黃海庭++林栩++尤燕舞++湯春榮++古賢君++黃美英++覃幼玲++譚軍華++黃非凡

【摘要】目的探討瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）高表達對轉(zhuǎn)化生長因子β1 （TGFβ1）干預(yù)下體外培養(yǎng)小鼠腎足細胞nephrin、desmin、caspase9表達及細胞凋亡的影響。

方法用脂質(zhì)體Lip2000將針對小鼠TRPC6的基因真核表達載體pEX3TRPC6轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠足細胞，48小時后Western blot檢測轉(zhuǎn)染后TRPC6蛋白表達變化。將足細胞分為4組：正常對照組，TGFβ1干預(yù)組，TGFβ1+pEX3NC組（空載體組），TGFβ1+pEX3TRPC6組（TRPC6高表達組），干預(yù)48小時后用western blot和real time PCR 檢測caspase9、desmin、nephrin蛋白和mRNA表達水平，用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率，DAPI染色觀察凋亡細胞核形態(tài)學(xué)變化。

結(jié)果轉(zhuǎn)染48 小時后TRPC6高表達組TRPC6蛋白水平較正常對照組明顯升高（P<0.01），空載體組TRPC6蛋白表達水平無明顯變化；TGFβ1干預(yù)48小時后caspase9、desmin蛋白和mRNA表達水平顯著升高（P<0.05），nephrin蛋白和mRNA表達水平明顯下降（P<0.01），使TRPC6高表達后上述變化更明顯（P<0.05）；TGFβ1干預(yù)后足細胞凋亡增多并出現(xiàn)典型凋亡細胞核形態(tài)學(xué)改變，TGFβ1干預(yù)組足細胞凋亡率為（12.30±0.81）%，TRPC6高表達組凋亡率為（21.26±1.16）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），空載體組細胞凋亡率與TGFβ1干預(yù)組比較無明顯差異。

結(jié)論TRPC6在 TGFβ1誘導(dǎo)足細胞損傷中發(fā)揮重要作用，其機制之一可能通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)足細胞凋亡，減少nephrin表達，增加desmin表達來實現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】足細胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1；凋亡；結(jié)蛋白；nephrin；caspase9

中圖分類號：R692文獻標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.04.003

瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）是新近發(fā)現(xiàn)的聯(lián)系足細胞裂孔隔膜與細胞骨架的重要分子，通過對人類多種獲得性蛋白尿性腎小球疾病的研究則表明TRPC6表達升高是足細胞損傷的重要因素[1]，但TRPC6在足細胞損傷中的具體機制目前尚未完全明確。轉(zhuǎn)化生長因子β1 （TGFβ1）具有誘導(dǎo)足細胞損傷的作用，有研究表明TRPC6可能是TGFβ1下游作用因子之一[2～3]，但TRPC6是否參與TGFβ1誘導(dǎo)足細胞的損傷過程，目前尚未檢索到相關(guān)研究。本研究通過基因過表達技術(shù)，誘導(dǎo)足細胞TRPC6高表達，觀察TRPC6高表達對TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡及nephrin、desmin、caspase9表達的影響，以期為足細胞損傷的防治提供新靶點。

1材料與方法

1.1實驗細胞和試劑

腎小球足細胞株（MPC5）購于上海復(fù)旦大學(xué)細胞中心，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清[?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司]，重組人TGFβ1（ProSpecTany）、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物工程研究所）、RNA提取試劑盒（愛思進 AxyPrep）、SuperQuickRT MasterMix（北京康為世紀生物科技有限公司）、UltraSYBR MixturePCR（北京康為世紀生物科技有限公司）、TRPC6、nephrin、desmin、GAPDH一抗及HRP標(biāo)記的二抗（美國Abcam），DAPI溶液（北京索萊寶），pEX3NC、pEX3TRPC6質(zhì)粒（上海吉瑪公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋），Lipofeetamine2000（Invitrogen公司）。

1.2足細胞培養(yǎng)

腎小球足細胞培養(yǎng)參照文獻[4]，并稍做修改，細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3細胞轉(zhuǎn)染及分組

實驗前一天，接種1×104細胞至24孔板中，加入500 μL含血清培養(yǎng)液，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至65%融合。分別將pEX3NC、 pEX3TRPC6與脂質(zhì)體Lipofeetamine2000混合（1∶4），室溫靜置30分鐘后加入24孔板，以無血清的1640培養(yǎng)液孵育6小時后改用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24及48小時后通過倒置熒光顯微鏡觀察足細胞中GFP的表達，測定轉(zhuǎn)染效率（轉(zhuǎn)染細胞率=熒光蛋白表達細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%）；48小時后應(yīng)用Western blot檢測TRPC6蛋白的表達。將細胞分為4組：正常對照組，TGFβ1干預(yù)組，TGFβ1干預(yù)+pEX3NC，TGFβ1干預(yù)+pEX3TRPC6組。在后3組細胞中加入TGFβ1，使其終濃度為12 ng/ml，干預(yù)48小時后收集各組細胞分別進行檢測，實驗重復(fù)3次。

1.4real time RTPCR檢測caspase9、nephrin、desmin mRNA表達

模型建立后按 RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA。用紫外分光光度計測 RNA 的濃度并用電泳測得RNA的完整性和降解情況。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求加入相應(yīng)的試劑，放入PTC200儀進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物均由上海生物工程公司生產(chǎn)，引物序列見表1。反應(yīng)總體系20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，61.7℃延伸58 s，循環(huán)40次。同時設(shè)熔解曲線55℃～95℃ 10 s共81個循環(huán)。每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照和陰性對照，每個樣本重復(fù)3次，取其平均值為樣本Ct值。目標(biāo)基因相對于內(nèi)參基因進行相對定量，采用2△△CT法進行mRNA相對表達量的比較。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因特異性。

去除24孔板中的培養(yǎng)液，每孔細胞中加入50 μL IP（IP使用前與PMSF混勻，使PMSF終濃度為1 mmol/L）充分裂解細胞，用槍頭上下吹打細胞10～20次后收集細胞至1.5 ml離心管中，14 000 g離心5 min，取上清液至200 μL離心管中得細胞總蛋白質(zhì)，用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。將提取的總蛋白溶于5%SDS，100℃，5分鐘熱變性。每孔加50 μg總蛋白進行SDSPAGE凝膠電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜2.5 h。3%BSA室溫封閉1小時，加入按適當(dāng)比例稀釋的一抗（兔抗TRPC6多克隆抗體，稀釋度1∶300；兔抗caspase9，稀釋度1∶300；兔抗nephrin，稀釋度1∶200；兔抗desmin，稀釋度1∶500；兔抗GAPDH，稀釋度1∶500），4℃冰箱搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，加入羊抗兔多克隆二抗，稀釋度1∶5000，室溫孵育1小時，TBST洗膜3次，20 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，曝光、顯影、定影，掃描條帶，利用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶的灰度值的比值表示其相對含量，每組實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

各組細胞先用預(yù)冷的PBS洗2次，然后用胰酶消化，1.5 ml離心管收集各組細胞，800 g離心5 min分鐘，去上清，用1 ml PBS重懸細胞，再次離心去上清，重復(fù)兩次以去除胰酶中的ETDA。最后將細胞重懸于150 μL結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，分別加入2.5 μL Annexin V和0.5 μL 100 μg/ml的PI溶液，室溫避光孵育15 min。上機檢測前補加200 μL結(jié)合液，輕輕混勻。立即將染色細胞進行流式分析，每組實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.7DAPI熒光染色觀察足細胞凋亡的核形態(tài)學(xué)變化

各組細胞干預(yù)72 h后，取10 μg 1 mg/ml的DAPI水溶液加到1 ml PBS中，配制成10 μg/ml的DAPI溶液，每孔細胞加入50 μL的10 μg/ml DAPI溶液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞15 min，然后置于熒光顯微鏡360 nm激發(fā)波長下觀察，取圖。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料先進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布及方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用q檢驗（NewmanKeuls法），檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果

2.1足細胞形態(tài)學(xué)觀察及特異性抗原nephrin檢測

正常足細胞呈多邊形或梭形，細胞輪廓清晰，自細胞體伸出少量樹枝樣突起（圖1A）。間接免疫細胞化學(xué)染色：nephrin分布于胞膜、核周及細胞質(zhì)（圖1B）。real time RTPCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示該細胞系表達nephrin（圖1C），nephrin是足細胞特異性分子，因此可以認為實驗用細胞系來源于足細胞。

A：正常足細胞形態(tài)；B：免疫熒光染色nephrin在足細胞上的表達、分布；C：nephrin熒光定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳。

2.2TRPC6轉(zhuǎn)染效率

將pEX3NC、pEX3TRPC6轉(zhuǎn)染足細胞48小時后，Westernblot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEX3TRPC6（高表達組）TRPC6蛋白明顯升高（P<0.05），傳染pEX3NC（空載體組）對TRPC6蛋白表達無明顯影響（P>0.05）。正常對照組、空載體組、高表達組TRPC6/GAPDH蛋白灰度值之比分別為（0.49±0.02）、（0.50±0.001）、（1.01±0.04）。見圖2A、B。

A：westernblot蛋白條帶原始圖；B：目的蛋白表達相對灰度值之比，與正常組相比，a：P<0.01，與空載體組相比，b：P<0.01。

2.3TRPC6高表達對TGFβ1干預(yù)下足細胞nephrin、caspase9、desmin mRNA表達的影響

TGFβ1干預(yù)48小時后足細胞nephrin mRNA表達水平明顯降低（P<0.05），caspase9、desmin mRNA表達水平明顯升高（P<0.05），TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3TRPC6（TRPC6高表達） 組上述變化更加明顯 （P<0.05）。TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3NC （空載體）組與TGFβ1干預(yù)組nephrin、caspase9、desmin mRNA表達水平無明顯差異。見表2。

2.4TRPC6高表達對TGFβ1干預(yù)下足細胞nephrin、caspase9、desmin 蛋白表達的影響

TGFβ1刺激48小時后足細胞nephrin 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），caspase9、desmin 蛋白表達水平明顯升高（P<0.01），TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3TRPC6（TRPC6高表達組）上述變化更加明顯 （P<0.05）。TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3NC（空載體組）與TGFβ1干預(yù)組nephrin、caspase9、desmin 蛋白表達水平無明顯差異。見圖3。

2.5DAPI染色結(jié)果

細胞核形態(tài)學(xué)改變是細胞凋亡的重要鑒別依據(jù)。在熒光顯微鏡下（圖4A），可觀察到正常足細胞的染色質(zhì)疏松，熒光強度相對較弱，細胞核大小一致，形態(tài)規(guī)則（圖4A）； 細胞發(fā)生凋亡時染色質(zhì)濃縮，熒光強度增強，一些細胞核碎裂，呈現(xiàn)大小不一的熒光斑塊，即“凋亡小體”（圖4B）； 各組細胞經(jīng)DAPI染色后均可見典型細胞凋亡的細胞核形態(tài)學(xué)改變，但各組細胞凋亡細胞數(shù)明顯不一（圖4C～F）。

A：western blot 蛋白條帶原始；B：目的蛋白表達相對灰度值之比：與正常組相比，a：P<0.01；與TGFβ1干預(yù)組相比，b：P<0.01。

A，B（×20倍）：箭頭表示斷裂的染色質(zhì)及濃縮的細胞核，三角形表示正常細胞核；A：正常足細胞細胞核形態(tài)，B：TGFβ1誘導(dǎo)足細胞凋亡的細胞核形態(tài)。C、D、E、F（×10倍）：各組細胞核形態(tài)變化；C：正常對照組，D：TGFβ1干預(yù)組，E：TGFβ1干預(yù)+高表達組，F(xiàn)：TGFβ1干預(yù)+高空載體組。

2.6TRPC6高表達對TGFβ1誘導(dǎo)下足細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示正常對照組足細胞凋亡率為（1.34±0.15）%，應(yīng)用TGFβ1處理48 小時后凋亡率明顯升高，其凋亡率為（12.30±0.81）%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而TGFβ1干預(yù)+TRPC6高表達組凋亡率為（21.26±1.16）%，明顯高于TGFβ1干預(yù)組（P<0.01），轉(zhuǎn)染空載體組細胞凋亡率為（13.20±1.25）%，與TGFβ1干預(yù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖5A～D、表3。

A：正常組；B：TGFβ1干預(yù)組；C：TGFβ1干預(yù)+高表達組；D：TGFβ1干預(yù) + 空載體組

3討論

瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（transient receptor potential channel6，TRPC6）作為瞬時受體電位超家族中的一員，是一種非選擇性的陽離子通道。TRPC6是2005年Winn研究小組通過對家族性遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥研究所發(fā)現(xiàn)，隨后免疫共沉淀技術(shù)顯示TRPC6和podocin、nephrin共表達，且與這些蛋白之間有相互作用，TRPC6參與構(gòu)成裂孔隔膜信號復(fù)合體[5]， TRPC6的發(fā)現(xiàn)將足細胞裂孔隔膜蛋白與離子通道聯(lián)系起來，拓寬了足細胞分子網(wǎng)絡(luò)，為復(fù)雜腎臟疾病的研究提供新的思路。但目前對于TRPC6的研究尚處于起步階段，具體作用機制尚未完全闡明。

TRPC6基因突變可以導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化，在高糖[6]、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)[7]、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)[8]的足細胞損傷過程中，TRPC6高表達可通過誘導(dǎo)細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加，引起足細胞骨架分布紊亂、裂孔隔膜蛋白表達異常。在糖尿病腎病[9]、膜性腎病[10]等多種人類獲得性蛋白尿性腎小球疾病中其表達量與蛋白尿程度呈正比。TGFβ1是公認的致腎臟纖維化細胞因子，具有誘導(dǎo)足細胞損傷的作用，但在此過程中TRPC6是否參與其中目前尚無研究。鑒于此，本研究通過轉(zhuǎn)染TRPC6真核表達載體至足細胞使其高表達TRPC6，觀察TRPC6高表達對TGFβ1干預(yù)下足細胞損傷的影響。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)，在TGFβ1作用下，nephrin表達明顯下降，desmin表達明顯增多，基因誘導(dǎo) TRPC6高表達后nephrin下降更加明顯，desmin表達升高更加明顯，這表明TRPC6高表達能促進TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞損傷過程，與上述研究結(jié)果相似。

足細胞丟失是導(dǎo)致腎小球硬化的關(guān)鍵因素，而凋亡則是導(dǎo)致足細胞丟失的重要原因之一，深入探討足細胞凋亡機制對延緩腎小球硬化進程具有重要意義。TGFβ1是一種多功能細胞因子，參與細胞增殖分化、凋亡、血管形成、細胞外基質(zhì)形成等多種生物學(xué)事件[11]。在TGF損傷足細胞的多種機制中，促凋亡是其重要的環(huán)節(jié)，但TRPC6與TGF誘導(dǎo)足細胞凋亡的關(guān)系目前國內(nèi)外尚未檢索到相關(guān)報道。因此，本研究中我們首先通過DAPI染色觀察足細胞核形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組細胞經(jīng)DAPI染色后均可見典型細胞凋亡的細胞核形態(tài)學(xué)改變，TRPC6高表達后細胞凋亡數(shù)目明顯增多。由此可初步判斷TRPC6高表達參與TGF誘導(dǎo)的足細胞凋亡過程。為使實驗結(jié)果更有說服力，我們又通過流式細胞檢測各組細胞的凋亡率。結(jié)果顯示，TGFβ1作用48小時后足細胞凋亡率由（1.34±0.15）%增高至（1230±0.81）%，而使TRPC6高表達后凋亡率升高至（21.26±1.16）%，轉(zhuǎn)染空載體組細胞凋亡率較TGFβ1干預(yù)組無明顯差異。上述實驗結(jié)果說明TRPC6高表達參與了TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡過程。

既往研究發(fā)現(xiàn)，線粒體凋亡途徑在TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Das等[12]通過體外構(gòu)建TGFβ1誘導(dǎo)條件永生化小鼠足細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)TGFβ1通過SmadERK1/2mTORC1軸提高Nox4的表達，進而使ROS產(chǎn)生增多、線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致足細胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶家族（caspase） 是一類凋亡特異性蛋白酶，在細胞凋亡過程中處于中心地位，其中caspase9是線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源凋亡途徑中首先被激活的因子[13]。為了進一步研究TRPC6在TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡中的可能作用機制，本實驗觀察了TRPC6高表達對TGFβ1干預(yù)下足細胞caspase9表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFβ1作用48小時后足細胞caspase9表達水平明顯上調(diào)，說明線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑確實參與了TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡過程，而當(dāng)使TRPC6高表達后caspase9在基因及蛋白水平均明顯升高，這說明TRPC6至少部分通過調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑caspase9的表達進而增加TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡。

綜上所述，我們的研究表明TRPC6是TGF誘導(dǎo)足細胞損傷過程中的重要分子，通過加深TGFβ1誘導(dǎo)的足細胞凋亡程度，減少nephrin表達，增加desmin表達可能是其作用機制之一。阻斷病理狀況下TRPC6的高表達或許是治療蛋白尿性腎臟疾病的新策略，我們將在后續(xù)試驗中進一步探討。

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（收稿日期：2016-04-24修回日期：2016-08-06）

（編輯：梁明佩）