李玉斌，吳華昌，鄧靜*，劉陽(yáng)，吉志偉，易宇文，彭毅秦

1(四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢，643000) 2(四川旅游學(xué)院,烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610000)

復(fù)合泡菜專用菌劑的制備與發(fā)酵性能評(píng)價(jià)

李玉斌1，吳華昌2，鄧靜2*，劉陽(yáng)2，吉志偉2，易宇文2，彭毅秦2

1(四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢，643000) 2(四川旅游學(xué)院,烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610000)

以實(shí)驗(yàn)室保藏的1株乳酸菌與1株酵母菌為研究對(duì)象，采用真空冷凍干燥技術(shù)制作活菌制劑，并對(duì)菌劑發(fā)酵性能進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明：經(jīng)4 ℃、6 500 r/min，13 min離心收集菌體，再以10%蛋白胨+3%維生素C為保護(hù)劑，真空冷凍干燥后，酵母菌與乳酸菌凍干存活率分別達(dá)86.3%、87.8%。將自制復(fù)合菌劑用于甘藍(lán)發(fā)酵，并與市售菌劑、自然發(fā)酵比較：添加自制菌劑發(fā)酵的甘藍(lán)pH、總酸度提前2 d趨于穩(wěn)定，分別為5.4、11.05 g/100 g；亞硝酸鹽含量更低，最大值僅為7.07 mg/kg；初步認(rèn)定乙醇(42.46%)、苯乙醇(13.47%)、4-乙基苯酚(6.77%)、順-3-己烯醇(4.48%)為自制菌劑發(fā)酵甘藍(lán)的主要風(fēng)味物質(zhì)。此復(fù)合菌劑具有較好的產(chǎn)酸產(chǎn)香能力，其在泡菜行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景。

酵母菌；乳酸菌；菌劑；發(fā)酵性能

傳統(tǒng)泡菜生產(chǎn)多采用陳泡菜水自然發(fā)酵法，此法成本低、操作簡(jiǎn)單、風(fēng)味較好，但也存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、質(zhì)量不穩(wěn)定、受環(huán)境影響大等弊端。直投式菌劑因其發(fā)酵周期短、亞硝酸鹽含量低、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)受到人們的重視[1-4]。目前，泡菜菌劑的制作以乳酸菌為主，包括植物乳桿菌[5]、短乳桿菌[6]、胚牙乳桿菌、腸系膜明串珠菌[7]等，這些菌劑與傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜相比，雖產(chǎn)酸速率快、亞硝酸鹽含量低，但由于菌種單一，而導(dǎo)致風(fēng)味不足[7-8]。

目前國(guó)際上生產(chǎn)活菌制劑的技術(shù)主要有真空冷凍干燥、噴霧干燥等[9]。其中，真空冷凍干燥是多數(shù)微生物菌劑制作的方法[12-14]，此法生產(chǎn)的菌劑與噴霧干燥技術(shù)相比具有更高的活菌存活率。在真空冷凍干燥中，菌體的收集、凍干保護(hù)劑選擇及凍干條件等因素影響凍干菌劑的活菌存活率，而菌體的收集與保護(hù)劑的選擇對(duì)菌劑活菌存活率影響十分顯著。

研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的1株益生乳酸菌與1株產(chǎn)香酵母菌為研究對(duì)象，采用真空冷凍干燥技術(shù)，探究?jī)龈汕邦A(yù)處理?xiàng)l件(菌體收集條件、保護(hù)劑的選擇)對(duì)活菌存活率的影響，并將自制菌劑投放于結(jié)球甘藍(lán)中發(fā)酵，與市售菌劑、自然發(fā)酵的甘藍(lán)比較，對(duì)3種菌劑的發(fā)酵性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

二甲基亞砜(DMSO)、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘已二胺、亞硝酸鈉，以上試劑均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；MTT，美國(guó)Amresco公司。

菌種：戊糖乳桿菌、酵母菌(Kazachstaniabarnettii)，實(shí)驗(yàn)室保藏(2株菌的益生、產(chǎn)香性能已被鑒定)；川秀泡菜乳酸菌發(fā)酵粉，市售；結(jié)球甘藍(lán)，購(gòu)于自貢市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

酵母菌的活化與培養(yǎng)為YPD培養(yǎng)基；乳酸菌的活化與培養(yǎng)為MRS培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo 1500全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Thermo公司；SJIA-10N真空冷凍干燥機(jī)，寧波雙嘉儀器有限公司；Universal 320R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hettich公司；50/30μm DVB/AR/PDMS萃取頭，Agilent -5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 泡菜菌劑制作工藝流程

1.3.2 菌種的活化與培養(yǎng)

酵母菌活化與培養(yǎng)：挑取4 ℃斜面保存的酵母菌單菌落，于50 mL滅菌的YPD種子液培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)24 h。配制300 mL YPD液體培養(yǎng)基，均分于3個(gè)三角瓶中，滅菌后加入2%(v/v)的YPD種子液，于28 ℃靜置培養(yǎng)18 h。

乳酸菌活化與培養(yǎng)：乳酸菌活化與培養(yǎng)的步驟同酵母菌，但乳酸菌活化、培養(yǎng)于MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為18 h。

1.3.3 MTT法測(cè)定菌體存活率

按文獻(xiàn)[15]方法，略有修改。取100 μL酵母菌菌懸液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)樣做3組平行，以不接菌的培養(yǎng)基做空白對(duì)照，加入MTT溶液20 μL，混勻后避光置于28 ℃(乳酸菌為37 ℃)培養(yǎng)箱中，2 h后取出，加入二甲基亞砜100 μL，充分溶解，測(cè)定OD500 nm。

1.3.4 離心收集條件對(duì)菌體離心存活率的影響

以乳酸菌、酵母菌離心存活率為指標(biāo)，分別對(duì)離心轉(zhuǎn)速、溫度、時(shí)間進(jìn)行考察，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定2菌體的最佳離心收集條件。

1.3.5 保護(hù)劑對(duì)菌體凍干存活率的影響

1.3.5.1 單一保護(hù)劑的選擇

分別以5%海藻糖、10%葡萄糖、5%甘油、5%谷氨酸鈉、5% Vc、10%蛋白胨作為保護(hù)劑，0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾備用。按1.3.2、1.3.4小節(jié)活化培養(yǎng)與收集菌體，加入1 mL PBS溶液混勻，形成菌懸液，以1∶2體積比添加上述7種保護(hù)劑，放置30 min后，-20 ℃預(yù)凍2 h。預(yù)凍完成后，轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，凍干條件為：-80 ℃，真空度1 999.8，時(shí)間12 h。以凍干菌體存活率為檢測(cè)指標(biāo)，確定最佳單因素凍干保護(hù)劑。

1.3.5.2 復(fù)合保護(hù)劑配比的確定

根據(jù)單一保護(hù)劑篩選結(jié)果，選擇凍干效果較好的低分子與高分子保護(hù)劑作為復(fù)合保護(hù)劑進(jìn)行凍干實(shí)驗(yàn)，復(fù)合保護(hù)劑添加體積比為1∶2，以菌體凍干存活率為檢測(cè)指標(biāo)，確定最佳保護(hù)劑配比。

1.3.6 泡菜制作

將甘藍(lán)去桿、去壞葉后洗凈瀝干，稱約3 kg結(jié)球甘藍(lán)至4 L泡菜壇中，加入4%的鹽水至2/3壇，再添加菌劑(0.1%自制復(fù)合菌劑、0.1%市售菌劑發(fā)酵、自然發(fā)酵)，補(bǔ)充鹽水至壇滿，加蓋密封發(fā)酵。每種發(fā)酵方式做3組平行。自制菌劑混合比例為1∶2(乳酸菌∶酵母菌)，活菌數(shù)達(dá)到106CFU以上。

1.3.7 泡菜理化指標(biāo)測(cè)定

pH：酸度計(jì)測(cè)定；總酸度：按GB 5009.7—2008測(cè)定[16]；亞硝酸鹽含量：按GB 5009.33—2010測(cè)定[17]。

1.3.8 泡菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

1.3.8.1 樣品處理

稱取適量3種方式發(fā)酵7 d的泡菜，制作勻漿，準(zhǔn)確稱取勻漿5.0 g裝入15 mL樣品瓶中，備用。

1.3.8.2 頂空固相微萃取(Headspace SPME)條件

將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，70 ℃平衡30 min、吸附10 min后，將萃取頭取出并插入GC進(jìn)樣口，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)，解吸3 min。

1.3.8.3 GC-MS分析條件

HP 5890/5975 GC/MS聯(lián)用儀, 色譜柱：HP-5MS型(30 m×0.250 mm×0.25 μm)；載氣：氦氣；進(jìn)樣溫度：230 ℃；進(jìn)樣量: 1 μL；升溫程序: 初溫45 ℃保持2 min，5 ℃/min上升至180 ℃，保持1 min，25 ℃/min升到230 ℃，保持5.5 min。

1.3.8.4 數(shù)據(jù)處理

由計(jì)算機(jī)質(zhì)譜系統(tǒng)NSIT與RTLPEST檢索未知化合物，匹配度大于800(最大1 000)的結(jié)果將予以報(bào)告，面積歸一法計(jì)算各成分的含量。

1.3.9 感官評(píng)價(jià)

10位品評(píng)人員對(duì)泡菜感官特征進(jìn)行描述，包括香氣、質(zhì)地滋味及色澤體態(tài)等[19]，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重與尺度建立，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體最佳離心收集條件的確定

2.1.1 菌體離心收集單因素試驗(yàn)

由于酵母菌與乳酸菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異，使兩菌對(duì)離心剪切力承受能力不同，影響菌劑的活菌存活率，后序研究中將兩菌分開(kāi)進(jìn)行離心與凍干。實(shí)驗(yàn)分別固定離心轉(zhuǎn)速9 000 r/min、時(shí)間15 min、溫度5 ℃，考察離心轉(zhuǎn)速(3 000、5 000、7 000、9 000、11 000 r/min)、離心溫度(0、5、10、15、20 ℃)、離心時(shí)間(5、10、15、20、25 min)對(duì)酵母菌與乳酸菌離心存活率的影響，結(jié)果如圖1～3：酵母菌與乳酸菌最佳單因素離心條件為轉(zhuǎn)速7 000 r/min、溫度5 ℃、時(shí)間15 min。

圖1 不同離心條件下各菌體的存活率Fig.1 Survival rate of thallus under different conditions of centrifugation

2.1.2 乳酸菌與酵母菌最佳離心收集條件的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2和表3所示。對(duì)乳酸菌離心存活率影響大小為A(轉(zhuǎn)速)>B(溫度)>C(時(shí)間)，最佳離心條件為轉(zhuǎn)速7 500 r/min、離心時(shí)間13 min、離心溫度4 ℃；對(duì)酵母菌離心存活率影響依次為C (溫度)> B (時(shí)間)> A (轉(zhuǎn)速)，最佳離心條件為離心轉(zhuǎn)速7 000 r/min、時(shí)間15 min、溫度4 ℃。

表2 乳酸菌離心收集的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 酵母菌離心收集的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 保護(hù)劑對(duì)菌體凍干存活率的影響

2.2.1 單一保護(hù)劑對(duì)酵母菌與乳酸菌凍干存活率的影響

菌劑制備中，冷凍和干燥兩個(gè)過(guò)程都會(huì)造成菌體的細(xì)胞膜破裂，從而使微生物活性降低甚至消失，通過(guò)添加一定量的保護(hù)劑，可使菌體的存活率大大提高。凍干保護(hù)劑可分為低分子保護(hù)劑與高分子保護(hù)劑[22]。低分子保護(hù)劑可與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性[20]。而高分子保護(hù)劑則通過(guò)“包埋”形式保護(hù)菌體，同時(shí)促進(jìn)低分子保護(hù)劑發(fā)揮作用[21-22]。實(shí)驗(yàn)選取一種高分子保護(hù)劑(蛋白胨)與六種低分子保護(hù)劑(海藻糖、葡萄糖、甘油、谷氨酸鈉、Vc、PBS溶液)進(jìn)行凍干(見(jiàn)圖2)。

圖2 七種保護(hù)劑下乳酸菌與酵母菌的凍干存活率Fig.2 The survival rate of freeze-dry of LAB and yeast protected by seven protective agents

圖2可知，7種保護(hù)劑對(duì)乳酸菌凍干保護(hù)效果依次為：海藻糖> Vc >蛋白胨>甘油>谷氨酸鈉>葡萄糖>PBS，其中，海藻糖、蛋白胨和Vc效果最佳，凍干存活率分別為54.58%、42.55%、44.65%，甘油和谷氨酸鈉效果類似，PBS保護(hù)效果最差，凍干存活率僅為24.75%；7種保護(hù)劑對(duì)酵母菌凍干保護(hù)效果依次為：海藻糖>蛋白胨>Vc>谷氨酸鈉>甘油>葡萄糖>PBS，以海藻糖、蛋白胨和Vc效果最好，凍干存活率分別為59.14%、56.28%、52.90%，PBS保護(hù)效果最差，凍干存活率為24.87%。由于海藻糖成本高、保護(hù)優(yōu)勢(shì)不明顯，因此選擇保護(hù)效果良好且成本較低的蛋白胨與Vc作為復(fù)合保護(hù)劑。

2.2.2 復(fù)合保護(hù)劑對(duì)酵母菌與乳酸菌凍干存活率的影響

與復(fù)合保護(hù)劑相比，單一保護(hù)劑對(duì)菌體的保護(hù)效果較差，不能滿足菌體抵抗外界惡劣的條件，一般按一定配比制作復(fù)合保護(hù)劑，保護(hù)劑之間形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高菌體的凍干存活率。實(shí)驗(yàn)選用單一保護(hù)效果較佳的蛋白胨與Vc(8%蛋白胨+3%Vc、8%蛋白胨+5%Vc、8%蛋白胨+7%Vc、10%蛋白胨+3%Vc、10%蛋白胨+3%Vc、10%蛋白胨+3%Vc、12%蛋白胨+3%Vc、12%蛋白胨+3%Vc、12%蛋白胨+3%Vc)進(jìn)行復(fù)合保護(hù)劑配比優(yōu)化，研究其保護(hù)效果(圖3)。

1-8%蛋白胨+3%Vc；2-8%蛋白胨+5%Vc；3-8%蛋白胨+7%Vc；4-10%蛋白胨+3%Vc；5-10%蛋白胨+3%Vc；6-10%蛋白胨+3%Vc；7-12%蛋白胨+3%Vc；8-12%蛋白胨+3%Vc；9-12%蛋白胨+3%Vc圖3 復(fù)合保護(hù)劑保護(hù)效果Fig.3 Effect of protection by compound protective agents

由圖3可知：對(duì)于乳酸菌，保護(hù)劑配比為10%蛋白胨+3%Vc時(shí)保護(hù)效果最佳，菌體凍干存活率達(dá)87.8%，8%蛋白胨+7%Vc效果最差，僅為63.1%。對(duì)于酵母菌，復(fù)合保護(hù)劑配比為8%蛋白胨+5%Vc保護(hù)效果最好，凍干存活率達(dá)86.8%，12%蛋白胨+3%Vc保護(hù)效果最差，其凍干存活率僅為65.5%。綜合乳酸菌與酵母菌在9種不同配比復(fù)合保護(hù)劑下的凍干存活率，選擇復(fù)合保護(hù)劑配比為10%蛋白胨+3%Vc，此時(shí)酵母菌與乳酸菌凍干存活率分別達(dá)到86.3、87.8%。

2.3 菌劑發(fā)酵性能評(píng)價(jià)

2.3.1 不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)pH值與總酸度變化

pH值是泡菜發(fā)酵的一個(gè)重要指標(biāo)，一般認(rèn)為當(dāng)pH≤4時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)比較自制菌劑、市售菌劑與自然發(fā)酵泡菜pH值與總酸度變化(見(jiàn)圖4和圖5)：隨著發(fā)酵進(jìn)行，甘藍(lán)的pH值逐漸降低，在3.5左右趨于穩(wěn)定，總酸度先增大后趨于穩(wěn)定。但同時(shí)自制菌劑、市售菌劑、自然發(fā)酵甘藍(lán)的pH值與總酸度變化速率不同，pH值分別在第3、5、7 d后保持穩(wěn)定，總酸度分別于第5、7、7天趨于穩(wěn)定，為11.05、12.38、12.44 g/100 g。自制菌劑有顯著的產(chǎn)酸能力，這一研究結(jié)果與余文華等人在研究直投式菌劑發(fā)酵泡菜時(shí)所得結(jié)論一致[4]。泡菜pH值與總酸度最后趨于穩(wěn)定，是由于乳酸菌大量繁殖產(chǎn)酸，使乳酸積累過(guò)量，抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)[23]。

圖4 不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)的pH值變化Fig.4 The pH changes of cabbage fermented by different inocula

圖5 不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)的總酸變化Fig.5 The total acid changes of cabbage fermented by different inocula

2.3.2 不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)亞硝酸鹽含量的變化

腌制蔬菜制品中的亞硝酸鹽主要是由部分革蘭氏陰性菌的硝酸還原酶將細(xì)胞質(zhì)中的硝酸鹽還原而來(lái)，可造成人體急性或慢性中毒[24]。目前我國(guó)醬腌菜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB2714—2003)中規(guī)定亞硝酸鹽含量不超過(guò)20 mg/kg。實(shí)驗(yàn)比較不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)亞硝酸鹽含量的變化情況(見(jiàn)圖6)

圖6 不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)亞硝酸鹽含量的變化Fig.6 The nitrite content changes of cabbage fermented by different inocula

由圖6可知：自然發(fā)酵、市售菌劑、自制菌劑的泡菜亞硝酸鹽含量均呈先增大后減小的趨勢(shì)，分別在第5、2、2天達(dá)到最大值27.75、19.44和7.07 mg/kg，于第7天后基本趨于穩(wěn)定，分別為4.36、3.56、2.66 mg/kg。自然發(fā)酵泡菜在第2～5天亞硝酸鹽含量超過(guò)20 mg/kg，市售菌劑發(fā)酵泡菜亞硝酸鹽含量于第2天時(shí)接近20 mg/kg，而自制菌劑發(fā)酵的泡菜亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)低于20 mg/kg。因此從安全性上來(lái)說(shuō)自制菌劑比市售菌劑好，而自然發(fā)酵最差，這一研究結(jié)果與袁亞等人在研究人工接種乳酸菌對(duì)泡菜亞硝酸鹽含量影響時(shí)得到的結(jié)論一致[25]。

2.4 不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)揮發(fā)性風(fēng)味成分比較

由不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)的理化指標(biāo)變化可知：發(fā)酵7 d后泡菜的酸度、pH值與亞硝酸含量趨于穩(wěn)定，泡菜基本成熟。準(zhǔn)確稱取發(fā)酵7 d的泡菜勻漿各5.0 g，經(jīng)頂空固相微萃取后進(jìn)行GC-MS分析，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量見(jiàn)表4。

表4 不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)的揮發(fā)性風(fēng)味成分比較

異硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基異硫氰酸酯、順-3-己烯醇是新鮮青菜中的主要香味物質(zhì)，相對(duì)含量分別為71.92、10.27、4.24%。異硫氰酸烯丙酯與3-丁烯基異硫氰酸酯具有辛辣味，廣泛存在于芥菜、山葵、辣根等十字花科蔬菜及其制品中[29]。新鮮甘藍(lán)發(fā)酵7 d后，自制菌劑發(fā)酵甘藍(lán)中未檢測(cè)出異硫氰酸烯丙酯，市售菌劑、自然發(fā)酵甘藍(lán)中異硫氰酸烯丙酯相對(duì)含量分別減少到6.89%和12.09%，降低了90.42%和83.19%；3種菌劑發(fā)酵的甘藍(lán)中均未檢測(cè)出3-丁烯基異硫氰酸酯；這兩種硫氰酯的減少或消失有效降低了青菜的辛辣感，是微生物代謝活動(dòng)的結(jié)果。順-3-己烯醇，又稱葉醇，是一種重要的不飽和脂肪醇，具有清新的草香味。新鮮甘藍(lán)經(jīng)自制菌劑、自然發(fā)酵，葉醇的相對(duì)含量分別增加到4.48%和12.24%，上升了5.37%和188.68%，市售菌劑發(fā)酵泡菜相對(duì)含量減少到0.56%，下降了86.79%，這可能是菌種代謝特性不同造成的。

新鮮甘藍(lán)經(jīng)自制菌劑、市售菌劑、自然發(fā)酵，苯乙醇相對(duì)含量分別增加到13.47和8.06、4%，其中，自制菌劑發(fā)酵與其他2種發(fā)酵方式相比，苯乙醇含量分別上升了67.12%和236.75%。苯乙醇是酵母菌將L-苯丙氨酸經(jīng)脫氨酶、脫羧酶、還原酶作用產(chǎn)生，具有甜香、玫瑰花香和蜂蜜香[30]，有助于增加泡菜風(fēng)味。4-乙基苯酚是新鮮青菜經(jīng)自制菌劑、市售菌劑、自然發(fā)酵產(chǎn)生的香味物質(zhì)，相對(duì)含量分別為6.77%、2.52%和5.56%，該物質(zhì)具有特殊的香氣[28]，是由酵母菌將乙烯基分解產(chǎn)生，在葡萄酒和郫縣豆瓣醬中均有檢出[29]。

3種發(fā)酵方式相比，自制菌劑既可有效地降解新鮮甘藍(lán)中辛辣物質(zhì)(異硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基異硫氰酸酯等)，又可顯著增加泡菜中特殊風(fēng)味成分的含量(順-3-己烯醇、苯乙醇、4-乙基苯酚等)，是一種可提高泡菜風(fēng)味的菌劑。

2.5 不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)的感官評(píng)價(jià)

新鮮甘藍(lán)經(jīng)自制菌劑、市售菌劑、自然發(fā)酵7 d后，各取適量泡菜進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果如表5所示，自制菌劑發(fā)酵泡菜感官評(píng)價(jià)最優(yōu)為91分，市售菌劑發(fā)酵泡菜次之，自然發(fā)酵泡菜最差。自制菌劑發(fā)酵泡菜色澤、香味、滋味、質(zhì)地均高于其余二者，是由于自制菌劑產(chǎn)酸能力強(qiáng)，發(fā)酵初期大量產(chǎn)酸，鈍化了使蔬菜組織軟化的酶的活性，賦予產(chǎn)品清脆的質(zhì)地[30]。香味上，自制菌劑發(fā)酵泡菜具有明顯的玫瑰香味，香味得分最佳，為28分。

表5 不同菌劑發(fā)酵甘藍(lán)的感官評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

(1)研究采用正交設(shè)計(jì)確定了混合菌體最優(yōu)離心收集條件為轉(zhuǎn)速6 500 r/min、時(shí)間13 min、溫度4 ℃，此條件下酵母菌與乳酸菌離心存活率分別達(dá)到88.1、92.4%。以10%蛋白胨+3%Vc為凍干保護(hù)劑，凍干12 h后，酵母菌與乳酸菌凍干存活率可達(dá)到86.3、87.8%。

(2) 3種菌劑發(fā)酵甘藍(lán)相比：自制菌劑在產(chǎn)酸速率上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，其pH值在第3天達(dá)到3.5，總酸度于第5天達(dá)到11.05 g/100 g，與其他2種發(fā)酵方式相比縮短了2 d；自制活菌制劑發(fā)酵泡菜的亞硝酸鹽含量最大值僅為7.07 mg/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)規(guī)定的最大值20 mg/kg，安全性更好；風(fēng)味上，自制菌劑發(fā)酵泡菜的風(fēng)味物質(zhì)在第7天時(shí)達(dá)到6種，初步認(rèn)定乙醇(42.46%)、苯乙醇(13.47%)、4-乙基苯酚(6.77%)、順-3-己烯醇(4.48%)是其主要的風(fēng)味物質(zhì)；感官上，自制菌劑泡菜最優(yōu)(91分)。研究結(jié)果可為優(yōu)質(zhì)泡菜菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。

[1] 李書(shū)華,陳封政.泡菜的研究進(jìn)展及生產(chǎn)中存在的問(wèn)題[J].食品科技, 2007,32(3):8-11.

[2] 李書(shū)華,蒲彪,陳封政.泡菜的功能及防腐研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造, 2005,17(4):6-8.

[3] 陳功,余文華,張其圣等.泡菜直投式菌劑制備及應(yīng)用研究[J].四川食品與發(fā)酵,2008,44(4):19-23.

[4] 余文華,張其圣,陳功等.直投式菌劑發(fā)酵泡菜的動(dòng)態(tài)研究[J].食品與發(fā)酵科技,2010,46(6):12-15,25.

[5] 趙爽,孫娟,劉書(shū)亮等.,泡菜直投式乳酸菌發(fā)酵劑的制備[J].食品工業(yè)科技, 2014,40(17):171-175;179.

[6] 朱孔亮,泡菜用乳酸菌的篩選、高密度培養(yǎng)及菌劑配方的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2014:14-17..

[7] 張良,向文良,曾澤生等.四川泡菜乳酸發(fā)酵菌劑的研究[J]. 食品科學(xué), 2013,34(19):200-206.

[8] 韓秋霞,鄒玉紅.傳統(tǒng)泡菜的微生物學(xué)研究[J].中國(guó)釀造, 2008,27(7):47-50.

[9] GAO G. ZHANG G. Influence of freeze-drying conditions on survival ofOenococcusoenifor malolactic fermentation[J].International Journal of Food Microbiology, 2009,135 (1):64-67.

[10] JIN X, DAN C,Microencapsulating aerial conidia ofTrichodermaharzianumthrough spray drying at elevated temperatures[J]. Biological Control, 2011, 56(2): 202-208.

[11] LUNA-SOLANO G, SALGADO-CERWANTES M A,G C,et al. Optimization of brewer's yeast spray drying process[J]. Journal of Food Engineering, 2005,68(1):9-18.

[12] 余淑嫻,郝曉霞,羅明,真空冷凍干燥技術(shù)及其應(yīng)用[J].食品科技, 2007,32(10):22-25.

[13] 房星星,呂曉東.真空冷凍干燥技術(shù)的應(yīng)用研究[J].食品與藥品, 2007, 9(8):57-60.

[14] 付博,馬齊,王衛(wèi)衛(wèi).真空冷凍干燥與噴霧干燥長(zhǎng)雙歧桿菌的工藝比較研究[J].食品科學(xué), 2012,33(7):188-192.

[15] 楊培潔,李騰,陳曉紅等. MTT法測(cè)定瑞士乳桿菌MB2-1活菌數(shù)[J].食品科學(xué), 2013,34(20):99-102.

[16] 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院.GB/T 12456-2008食品中總酸的測(cè)定[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[17] 國(guó)家質(zhì)檢總局(CN-GB). GB/T 5009.33—2010食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[18] 魏永義,趙國(guó)品,張莉,定量描述法在食醋感官評(píng)定中的應(yīng)用[J].中國(guó)調(diào)味品, 2012,37(6):20-21,26.

[19] 呂兵,張國(guó)農(nóng),林金資.酸奶發(fā)酵劑速效干燥制備中保護(hù)劑的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè), 1996. 15(2):3-5.

[20] 陳聲明,呂琴.微生物冷凍干燥的抗性機(jī)理[J].微生物學(xué)通報(bào), 1996, 20(4):236-238.

[21] TIMASHEFF SN. Control of protein stability and reactions by weakly interacting cosolvents: the simplicity of the complicated[J]. Advance in Protein Chemistry, 1998, 51(1) 355-432.

[22] MAZZOBRE M F, BUERA M D P, CHIRIFE J. Protective role of trehalose on thermal stability of Lactase in relation to its glass and crystal forming properties and effect of delaying crystallization[J]. LWT-Food Science and Technology, 1997,30( 3): 324-329.

[23] 閆征,王昌祿,顧曉波.pH值對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)和乳酸產(chǎn)量的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2003,29(6):35-38.

[24] 馬延巖,發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的生成及降解機(jī)理研究[D].天津:天津科技大學(xué),2010: 8-10.

[25] 袁亞,池金穎,黃丹丹.人工接種乳酸菌對(duì)泡菜感官品質(zhì)和亞硝酸鹽含量的影響[J].食品工業(yè)科技, 2012,33(7):119-122;126.

[26] 肖華志,食用辛辣風(fēng)味物質(zhì)異硫氰酸烯丙酯(AITC)的研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2004:21-24.

[27] 范文來(lái),徐巖.酒類風(fēng)味化學(xué)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2014:110-119.

[28] 崔云前,曹小紅,王春玲等.發(fā)酵行業(yè)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造, 2009,28(4):14-17.

[29] 馮軍,陳海濤,黃明泉等.不同品牌郫縣豆瓣醬揮發(fā)性成分的比較研究[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,28(3):17-22.

[30] RHEE S J,LEE J E,LEE C H., Importance of lactic acid bacteria in Asian fermented foods[J]. Microb Cell Fact, 2011,10(1): 5-9.

Preparation of a complex bacteria agent for pickles and evaluation of fermentation performance

LI Yu-bin1, WU Hua-chang2, DENG Jing2*, LIU Yang2, JI Zhi-wei2, YI Yu-wen2, PENG Yi-qin2

1(College of Bioengineering, Sichuan University of Science & Engineering, Zigong 643000, China) 2(Cooking Science Key Laboratory, Sichuan Tourism University, Chengdu 610000, China)

In this study, a lactic acid bacteria strain and a yeast strain preserved in laboratory were used to prepare live bacteria agent by vacuum freeze-drying technology, and fermentation performance of live bacteria agent was evaluated. Results showed that bacteria were collected by centrifugation (4 ℃, 6 500 r/min, 13 min) with 10%peptone and 3% vitamin C as protective agent, the survival rates of yeast and lactic acid bacteria after vacuum freeze-drying were 86.3% and 87.8%, respectively. Fermentation using self-made bacteria agent was compared with commercial bacteria agent and natural fermentation. The pH and total acid of cabbage fermented by self-made bacteria agent were 5.4 and 11.05 g, which showed stronger acid-producing capability than others. The maximum content of nitrate from fermentation using self-made bacteria agent was lower than that from other fermentation, which was only 7.07 mg/kg. Ethanol (42.46%), benzene ethanol (13.47%), 4-ethyl phenol (6.77%) and cis -3-hexenol (4.48%) were preliminarily identified as the main volatile flavor compounds of self-made bacteria agent. The self-made bacteria agent with stronger acid production and aroma-producing ability would have good application prospects in the pickle industry.

yeast; lactic acid bacteria; bacteria agent; fermentation performance

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612018

碩士研究生(鄧靜教授為通訊作者,E-mail：79190096@qq.com)。

四川省教育廳自然科學(xué)基金(15ZA0315);四川省科技廳(2016NZ0018);四川省科技廳(2016FZ0027);成都市科技局(2015-NY02-00360-NC)

2016-03-25，改回日期：2016-07-15