李曉秀，王明玖*，黃 帆，周 瑩

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

高加索三葉草、白三葉及其4個雜交后代株系的核型比較

李曉秀1，王明玖1*，黃 帆2，周 瑩1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

為了培育優(yōu)良三葉草品種，利用高加索三葉草和白三葉進(jìn)行人工雜交，得到的F1代植株移植到田間形成了多個株系。本試驗(yàn)選用了4個結(jié)實(shí)率較高的F1代株系(分別命名為4-1、1-10、2-4和3-7)和父母本，利用常規(guī)染色體壓片法，對其種子發(fā)芽后進(jìn)行核型研究。雜交后代的染色體數(shù)均為2n=6x=48，與母本高加索三葉草的染色體數(shù)相同；雜交后代與親本的核型類型都為1A型，但核型組成存在一定的差異；核型不對稱性由高到低依次為白三葉>4-1>1-10>2-4>3-7>高加索三葉草。試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交后代株系形態(tài)上的差異，不是由染色體數(shù)目決定的，而是由核型的不同造成的。

高加索三葉草；白三葉；雜交F1代；核型分析

三葉草屬(TrifoliumL.)植物具有極高的利用價值，不僅可以固氮，提高土壤肥力，減少土壤侵蝕〔1〕，而且其蛋白質(zhì)和可利用碳水化合物含量豐富，是適口性良好的牧草之一〔2〕。但在內(nèi)蒙古地區(qū)，由于氣候條件惡劣，目前僅有高加索三葉草能夠完全越冬、度夏，進(jìn)行大范圍的栽培利用。因此，培育更多適宜內(nèi)蒙古等北方地區(qū)氣候條件并具有優(yōu)良性狀的三葉草新品種是牧草育種工作中的一項(xiàng)重要任務(wù)。本研究根據(jù)高加索三葉草(T.ambiguumBieb.)耐寒性和耐旱性強(qiáng)，生產(chǎn)力旺盛的特點(diǎn)〔3〕，將其與固氮能力強(qiáng)的白三葉(T.repensL.)進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交〔4〕，期望獲得兼有雙親優(yōu)良性狀，即既能固氮、抗性又強(qiáng)的雜交后代。但由于兩親本三葉草的染色體倍性不同，所以其雜交后代不育。經(jīng)過多年試驗(yàn)研究，采用雜交胚離體培養(yǎng)方法獲得了雜交 F1代植株，并將其移栽于試驗(yàn)地。通過對F1代植株進(jìn)行鑒定，證明F1代植株花粉高度不育，染色體數(shù)為2n=5x=40，為五倍體植株〔5〕。然而，多數(shù)F1代植株在試驗(yàn)地內(nèi)經(jīng)過兩年自然生長，在第三年產(chǎn)生了結(jié)實(shí)現(xiàn)象〔6〕。這些植株在田間形成的多個株系，在形態(tài)特征方面與親本差別較大。為了探索不育植株自然恢復(fù)育性的機(jī)理，解釋形態(tài)差異的原因，本實(shí)驗(yàn)選取部分結(jié)實(shí)率較高的F1代株系及父母本，用其種子進(jìn)行發(fā)芽并做根尖染色體鑒定與核型分析比較，為雜交后代的進(jìn)一步選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為高加索三葉草(母本)、白三葉(父本)及其4個雜交 F1代株系(分別命名為1-10、2-4、3-7和4-1)的種子，均采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草實(shí)驗(yàn)地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 染色體制片

選取飽滿的供試材料種子放于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，通過常規(guī)培養(yǎng)方式發(fā)芽。在上午8∶00～11∶00，當(dāng)芽長為1～1.5cm左右時，取下其根尖放入裝有蒸餾水的小玻璃瓶中，并放置在1～4℃冰箱中進(jìn)行低溫預(yù)處理，處理時間為24h。將預(yù)處理后的根尖用蒸餾水沖洗2～3 次，放入卡諾固定液(體積比無水酒精:冰醋酸=3∶1)中固定6～24h。固定好的材料用95%的酒精沖洗2次后存于70%的酒精中，放入 4 ℃冰箱中備用。制片時，將固定好的材料取出，用蒸餾水沖洗干凈，放入1.0 mol/L鹽酸中，60℃恒溫水浴鍋中解離10～12 min。取出根尖用蒸餾水沖洗干凈，并在蒸餾水中浸泡10 min。每次取出1個處理好的材料放在載玻片上，切取頂端分生區(qū)1～2 mm，滴加卡寶品紅染色液染色8～10 min后壓片，做鏡檢，選擇染色體形態(tài)清晰、分散良好的片子進(jìn)行顯微拍照。

1.2.2 染色體核型分析

對每份供試材料觀察30個以上分裂相良好的細(xì)胞，統(tǒng)計并確定該材料的染色體數(shù)目，選擇顯像效果最佳的染色體圖像測量其染色體參數(shù)，得到核型數(shù)據(jù)。核型分析參照李懋學(xué)、陳瑞陽〔7〕的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行；核型公式參照Levan等〔8〕的染色體命名規(guī)則，按著絲點(diǎn)位置描述；核型不對稱系數(shù)按照Arano〔9〕的方法計算；核型類型根據(jù)Stebbins〔10〕的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分；用Kuo〔11〕的方法計算染色體的相對長度系數(shù)(IRL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體核型組成

經(jīng)制片處理，所有供試材料均獲得了清晰的染色體圖像，并對它們的染色體核型進(jìn)行了分析比較。其中高加索三葉草和白三葉的染色體數(shù)目分別為2n=6x=48和2n=4x=32；4個雜交后代株系的染色體數(shù)目均為2n=6x=48。各處理材料的染色體核型具有一定的差異(表1)，通過染色體形態(tài)圖與染色體核型圖(圖1)可以直觀地反映出這種差異。

表1 高加索三葉草、白三葉及其4個雜交后代株系的核型比較Table 1 Karyotype comparison among Trifolium ambiguum Bieb., Trifolium repens L. and 4 hybrids

雖然4個雜交后代株系的染色體數(shù)目都與母本高加索三葉草相同，但是其核型與染色體相對長度組成卻存在差異。

親本及各雜交后代株系的染色體絕大多數(shù)為中部著絲點(diǎn)(m)染色體，少數(shù)為近中部著絲點(diǎn)(sm)染色體，但各材料所含中部著絲點(diǎn)染色體的數(shù)量有所不同。其中，高加索三葉草第7和8對染色體、白三葉第1、13、14 和16對染色體、雜交后代株系2-4第19對染色體、3-7第9對染色體和4-1第6、11、15、17、20和21對染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體，其余均為中部著絲點(diǎn)染色體。試驗(yàn)還觀察到4-1第2對染色體的短臂上具有隨體，有明顯的次縊痕。親本和4個雜交后代株系的染色體長度比值在 1.50～1.81 之間，沒有臂比大于 2 的染色體，按Stebbins的核型分類標(biāo)準(zhǔn)，核型都為1A型，對稱性均較高，屬于較原始的種類。

所有試驗(yàn)材料的染色體大部分是中長染色體(M2)和中短染色體(M1)，屬于較為原始的類型，但每個材料染色體相對長度組成都存在著不同程度的差異。高加索三葉草和白三葉的染色體全部由中長和中短染色體組成，沒有長染色體(L)和短染色體(S)，相對長度組成分別為24M2+24M1和16M2+16M1。1-10由4種長度類型的染色體組成，相對長度組成為2L+20M2+24M1+2S；2-4與4-1均包含1對長染色體，相對長度組成分別為2L+20M2+26M1和2L+18M2+28M1；3-7有1對短染色體，相對長度組成為22M2+24M1+2S。

(1. 高加索三葉草；2. 白三葉；3. 1-10；4. 2-4；3. 3-7；4. 4-1)

圖1 高加索三葉草、白三葉及其4個雜交后代株系的染色體形態(tài)和核型圖

Fig.1 Chromosome numbers and karyotype idiograms ofTrifoliumambiguumBieb.,TrifoliumrepensL. and 4 hybrid strains

2.2 染色體核型進(jìn)化趨勢

染色體長度比、平均臂比和核型不對稱系數(shù)反映了核型的不對稱性。核型不對稱性越高，物種進(jìn)化程度越高。以平均臂比為橫坐標(biāo)，以染色體長度比和核型不對稱系數(shù)為縱坐標(biāo)，可以制作進(jìn)化趨勢圖(圖2)。圖中越偏向右上方的材料，其核型不對稱性越高，進(jìn)化程度也越高?？梢钥闯鰞煞N三葉草及其4個雜交后代株系核型的不對稱性由大到小依次為白三葉>4-1>1-10>2-4>3-7>高加索三葉草。

圖2 高加索三葉草、白三葉及其4個雜交后代株系的核型進(jìn)化趨勢

3 討論

染色體的核型參數(shù)代表了物種的染色體特征，一個物種的染色體核型是相對穩(wěn)定的，但物種在長期的進(jìn)化過程中，其染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目會發(fā)生變化，進(jìn)而帶來核型的改變〔12〕。染色體核型數(shù)據(jù)反映了染色體的整體特征，研究和比較染色體核型有助于對物種進(jìn)化程度和親緣關(guān)系進(jìn)行判斷和分析〔13〕。本試驗(yàn)中得到的高加索三葉草核型公式與殷秀杰〔14〕的結(jié)果一致，白三葉的核型公式與黃帆〔5〕的結(jié)果一致。說明本次試驗(yàn)的準(zhǔn)確率較高，能夠得到較可靠的分析結(jié)果，因?yàn)槭褂玫氖窍嗤脑囼?yàn)材料。4個雜交后代株系的染色體數(shù)目均與母本高加索三葉草相同，但核型公式與親本均有差異，其中 4-1差異最大。本研究中6個材料的核型不對稱性由高到低依次為白三葉>4-1>1-10>2-4>3-7>高加索三葉草。根據(jù)Stebbins的觀點(diǎn)，高等植物核型進(jìn)化是由對稱向不對稱方向發(fā)展，原始的植物種往往具有較對稱的核型〔15-17〕。因此，高加索三葉草是較白三葉更為原始的種，4個雜交后代株系的進(jìn)化程度介于兩親本之間且均存在差異，可初步判定雜交后代株系結(jié)合了雙親的性狀，并且各株系發(fā)生了性狀分離。由此可見，目前觀測到的雜交后代株系形態(tài)上的差異，不是由染色體數(shù)目決定的，而是由核型的不同造成的。在4個雜交后代株系中，4-1核型表現(xiàn)出的差異最大，進(jìn)化程度也最高，并且在其第2對染色體上觀察到有隨體存在。有學(xué)者曾提出〔18〕，隨體染色體的數(shù)目和形態(tài)具有種的特異性，是區(qū)分不同種的一個重要特征。因此，4-1株系可能產(chǎn)生了新的性狀，在以后的選育工作中要將其作為重點(diǎn)株系進(jìn)行觀測，希望發(fā)現(xiàn)不同利用價值的新性狀，為三葉草的育種與利用提供新的資源。

4個雜交后代株系的染色體數(shù)目均與母本高加索三葉草的染色體數(shù)目一致，為2n=48。而當(dāng)年采用雜交胚離體培養(yǎng)的方法獲得的雜交 F1代植株其染色體數(shù)為2n=5x=40，為不育植株。雜交F1代植株在試驗(yàn)地內(nèi)經(jīng)過兩年自然生長后，從不育植株變?yōu)榭捎仓?，且其后代的染色體數(shù)目為2n=48。鐘聲〔19〕在對二倍體鴨茅與四倍體鴨茅進(jìn)行雜交試驗(yàn)時，得到了高度不育的三倍體鴨茅。對三倍體植株進(jìn)行觀測時發(fā)現(xiàn)，盡管其高度不育，但仍然獲得了少量種子。對5個三倍體的后代做染色倍性觀察，發(fā)現(xiàn)其后代中兩個單株為5倍體，1個為四倍體，另兩個為混倍體。馮海生〔20〕在探討小麥遠(yuǎn)緣雜交F1代自然結(jié)實(shí)的原因時提到，環(huán)境條件尤其是溫度的影響，可促使植物自然加倍，形成雙二倍體，并結(jié)實(shí)。由此可見，不育植株自然結(jié)實(shí)的情況不僅僅存在于本研究中，其發(fā)生的原因可能是由于自然條件和營養(yǎng)條件的作用，使其趨向穩(wěn)定，變?yōu)榭捎仓辏灰灿锌赡苁瞧渑c相鄰雜種植株或父母本植株通過異花授粉所得到的，其真實(shí)原因還需結(jié)合其他方法進(jìn)一步分析研究。

4 結(jié)論

(1)高加索三葉草和白三葉的核型公式分別為2n=48=44m+4sm和2n=32=24m+8sm。二者4個雜交后代株系(4-1、1-10、2-4和3-7)的種子染色體數(shù)目均與母本高加索三葉草的染色體數(shù)目一致，為2n=48。其中，4-1的核型公式為2n=48=36m+12sm；1-10的核型公式為2n=48=48m；2-4的核型公式為2n=48=46m+2sm；3-7的核型公式為2n=48=46m+2sm。

(2)親本和4個雜交后代株系的核型類型都為1A型，屬于較原始的種類。

(3)進(jìn)化程度由高到低依次為白三葉>4-1>1-10>2-4>3-7>高加索三葉草。雜交后代株系形態(tài)學(xué)上的差異，主要是核型差異造成。

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Karyotype Comparison amongTrifoliumambiguumBieb.,TrifoliumrepensL. and Their Four Hybrids

LI Xiao-xiu1, WANG Ming-jiu1*, HUANG Fan2, ZHOU Ying1

(1.College of Grassland Resources and Environment，Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010019,China;2.Grassland Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Hohhot 010010, China)

In order to cultivate fine suitableTrifoliumvariety,TrifoliumambiguumBieb. andTrifoliumrepensL. were crossbred to get hybrid F1. The F1generations were transplanted into the field for testing and many strains that showed different morphological characteristics formed. Four F1strains with higher seeding rate named 4-1, 1-10, 2-4 and 3-7 along with their parents were chosen to observe the karyotype of the radicle tip cell chromosomes from germinated seeds by using the conventional chromosome compression method. The results showed that the numbers of chromosomes of four hybrids were 2n=6x=48, equaling to those of female parentTrifoliumambiguumBieb.. The karyotypes of four hybrids and parents all belonged to 1A, but their structures were different. The degree of karyotype asymmetry was as follows:TrifoliumrepensL.>4-1>1-10>2-4>3-7>TrifoliumambiguumBieb.. This indicated that the morphological difference of the hybrid F1was decided by the karyotype instead of the number of the chromosomes.

TrifoliumambiguumBieb.;TrifoliumrepensL.; hybrid F1; karyotype analysis

S541+.2

A

2095—5952(2016)04—0043—06

2016-11-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260577)。

李曉秀(1989-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)椴莸厣鷳B(tài)。E- mail:494716291@qq.com

[*通訊作者]王明玖(1961-)，男，教授，博士生導(dǎo)師。 E- mail: wangmj_0540@163.com