■ 占 峰 付志歡 林 羽 周 萌* 吳國(guó)杰 舒緒剛 周新華 邱桂雄

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣州天科生物科技有限公司，廣東廣州510627)

硒具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能，是動(dòng)物的重要營(yíng)養(yǎng)元素之一，廣泛用于飼料添加劑中，硒的主要添加形式有無(wú)機(jī)亞硒酸鈉鹽和有機(jī)酵母硒，亞硒酸鈉毒性高、不易被動(dòng)物吸收利用，易造成浪費(fèi)和環(huán)境污染，而酵母硒具有代謝周期長(zhǎng)，生物利用率高，毒性低等特點(diǎn)[1]。因此，了解酵母硒中無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒含量具有重要意義。

目前，酵母硒作為一種重要飼料添加劑，總硒的測(cè)定方法主要有二氨基聯(lián)苯紫外分光光度法[2]、原子熒光分光光度法[3-6]、電感耦合等離子法[7-8]，其中氫化物原子熒光光度法已引入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法中；有機(jī)硒的測(cè)定方法目前還沒(méi)有唯一標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)道較多的主要有質(zhì)譜-高效液相色譜法[9-10]、衍生-高效液相色譜法[11]等，但這些方法對(duì)儀器要求較高，測(cè)試周期較長(zhǎng)，且成本較高不適合廣泛推廣。本研究以酸熱法提取硒酵母中無(wú)機(jī)硒并結(jié)合HG-AFS方法測(cè)定硒酵母中總硒、無(wú)機(jī)硒含量，并通過(guò)總硒含量減去無(wú)機(jī)硒含量的方法間接計(jì)算出有機(jī)硒含量，該法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，期望能為酵母硒中有毒無(wú)機(jī)硒測(cè)定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硼氫化鉀，鹽酸、硝酸、高氯酸（均為優(yōu)級(jí)純），高純水，硒標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

AFS-2000原子熒光分光光度計(jì)（北京科創(chuàng)海光有限公司），數(shù)顯恒溫浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司），超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），恒溫電熱板（Lab-Tech EH20B），低速離心機(jī)（金壇鴻科儀器HDL-4）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

混合酸：硝酸∶高氯酸=4∶1（配比與樣品有關(guān)）；硼氫化鉀溶液：稱取1 g氫氧化鈉加200 ml高純水使其充分溶解，再加入4 g硼氫化鉀混合均勻，現(xiàn)配先用。

1.3.2 總硒含量測(cè)定方法

按GB/T13883—2008《飼料中硒的測(cè)定》方法測(cè)定。

1.3.3 無(wú)機(jī)硒含量測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取0.1 g硒酵母于100 ml三角瓶中加入10 ml 3 mol/l的鹽酸，超聲5 min，使酵母充分溶解，再置于沸水浴中10 min后迅速冷卻，4 000 r/min離心10 min，取上清液，酵母細(xì)胞沉淀重復(fù)利用鹽酸提取2次，合并上清液再置于電熱板上煮沸2 min，稀釋定容。

1.3.4 有機(jī)硒含量測(cè)定方法

有機(jī)硒含量通過(guò)差減法（總硒含量減去無(wú)機(jī)硒含量）測(cè)定。

2 結(jié)果分析

2.1 儀器最佳工作條件

儀器工作負(fù)高壓：280 V；空心陰極燈電流：80 mA；載氣流量：400 ml/min；屏蔽氣流量：900 ml/min；原子化爐高度：8 mm；讀數(shù)時(shí)間：15 s；延遲時(shí)間：3 s；載液：5%HCl；還原劑 ：2%KBH4+0.5%NaOH。

2.2 儀器精密度與檢出限(見(jiàn)表1)

表1 儀器精密度

按照儀器的最佳條件，確定硒的最佳線性范圍為 0～40 μg/l，曲線的相關(guān)系數(shù) R2=0.999 9。通過(guò)對(duì)10 μg/l標(biāo)準(zhǔn)硒測(cè)定5次，得到RSD=2.8%，該方法有較好的精密度。同時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)空白連續(xù)測(cè)定11次，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差得到檢出限（3δ）為0.020 1 μg/l。

2.3 不同濃度鹽酸對(duì)無(wú)機(jī)硒提取效果的影響

由于酵母細(xì)胞壁較厚，在沸水浴中，鹽酸能有效的破壞酵母細(xì)胞璧的結(jié)構(gòu)，使其通透性發(fā)生變大或甚至破裂，胞內(nèi)小分子物質(zhì)溢出，而本試驗(yàn)考察了不同濃度鹽酸對(duì)無(wú)機(jī)硒提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)鹽酸濃度在3 mol/l時(shí)，提取量達(dá)到較大，并通過(guò)重復(fù)稱取5份酵母硒測(cè)定無(wú)機(jī)硒含量，如表2，其相對(duì)偏差在2.85%，方法較為穩(wěn)定。

圖1 鹽酸濃度對(duì)無(wú)機(jī)硒提取效果的影響

表2 無(wú)機(jī)硒的測(cè)定含量

2.4 無(wú)機(jī)硒回收率測(cè)定

通過(guò)測(cè)定3種不同市售的富硒酵母樣品中無(wú)機(jī)硒回收率（結(jié)果見(jiàn)表3）可知，分別在2.5、5、7.5 μg/l的加標(biāo)量下，其無(wú)機(jī)硒回收率在83.4%～89.7%，其回收率大于80%，符合微量元素測(cè)定準(zhǔn)確的方法，可以通過(guò)差減法進(jìn)行后續(xù)的有機(jī)硒定量測(cè)定。

表3 無(wú)機(jī)硒回收率的測(cè)定

2.5 有機(jī)硒的測(cè)定

對(duì)市售的3種不同廠家的富硒酵母樣品進(jìn)行分析測(cè)定結(jié)果如表4。如表4可知，3種不同的市售富硒酵母其有機(jī)硒占富硒酵母總硒含量分別為98.8%、98.3%、98.0%。

表4 酵母硒中有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒的測(cè)定

3 結(jié)論

本文采用HG-AFS與鹽酸破碎提取相結(jié)合的方法測(cè)定硒酵母中的總硒和無(wú)機(jī)硒含量，并通過(guò)差減法得到有機(jī)硒含量，結(jié)果表明樣品中有機(jī)硒含量占98%以上，這一結(jié)果符合《飼料添加劑安全使用規(guī)范》的規(guī)定，可以用于飼料添加劑，同時(shí)通過(guò)無(wú)機(jī)硒的加標(biāo)回收試驗(yàn)，該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適于富硒酵母有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒的測(cè)定。