯贊生物公司；TUNEL熒光試劑盒購自Roche公司；Annexin V-FITC染色試劑盒購自碧云天生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用的耗材及轉(zhuǎn)染試劑lip2000購自Invitrogen公司；培養(yǎng)基、PBS及血清購自Life technologies公司。

1.2試驗方法

1.2.1 小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的獲得與培養(yǎng) 小鼠腹腔注射PMSG（10 U）46 h后，頸椎脫臼處死，無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢，立即放入盛有完全培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿（35 mm×15 mm）內(nèi)，在體式顯微鏡下用1 mL注射器針頭扎破卵泡，釋放出顆粒細(xì)胞。積攢一定量顆粒細(xì)胞后，用移液槍吸出，吹打均勻后加入含有完全培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。2～3 d換一次液，待孔內(nèi)細(xì)胞貼壁達(dá)到80%左右做試驗處理。

1.2.2 Annexin V-FITC凋亡染色 體外培養(yǎng)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞，經(jīng)不同氧濃度處理后，收集上層細(xì)胞培養(yǎng)液（含有因處理死亡的細(xì)胞），PBS洗1次，用不含EDTA的胰酶室溫消化顆粒細(xì)胞5 min，把收集的培養(yǎng)液和消化下來的細(xì)胞混合1 000 r/min離心5 min，棄上清，然后用PBS重懸細(xì)胞。重復(fù)PBS洗滌2～3次，細(xì)胞計數(shù)后取50 000～100 000個細(xì)胞1 000 r/min離心5 min后，棄上清加入195 μL Annexin V-FITC反應(yīng)緩沖液和5 μL的annexin其機制又是什么。帶著這些問題，筆者做了一系列試驗并證實了低氧能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，且其凋亡機制可能是BNIP3介導(dǎo)的線粒體凋亡通路。

1 材料與方法

V-FITC染料25℃反應(yīng)10 min，1 000 r/min離心5 min后，棄上清，加入190 μL的PI反應(yīng)緩沖液和10 PI染料，輕微震蕩混勻，避光放在冰上待流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 細(xì)胞總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol提取法（Invitrogen公司）提取體外培養(yǎng)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞總RNA，詳細(xì)步驟參照說明書進(jìn)行。采用15 min快速反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（TaKaRa公司）對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟見試劑盒使用說明書，獲得的cDNA產(chǎn)物于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HIF1α-pcDNA3.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建以小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的cDNA為模板，用引物P1（見表1）擴增得到HIF1α編碼區(qū)的全長。條件為98℃預(yù)變性30 s后，進(jìn)行如下循環(huán)：95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，循環(huán)35次，最后延伸7 min。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，對凝膠上2 500 bp左右的條帶進(jìn)行膠回收，所得純化產(chǎn)物用BamHI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物純化，與經(jīng)同樣酶處理的真核表達(dá)載體pcDNA3.1連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌、擴培、測序等步驟后得到HIF1α過表達(dá)載體HIF1α-pcDNA3.1。

表1 本文所用引物Table1 Primer used in this study

1.2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 采用lip2000脂質(zhì)體法做轉(zhuǎn)染試驗：轉(zhuǎn)染分對照組和試驗組，試驗組加入的是HIF1α-pcDNA3.1重組質(zhì)粒，對照組加入的是pcDNA3.1空載質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染前吸棄培養(yǎng)基，用2 mL無抗PBS沖洗1～2次，換1.5 mL全無培養(yǎng)基，放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱；配A液：3 μg質(zhì)粒加入opti培養(yǎng)基使終體積為250 μL，B夜：10 μL脂質(zhì)體加入240 μL Opti培養(yǎng)基使終體積為250 μL；配好后，靜止5 min，B液加入A液，20 min后轉(zhuǎn)染，500 μL每孔，4～6 h后換成含15%胎牛血清、1%雙抗的DMEM F12培養(yǎng)基。

1.2.6 熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR儀對不同處理小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中HIF1α、BNIP3和GAPDH基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，所用定量引物分別為P2、P3和P4（見表1）。Real-time PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件嚴(yán)格參照2×SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa公司）試劑盒使用說明書。每個樣品重復(fù)3次，取其平均值，用2-△△Ct法計算各個基因表達(dá)量。

1.2.7 TUNEL凋亡檢測 經(jīng)處理后的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2次，每次5 min；用0.2%的Triton X-100處理5 min，PBS洗2次，每次5 min；用含0.3%BSA的封閉液封閉15 min，PBS洗2次，每次5 min；加入50 μL配置好的TUNEL反應(yīng)液，并用剪好的封口膜貼在蓋上，防治蒸發(fā)，于37℃濕盒內(nèi)反應(yīng)60 min；PBS洗3次，每次5 min；200 μL的DAPI室溫作用10 min，PBS洗3次，每次5 min；于激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均用X±SED表示，用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用獨立樣本t檢驗比較兩組間差異，P＜0.05時確定為差異顯著，P＜0.01確定為差異極顯著[10]。

2 結(jié)果

2.1低氧促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡同一批次分離獲得的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并分為對照組和低氧處理組，對照組一直在常規(guī)二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；低氧處理組在常規(guī)二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，轉(zhuǎn)至低氧培養(yǎng)箱（三氣培養(yǎng)箱，1%的氧氣，5%的二氧化碳，94%的氧氣）繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集兩組顆粒細(xì)胞做Annexin V-FITC凋亡染色，流式細(xì)胞儀上檢測兩組細(xì)胞凋亡情況。發(fā)現(xiàn)低氧處理組的顆粒細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組（見圖1），表明低氧處理能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。

圖1 低氧處理促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡Fig.1 Hypoxia promotes the apoptosis of follicular granulosa cells in mice

2.2低氧促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)BNIP3的表達(dá)有研究表明低氧應(yīng)激能引起心肌細(xì)胞內(nèi)BNIP3的表達(dá)量升高，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞凋亡[11-12]。BNIP3是一種線粒體促凋亡蛋白，能夠引起細(xì)胞凋亡和壞死，且BNIP3的表達(dá)受HIF1a調(diào)控[8]。那么小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中是否也存在這種關(guān)系呢？筆者做了以下試驗來驗證。一是采用熒光定量PCR檢測低氧處理的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中HIF1a和BNIP3表達(dá)情況；二是在小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中過表達(dá)HIF1a，觀察BNIP3的表達(dá)情況。結(jié)果表明低氧處理組的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中HIF1a和BNIP3的mRNA水平顯著高于常氧組（對照組）；在小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中過表達(dá)HIF1a能顯著促進(jìn)BNIP3的mRNA轉(zhuǎn)錄。這說明低氧處理能引起小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)升高；且在小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)同樣受HIF1a的調(diào)控。

2.3低氧處理的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞DDNNAA斷裂多發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)用TUNEL法檢測體外培養(yǎng)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)低氧處理的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)有明顯的核固縮現(xiàn)象，但DNA斷裂多發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（見圖3）。由此可知細(xì)胞質(zhì)內(nèi)只有線粒體內(nèi)含有DNA，說明低氧應(yīng)激引起的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡很可能是由線粒體功能障礙開始的。

3 討論

動物機體內(nèi)的低氧應(yīng)激主要是因為供血不足產(chǎn)生的，如腫瘤組織中因細(xì)胞分裂生長速度太快而引起的低氧應(yīng)激[13-14]，牛黃體溶解時而引起的低氧應(yīng)激[7]，心血管系統(tǒng)中因間斷性供血而引起的低氧應(yīng)激[15]。這些現(xiàn)象都有一個共同點，就是應(yīng)激組織細(xì)胞內(nèi)的HIF1a的表達(dá)量升高，并伴隨著細(xì)胞凋亡[7，13-15]。在卵泡發(fā)育過程中，卵泡顆粒細(xì)胞的快速增值，以及卵泡液不斷增多，使得卵泡腔內(nèi)血管分布迅速減少，供血水平迅速降低[5]，便有可能產(chǎn)生低氧應(yīng)激，也就是說，在卵泡發(fā)育過程中也存在低氧應(yīng)激。本次試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，體外培養(yǎng)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞在低氧處理條件下發(fā)生顯著凋亡，細(xì)胞內(nèi)HIF1α的表達(dá)量顯著升高。這一試驗結(jié)果與上述研究報道[7，13-15]相一致，說明低氧確實能夠促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。在實時熒光定量PCR試驗中發(fā)現(xiàn)，低氧處理不僅促進(jìn)了卵泡顆粒細(xì)胞中HIF1α的轉(zhuǎn)錄，同時還促進(jìn)了BNIP3的轉(zhuǎn)錄；且在卵泡顆粒細(xì)胞中過表達(dá)HIF1α能極顯著地引起B(yǎng)NIP3的表達(dá)。這說明低氧能夠促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)BNIP3的表達(dá)，且BNIP3的表達(dá)很有可能受HIF1α的調(diào)控。BNIP3是Bcl-2蛋白家族中BH3-only蛋白的一種，能夠參與細(xì)胞自噬和凋亡[16]。有研究表明，在低氧條件下，BNIP3能夠引起線粒體缺陷并進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡或死亡[13，16]，且BNIP3的表達(dá)受HIF1α的調(diào)控[11]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，低氧處理體外培養(yǎng)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞不僅出現(xiàn)了明顯的核固縮現(xiàn)象，而且在胞質(zhì)內(nèi)還出現(xiàn)了DNA斷裂現(xiàn)象。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)只有線粒體中存在DNA，這說明低氧處理直接導(dǎo)致了線粒體的功能障礙。綜合前人研究報道及上述試驗結(jié)果，推測低氧應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡很可能是通過BNIP3介導(dǎo)的線粒體凋亡通路實現(xiàn)的。有文獻(xiàn)表明卵泡顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的主要原因[17]，而低氧能夠促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，因此卵泡發(fā)育過程中的低氧應(yīng)激也可能是引起卵泡閉鎖的原因之一。

圖2 低氧促進(jìn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)BNIP3的表達(dá)Fig.2 Hypoxia promotes the expression ofBNIP3in mouse follicular granulosa cells

圖3 低氧處理引起小鼠卵泡顆粒細(xì)胞核固縮和胞質(zhì)DNA斷裂Fig.3 Hypoxia caused mouse follicular granulosa cells nuclear condensation and cytoplasmic DNA fragmentation

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Hypoxia promotes the apoptosis of follicular granulosa cells in mice

Du Xuehai1,Man Xiaodan2,Ning Caibo2,Zhou Chengli1, Wang Baodong1,Liu Honglin2*
(1.Liaoning Provincial Animal Husbandry Economy station,Liaoning Shenyang 110032; 2.College of Animal Sciences and Technology,Nanjing Agricultural University,Jiangsu Nanjing 210095)

The study was conducted to examine whether hypoxia induces granulosa cells apoptosis in mouse follicular.The cultured mouse granulosa cells were divided into control and hypoxia groups,the control group cells were cultured in carbon dioxide incubator,the hypoxia group cells were cultured in three gas(1%oxygen,5%carbon dioxide,94%nitrogen)incubator after a certain period of time in carbon dioxide incubator.The samples were collected after a certain period of time:Cells apoptosis were detected by flow cytometry with Annexin V/PI double staining;the mRNA transcription levels of HIF1αand BNIP3 were detected by real-time PCR;intracellular DNA breakage were detected by TUNEL;the mRNA transcription levels of HIF1αand BNIP3 were detected after overexpression of HIF1α in cultured mouse granulosa cells.The results indicated: Compared with the control group, hypoxia can significantly promote the apoptosis of cultured mouse granulosa cell;hypoxia can increase the mRNA transcription levels of HIF1αand BNIP3;hypoxia can cause the mouse follicular granulosa cells nuclear condensation and cytoplasmic DNA fragmentation;overexpression of HIF1α can increase the mRNA transcription levels of BNIP3 incultured mouse granulosa cells.These results indicate that hypoxia promotes the apoptosis of mouse follicular granulosa cells probably through mitochondrial apoptosis pathway.

Hypoxia;HIF1α;BNIP3;Mouse follicular granulosa cells;Apoptosis mechanism

S814.1 < class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

B

1672-9692(2016)08-0018-06

2016-06-03

杜學(xué)海（1987-），男，碩士研究生，主要從事動物遺傳育種與繁殖相關(guān)工作。

劉紅林（1966-），男，教授，博導(dǎo)，主要從事動物育種學(xué)與動物發(fā)育生物學(xué)研究工作。