高效降酚真菌的分離、鑒定及特性研究

薛智權(quán)，王向英，李 宏，呂建華

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

高效降酚真菌的分離、鑒定及特性研究

薛智權(quán)，王向英，李 宏，呂建華

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

苯酚和酚類化合物是環(huán)境中常見的有毒污染物。利用富集、篩選和純化的方法，從山西省太谷縣圣源污水處理廠曝氣池中分離得到一株能以苯酚為唯一碳源生長(zhǎng)的苯酚降解真菌GY8。采用rDNA ITS區(qū)序列分析，鑒定該菌株為熱帶假絲酵母屬。該菌株在48 h內(nèi)對(duì)1.0 g/L苯酚降解率接近100%，在以苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)條件下能夠耐受1.8 g/L的苯酚。同時(shí)，通過設(shè)定不同pH值、不同接種量、不同溶解氧條件，對(duì)該菌降解特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，該菌最適pH值為6.5，隨著接種量的增加降解能力增強(qiáng)，5%接種量可使1.0 g/L苯酚在24 h內(nèi)降解率達(dá)90%以上，有氧條件更利于苯酚的降解。研究表明，熱帶假絲酵母GY8對(duì)處理含酚廢水具有良好的應(yīng)用前景。

苯酚和酚類化合物；生物降解；廢水處理

環(huán)境污染是當(dāng)今文明社會(huì)面臨的主要挑戰(zhàn)之一。苯酚及其同源物是最常見的有機(jī)污染物之一[1]。環(huán)境中的苯酚來源于自然和工業(yè)。天然酚主要來源于森林火災(zāi)，城區(qū)或郊區(qū)被用作粘合劑的瀝青及自然衰變的木質(zhì)纖維材料等的自然流失物。而煉油廠、化工、石化、制藥、冶金、農(nóng)藥產(chǎn)品、油漆和紡織品等行業(yè)是酚醛樹脂、雙酚A、烷基酚等工業(yè)酚的主要來源[2-3]。

苯酚的毒性已被廣泛記載，它們對(duì)人類和環(huán)境的災(zāi)難性影響已備受關(guān)注。幾乎所有的酚類化合物對(duì)大多數(shù)微生物、植物、魚類和動(dòng)物都具有高毒性[4]，即使在5～25 mg/L這種相對(duì)較低濃度的苯酚對(duì)于魚類也是致命的[5]。酚類的毒性作用包括細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)凝結(jié)透化作用，急性酚暴露可導(dǎo)致眼睛和呼吸道的嚴(yán)重發(fā)炎，并可通過攝入或經(jīng)皮膚吸收而致命，據(jù)報(bào)道攝取1 g苯酚可致人類死亡[6-7]。慢性酚暴露可導(dǎo)致身體主要器官受損，包括脾臟、胰腺和腎臟[5]。同時(shí)，苯酚還是潛在的人類致癌物。目前，苯酚及其衍生物已被美國環(huán)保局列入優(yōu)先有機(jī)污染物名單中[8]，并規(guī)定在自然水體和土地或市政排污系統(tǒng)中，最大苯酚允許濃度是0.5 mg/L[9]。因此，含苯酚廢水排放前必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚怼?/p>

許多技術(shù)已經(jīng)被用于除去和降解廢水中的酚類化合物。這些技術(shù)包括吸附、溶劑萃取、活性碳吸附、化學(xué)氧化及生物降解[10-13]。但是這些常規(guī)的物理化學(xué)處理法因高成本和容易形成二次污染而飽受詬病[4]。目前，生物降解是經(jīng)濟(jì)且環(huán)境友好的方法[14]。因此，苯酚的生物處理已經(jīng)成為污染防治的首選方法[3，15-17]。

本研究從太谷圣源污水處理廠曝氣池中篩選、馴化高效苯酚降解真菌，并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定及降解特性的初步研究，從而為含酚廢水的治理提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品采自太谷圣源污水處理廠曝氣池中的廢水。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，馬鈴薯粉5 g/L，葡萄糖15 g/L，NaCl 5 g/L，氯霉素0.025 g/L。

純化培養(yǎng)基：K2HPO40.4 g/L，KH2PO40.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO40.1 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L，（NH4）2SO40.4 g/L，加水定容，高壓蒸汽滅菌（121℃，滅菌20 min），冷卻后加入氯霉素0.025 g/L，苯酚質(zhì)量濃度1.0 g/L。

篩選培養(yǎng)基：K2HPO40.4 g/L，KH2PO40.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO40.1 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L，（NH4）2SO40.4 g/L，瓊脂粉15 g/L，加水定容后，高壓蒸汽滅菌（121℃，滅菌20 min），冷卻后加入氯霉素0.025 g/L，苯酚根據(jù)需要量加入。

1.2 降解苯酚真菌的分離篩選

配制100 mL的富集培養(yǎng)基，高壓滅菌后加入終濃度0.025 g/L的氯霉素溶液和終濃度1 g/L苯酚溶液混勻，取5 mL太谷縣圣源污水處理廠曝氣池廢水接種到培養(yǎng)基中，置于28℃，150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)2 d。將富集液稀釋10-4～10-6倍，然后分別取200 μL接種到苯酚質(zhì)量濃度分別為1.0，1.5，2.0 g/L的篩選培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，挑取在最高苯酚濃度的篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，接種于富集培養(yǎng)基中，于28℃，150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)2 d。

1.3 降解苯酚真菌的純化

配制純化培養(yǎng)基，滅菌后加入苯酚溶液，混勻，使培養(yǎng)基的苯酚濃度為1.0 g/L，將分離篩選的菌落富集培養(yǎng)液，按照4%的接種量接種到純化培養(yǎng)基中，并且按照同樣的方法，用水代替菌液水做陰性對(duì)照，置于28℃，150 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h。然后用4-氨基安替比林分光光度法測(cè)定苯酚濃度，計(jì)算苯酚降解率。苯酚降解率＝（未接菌前培養(yǎng)液苯酚量-培養(yǎng)結(jié)束培養(yǎng)液殘余苯酚量）/未接菌前培養(yǎng)液苯酚量×100%。篩選出苯酚降解能力高的菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 不同濃度苯酚對(duì)菌株生長(zhǎng)影響

將純化的菌株接種到苯酚質(zhì)量濃度分別為1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0 g/L的篩選培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，確定菌株耐受的最高苯酚濃度。

1.5 高效降解苯酚真菌的鑒定

取1 mL菌落的富集培養(yǎng)液，8 000 r/min，離心10 min，倒掉上清液，沉淀加100 μL雙蒸水混勻。將混懸液煮沸10 min，然后在-20℃冷凍10 min，反復(fù)2次。將裂解液置于高速冷凍離心機(jī)中，4℃，8 000 r/min，離心10 min，取上清作為PCR模板。真菌ITS引物序列為：上游引物ITS4：5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′；下游引物ITS5：5′-GGAAGTA AAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。然后，通過BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對(duì)，并通過MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 菌株降解苯酚條件優(yōu)化

在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，加入1 g/L苯酚，分別檢測(cè)不同pH值、接種量以及裝液量對(duì)GY8菌株降解苯酚以及菌株生長(zhǎng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解苯酚真菌的篩選和鑒定

經(jīng)過富集培養(yǎng)、分離純化后，從苯酚質(zhì)量濃度為1.5 g/L的純化培養(yǎng)基上挑選15株生長(zhǎng)較好且形態(tài)各異的菌株，分別編號(hào)GY1～GY15，將15株菌接種到篩選培養(yǎng)基后，獲得1株能在含有1.8 g/L苯酚的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的真菌菌株，命名為GY8。利用真菌rDNAITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為522 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，序列（accession number KU974147）經(jīng)BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，它與熱帶假絲酵母EF196807.1序列有99%的相似性（圖1），鑒定該菌株為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）。

2.2 不同pH值對(duì)GY8菌株降解性能的影響

pH值在生物降解中發(fā)揮著重要的作用[18-20]，本研究分別設(shè)定初始pH值為5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，以1 g/L苯酚為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，按4%接種量，培養(yǎng)溫度28℃，180 r/min，培養(yǎng)20 h。從圖2可以看出，該菌株只有在pH值5.5～7.5時(shí)苯酚發(fā)生降解，pH值為8.5～9.5時(shí)幾乎不降解，且在pH值為6.5（無機(jī)鹽自然pH值）時(shí)降解能力最強(qiáng)。故該菌為偏酸性菌，堿性環(huán)境幾乎無降解作用，最適pH值為6.5。

2.3 不同接種量對(duì)GY8菌株降解性能的影響

將富集培養(yǎng)菌液按照5%，9%，13%，17%的接種量接種于以1 g/L苯酚為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28℃，180 r/min，pH值自然條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，不同接種量對(duì)菌株降解苯酚的影響如圖3所示，培養(yǎng)72h后苯酚全部降解。

從圖3可以看出，在最低接種量為5%時(shí)，48 h菌株對(duì)苯酚降解率為93%。接種量在13%和17%時(shí)，48 h全部降解。說明菌株對(duì)苯酚的降解率隨著接種量的增加而增大，5%接種量在72 h內(nèi)可以充分降解苯酚質(zhì)量濃度為1 g/L的培養(yǎng)液。

2.4 不同裝液量對(duì)GY8菌株降解性能的影響

在苯酚質(zhì)量濃度1 g/L，菌懸液按5%接種量接種于液體培養(yǎng)基裝液量分別為16%，24%，32%，40%的250 mL三角瓶中。28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，苯酚降解率隨著裝液量的增加而降低（圖4），培養(yǎng)72 h后苯酚全部降解。而裝液量越多溶解氧越低，從而說明該菌在有氧的條件下利于苯酚降解。

2.5 最大耐受苯酚濃度的確定

將GY8菌株分別接種于以1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0 g/L苯酚為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，在恒溫箱培養(yǎng)72 h后，該菌株在苯酚質(zhì)量濃度為1.8 g/L及以下質(zhì)量濃度的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上均有菌落生長(zhǎng)，而1.9，2.0 g/L均無菌落生長(zhǎng)。說明該菌株最大耐受苯酚質(zhì)量濃度為1.8 g/L。

3 結(jié)論

本研究采用富集、純化和篩選的方法，從山西省太谷縣圣源污水處理廠篩選到一株高效苯酚降解菌。經(jīng)分子鑒定為熱帶假絲酵母菌，命名為GY8。該菌在pH值5.5～7.5的范圍內(nèi)均可降解苯酚，在pH值6.5降解率最大；接種量為5%，苯酚質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，48 h苯酚降解率為93%，72 h內(nèi)苯酚全部降解；有氧條件下利于苯酚的降解；該菌能耐受最大苯酚質(zhì)量濃度為1.8 g/L。結(jié)果表明，GY8對(duì)于含酚廢水的處理具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Study on Isolation，Identification and Characteristic of Phenol Degradation Fungus

XUE Zhiquan，WANGXiangying，LI Hong，Lü Jianhua
（College ofLife Sciences，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Phenol and phenolic compounds are one ofthe most prevalent toxic environmental pollutants.In this paper,by using the enrichment,selection and pure culture,a phenol-biodegrading fungus strain,designated as GY8,was isolated from the aeration tank of Taigu wastewater treatment plant.The strain was able to utilize phenol as a sole carbon source.Analysis of the rDNA ITS sequence showed that it belonged to the genus of Candida tropicalis.The strain could degrade almost 1.0 g/L of phenol within 48 h and could tolerate up to 1.8 g/L phenol by utilizing it as the sole carbon source.Various parameters were investigated for the maximum biodegradation of phenol by setting different levels of pH,inoculum size,and dissolved oxygen conditions.The results showed that the maximum growth and phenol degradation of strain could be obtained under the optimal condition of pH 6.5.Increasing inoculum size could accelerate the degradation rate.The rate ofphenol degradation at concentration of1.0 g/Lreached above 90%at 5%（v/v）inoculum size within 24 h.The dissolved oxygen could accelerate the rate of phenol degradation.It is concluded that the organism i.e.Candida tropicalis GY8 has potential prospect in bio-treatment ofphenol-containingwastewater.

phenol and phenolic compounds;biodegradation;wastewater treatment

Q93

A

1002-2481（2016）06-0801-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.06.20

2016-04-22

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（20132-09）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)161博士科研啟動(dòng)費(fèi)科技項(xiàng)目（J141602001）

薛智權(quán)（1976-），男，四川儀隴人，講師，博士后，主要從事環(huán)境微生物研究工作。呂建華為通信作者。