周賢珍，陳偉英，劉博，果德安，3，周毅生

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所/上海中藥現(xiàn)代化研究中心，上海 201203)

?

UPLC法測(cè)定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的含量

周賢珍1，陳偉英2，劉博2，果德安2，3，周毅生1

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所/上海中藥現(xiàn)代化研究中心，上海 201203)

目的 建立同時(shí)測(cè)定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的超高效液相(UPLC)法。方法 采用UPLC-PDA方法，色譜柱為ACQUICTY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流動(dòng)相為甲醇-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的冰醋酸水溶液，梯度洗脫，洗脫時(shí)間7.5 min，柱溫40 ℃，流量為0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果 巴西蘇木素和原蘇木素B均達(dá)到基線分離，質(zhì)量濃度在0.195～200 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，R2均為0.999 8；平均回收率分別為103.89%、99.83%，RSD為1.26%、1.87%。結(jié)論 相比HPLC法，UPLC法明顯提高了同時(shí)檢測(cè)蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析速度，并且靈敏度更高，可為以后建立蘇木質(zhì)量檢測(cè)方法新標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

超高效液相色譜法； 蘇木； 巴西蘇木素； 原蘇木素B； 含量測(cè)定

蘇木(SappanLignum)為豆科植物蘇木(CaesalpiniasappanL.)的干燥心材[1]，具有舒筋通絡(luò)、活血散結(jié)等功效[2]。巴西蘇木素和原蘇木素B是蘇木中2個(gè)重要的活性成分[3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，巴西蘇木素具有抗痤瘡、降血糖、血管舒張、保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌、抗感染[4-6]等藥理活性，原蘇木素B也具有較好的抗菌和抗腫瘤活性[7-9]。

2010年版《中國(guó)藥典》[10]蘇木項(xiàng)下含量測(cè)定采用的是HPLC技術(shù)，運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)達(dá)50 min，耗時(shí)較長(zhǎng)。而2015年版《中國(guó)藥典》[11]蘇木項(xiàng)下沒有含量測(cè)定相關(guān)說明，但在“高效液相色譜法”項(xiàng)下指出超高效液相色譜儀(UPLC)是適應(yīng)小粒徑(約2 μm)填充劑的新型高效液相色譜儀，具有耐高壓、進(jìn)樣量小、死體積低、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，有利于檢測(cè)效率和檢測(cè)質(zhì)量的提高。國(guó)家藥典委員會(huì)及許多學(xué)者[12]都開始致力于UPLC技術(shù)的推廣。本文首次將UPLC技術(shù)應(yīng)用于蘇木中有效成分的測(cè)定分析，建立一種簡(jiǎn)單高效的方法同時(shí)測(cè)定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為建立蘇木的質(zhì)量檢測(cè)方法新標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜(美國(guó)Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱 (美國(guó)Waters公司，2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；8510超聲波清洗器(美國(guó)Branson公司)；BT125D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；P/N Hei-VAP precision ML/G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司)；5418R冷凍式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

蘇木(康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：141102861，由上海藥物研究所上海中藥現(xiàn)代化研究中心果德安教授鑒定為豆科植物蘇木CaesalpiniasappanL.的干燥心材)；巴西蘇木素對(duì)照品(成都普思生物科技有限公司，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.2%，批號(hào)：PS000105，采用1H-NMR、13C-NMR和質(zhì)譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，并用高效液相色譜法測(cè)試對(duì)照品純度)；原蘇木素B對(duì)照品(成都普思生物科技有限公司，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.8%，批號(hào)：PS001125，采用1H-NMR、13C-NMR和質(zhì)譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，并用高效液相色譜法測(cè)試對(duì)照品純度)；乙腈(色譜級(jí)，默克股份有限公司)；冰醋酸(分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司)；水為超純水(默克密理博有限公司，ELIX超純水系統(tǒng))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性

色譜柱采用ACQUICTY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.2%的冰醋酸水溶液(B)，進(jìn)行梯度洗脫(0 min，5%A；0.5 min，20%A；3.4 min，28%A；7 min，29.5%A；7.5 min，5%A)；采用PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為40 ℃，樣品室溫為4 ℃，空白試劑為超純水。對(duì)照品與樣品的色譜圖見圖1?？梢?，空白試劑無干擾，巴西蘇木素和原蘇木素B保留時(shí)間分別為4.43、5.12 min。

0.0080.0040.000AU0.0080.0040.0000.300.200.100.00AUAU01234567t/min1221ABC

A.空白對(duì)照； B.蘇木水提物凍干粉； C.巴西蘇木素對(duì)照品和原蘇木素B對(duì)照品混合液； 1.巴西蘇木素; 2.原蘇木素B。

圖1 蘇木對(duì)照品及水提物的UPLC色譜圖

Figure 1 UPLC chromatogram of reference and water extract of Sappan Lignum

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取蘇木粗粉100 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，用800 mL超純水浸泡12 h。浸泡結(jié)束后，用電熱套加熱煮沸，采用索氏提取法，常壓回流提取3次，每次1 h，使液體均勻回流，將每次得到的提取液合并，采用旋轉(zhuǎn)蒸法儀將提取液濃縮至100 mL，參照文獻(xiàn)[14-15]中蘇木水提物處理方法，待濃縮液冷卻至室溫，置于-80 ℃冰箱中預(yù)凍，次日于凍干機(jī)中凍干。取少量?jī)龈煞郏芊Q定，以超純水為溶劑，嚴(yán)格按照1 mg干粉∶1 mL水的比例進(jìn)行配制，制成1 000 μg/mL的樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，所得濾液即供試品溶液。以該供試品為母液，超純水為溶劑，稀釋20倍，得到質(zhì)量濃度為50 μg/mL的供試品溶液。

2.2.2 巴西蘇木素對(duì)照品溶液的制備 取巴西蘇木素對(duì)照品適量，精密稱定，以超純水為溶劑，嚴(yán)格按照1 mg對(duì)照品∶1 mL水的比例進(jìn)行配制，制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，所得濾液即巴西蘇木素對(duì)照品溶液。以該溶液為母液，超純水為溶劑，稀釋250倍，得到質(zhì)量濃度為4 μg/mL的巴西蘇木素對(duì)照品溶液。

2.2.3 原蘇木素B對(duì)照品溶液的制備 取原蘇木素B對(duì)照品適量，精密稱定，以超純水為溶劑，嚴(yán)格按照1 mg對(duì)照品∶1 mL水的比例進(jìn)行配制，制成質(zhì)量濃度1 000 μg/mL的樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，所得濾液即原蘇木素B對(duì)照品溶液。以該溶液為母液，超純水為溶劑，稀釋400倍，得到質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的原蘇木素B對(duì)照品溶液。

2.3 線性關(guān)系的考察

分別取巴西蘇木素和原蘇木素B對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL)，以超純水為溶劑，稀釋2.5倍，得到質(zhì)量濃度均為400 μg/mL的巴西蘇木素對(duì)照品溶液及原蘇木素B對(duì)照品溶液。再采用等倍稀釋的方法，稀釋制備成質(zhì)量濃度均分別為400、100、25、12.5、3.13、1.56、0.78、0.39 μg/mL的系列巴西蘇木素對(duì)照品溶液和原蘇木素B對(duì)照品溶液。將以上質(zhì)量濃度相同的2份對(duì)照品溶液進(jìn)行等體積混合，最終得到質(zhì)量濃度分別為200、50、12.5、6.25、1.56、0.78、0.39、0.195 μg/mL的8份混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，并記錄相應(yīng)的色譜峰面積，進(jìn)樣量均為10 μL。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得巴西蘇木素的線性回歸方程為Y巴西蘇木素=65.092X-6 500.7(R2=0.999 8)，原蘇木素B的線性回歸方程為Y原蘇木素B=31.167X-1 933.6(R2=0.999 8)，表明巴西蘇木素和原蘇木素B在0.195～200 μg/mL范圍內(nèi)，均與各自的峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液(質(zhì)量濃度為50 μg/mL)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量均為10 μL，記錄相應(yīng)的色譜峰面積，結(jié)果計(jì)算得巴西蘇木素和原蘇木素B的峰面積RSD值分別為0.46%、0.78%，表明方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液(質(zhì)量濃度為50 μg/mL)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、3、6、12、24、36 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為10 μL，記錄相應(yīng)的色譜峰面積。結(jié)果計(jì)算得到巴西蘇木素和原蘇木素B的峰面積的RSD值分別為0.64%、1.73%，表明樣品中兩種成分巴西蘇木素和原蘇木素B在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批蘇木藥材，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備蘇木凍干粉，分6次精密稱定凍干粉適量，配制成質(zhì)量濃度50 μg/mL的供試品溶液6份。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量均為10 μL，記錄相應(yīng)的色譜峰面積，計(jì)算巴西蘇木素和原蘇木素B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.16%、5.67%，RSD值分別為3.18%、3.47%，表明方法重復(fù)性好。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱定已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蘇木水提液凍干粉6份，稀釋制備成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的供試品溶液。取以上干粉溶液1 000 μL，分別加入1 000 μL巴西蘇木素對(duì)照品溶液(4 μg/mL)及1 000 μL原蘇木素B對(duì)照品溶液(2.5 μg/mL)，得到供試品與2種對(duì)照品混合溶液(以各溶液濃度與體積的乘積計(jì)算含量，即每份樣品中，凍干粉質(zhì)量為50 μg，巴西蘇木素質(zhì)量為4 μg，原蘇木素B質(zhì)量為2.5 μg)。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量均為10 μL，記錄相應(yīng)的色譜峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果得到巴西蘇木素的平均回收率為103.89%，RSD為1.26%，原蘇木素B的平均回收率為99.83%，RSD為1.87%，見表1，表明樣品處理方法可靠。

2.8 樣品的測(cè)定

取“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液(質(zhì)量濃度50 μg/mL)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)的色譜峰面積，以峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果測(cè)得巴西蘇木素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.16%，RSD為3.18%(n=6)，原蘇木素B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.67%，RSD為3.47%(n=6)。從100 g蘇木粗粉中提取得到8.9 g蘇木凍干粉，通過換算可以得到巴西蘇木素和原蘇木素B在蘇木粗粉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.726%、0.505%。

表1 巴西蘇木素和原蘇木素B的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Recovery results of brazilin and protosappanin B (n=6)

成分樣品中的量/μg加入量/μg測(cè)得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%巴西蘇4.224.08.32102.48103.891.26木素4.244.08.40103.893.954.08.19105.843.994.08.19104.943.974.08.11103.614.114.08.21102.62原蘇木2.892.55.42101.1399.831.87素B2.932.55.3898.062.712.55.23100.582.742.55.1897.712.802.55.2899.032.942.55.50102.49

3 討論

[13]的蘇木水提工藝并進(jìn)行優(yōu)化，確定采用索氏提取法，8倍水量浸泡，提取3次，每次1 h的方法進(jìn)行提取，以制得的蘇木水提液凍干粉計(jì)算提取率，結(jié)果為8.9%，比文獻(xiàn)[13](提取2次，每次4.5 h，提取率為6.8%)提高了工作效率及提取率。由于水分的凍干并不影響樣品中化學(xué)成分的含量，因此本文將水提液制成了凍干粉，既提高了樣品的穩(wěn)定性又方便保存，且配樣操作簡(jiǎn)單，可以獲得特定濃度的供試品。本文結(jié)果中的巴西蘇木素和原蘇木素B在蘇木粗粉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于0.5%，符合2010年版《中國(guó)藥典》蘇木含量測(cè)定項(xiàng)下要求。

超高效液相色譜(UPLC)與高效液相色譜(HPLC)的基本分離原理是一致的，本文在文獻(xiàn)[14]的蘇木HPLC分離條件的基礎(chǔ)上，參照文獻(xiàn)[12,15]報(bào)道的HPLC和UPLC的轉(zhuǎn)換公式進(jìn)行條件摸索，得到了蘇木的UPLC分離條件，獲得了色譜柱類型、洗脫梯度、進(jìn)樣體積、流速等相關(guān)參數(shù)。應(yīng)用此條件，巴西蘇木素和原蘇木素B在7.5 min內(nèi)即可分離，色譜峰分離度為3.45。由此可見，以HPLC方法為基礎(chǔ)開發(fā)UPLC方法已經(jīng)在理論上得到豐富并具有可行性，對(duì)已開發(fā)HPLC方法的中藥的質(zhì)量檢測(cè)方法升級(jí)具有指導(dǎo)意義。

本文建立的蘇木樣品UPLC檢測(cè)方法精密度高，穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，并體現(xiàn)了UPLC在中藥分析上快速、高效、低污染的明顯優(yōu)勢(shì)，可為今后建立蘇木質(zhì)量檢測(cè)方法新標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

參考文獻(xiàn):

[1] 陳玉平,畢丹,屠鵬飛.蘇木的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)中藥雜志,2010,35(16):2068-2071.

[2] 趙煥新,王元書,劉愛芹,等.蘇木研究進(jìn)展[J].齊魯藥事,2007,26(2):102-105.

[3] 賴鎮(zhèn)源.蘇木化學(xué)成分抗腫瘤及其作用機(jī)理研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué),2008.

[4] NIRMAL N P,RAJPUT M S,PRASAD R G，et al. Brazilin fromCaesalpiniasappanheartwood and its pharmacological activities: a review[J]. Asian Pac J Trop Med，2015,8(6):421-430.[5] NIRMAL N P,PANICHAYUPAKARANANT P. Antioxidant,antibacterial,and anti-inflammatory activities of standardized brazilin-richCaesalpiniasappanextract[J]. Pharm Biol,2015,53(9):1-5.

[6] 王鑫,趙煥新,白虹.巴西蘇木素的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2013,41(3):164-168.

[7] ZUO Guoying,HAN Zongqi,HAN Jun，et al. Antimicrobial activity and synergy of antibiotics with two biphenyl compounds,protosappanins A and B fromSappanLignumagainst methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains[J]. J Pharm Pharmacol，2015,67(10):1439-1447.

[8] 楊喜花,任連生,趙莉莉,等.原蘇木素B對(duì)膀胱癌細(xì)胞BTT和T24的增殖抑制作用[J].中國(guó)藥物與臨床,2015,15(7): 937-938.

[9] 楊喜花,任連生,趙莉莉,等.原蘇木素B對(duì)腫瘤細(xì)胞BTT T24 Hela及SW480的抑制作用研究[J].中國(guó)藥物與臨床,2015,15(8):1083-1085.

[10] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:164.

[11] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2015年版四部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015,6:59.

[12] 高青,劉穎,宋彬彬,等.超高效液相色譜與高效液相色譜方法轉(zhuǎn)換及驗(yàn)證[J].藥物分析雜志,2016,36(7): 1279-1285.

[13] 郭榮輝.蘇木中藥效成分及提取工藝的研究[D].成都:四川大學(xué),2004.

[14] 陳雪敏,胡永鋼,李美萍,等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蘇木中的巴西蘇木素和原蘇木素B[J].分析試驗(yàn)室,2012(4):98-101.

[15] 李爭(zhēng)春,郭彩霞,白寶清，等.蘇木水提物化學(xué)組成分析及有效成分的純化結(jié)構(gòu)表征[J].中草藥,2014,45(8):1063-1067.

(責(zé)任編輯：陳翔)

Determination of brazilin and protosappanin B in Sappan Lignum by UPLC

ZHOU Xianzhen1，CHEN Weiying2，LIU Bo2，GUO De′an2，3， ZHOU Yisheng1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmacetuicalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.GuangdongProvincialAcademyofChineseMedicalSciences,The2ndAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 3.ChineseAcademyofSciences,ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ShanghaiResearchCenterforModernizationofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Objective To develop an UPLC method to determine brazilin and protosappanin B in aqueous extract ofSappanLignum. Method Brazilin and protosappanin B were analyzed by UPLC. An ACQUICTY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm) column was used with the mobile phase of methanol-water (0.2% glacial acetic acid) in gradient elution mode and it cost 7.5 minutes throughout the general courses. The column temperature was 40 ℃ with a flow rate of 0.3 mL/min and the detective wavelength was 280 nm.Each sample was injected by 10 μL. Results The results showed that the peaks of brazilin and protosappanin B were separated commendably at the same time. The chromatographic peak areas also had good linearity in a beamy range of 0.195-200 μg/mL (R2=0.999 8). The average recoveries of brazilin and protosappanin B were 103.89% (RSD=1.26%) and 99.83% (RSD=1.87%),respectively. Conclusions Compared to HPLC,it apparently promoted efficiency by UPLC in analyzing brazilin and protosappanin B ofSappanLignumwith higher sensitivity,which could provide a reference for the establishment of new determination standards ofSappanLignum.

UPLC;SappanLignum; brazilin; protosappanin B; determination

2016-09-28

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81202398)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B010102006,2014A020221035,2015A020211025)；廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究專項(xiàng)項(xiàng)目(YN2014ZHR209,YN2015MS03)；國(guó)家中醫(yī)藥管理局臨床基地科研專項(xiàng)項(xiàng)目(JDZX2015207)

周賢珍(1991—)，女，2014級(jí)碩士研究生，Email:1159391257@qq.com；通信作者：果德安(1962—)，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量控制及體內(nèi)代謝研究，021-50271516,021-50272789，Email:daguo@simm.ac.cn；周毅生(1957—)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事藥物新劑型及新技術(shù)研究，020-39352168，Email: yishzhou@aliyun.com。

時(shí)間：2016-12-05 11:44

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161205.1144.001.html

R927.1

A

1006-8783(2016)06-0729-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016092803