鐘榮斌，王友亮

·述 評·

腫瘤的液態(tài)活檢

鐘榮斌，王友亮

腫瘤的液態(tài)活檢主要是指對腫瘤患者體液樣本中多種腫瘤標志物和細胞的檢測，包括腫瘤標志物分子、循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤 DNA 和外泌體。 液態(tài)活檢是一種新興的非侵入式分子病理檢測方法，對腫瘤的早期診斷、實時監(jiān)測、預(yù)后分析和復(fù)發(fā)的風(fēng)險評估等方面具有重大應(yīng)用價值。 作者主要從分子檢測技術(shù)和臨床應(yīng)用等方面綜合闡述液態(tài)活檢在腫瘤診療領(lǐng)域的應(yīng)用前景及面臨的挑戰(zhàn)。

液態(tài)活檢；循環(huán)腫瘤細胞；循環(huán)腫瘤 DNA；外泌體

傳統(tǒng)的腫瘤診斷方法主要為組織學(xué)方法，是將取自患者體內(nèi)的腫瘤組織制成切片，置于顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)的變化或者進行免疫組織化學(xué)分析實驗，由于其結(jié)果準確性高，因此被譽為腫瘤診斷的“ 金標準”[1]。 組織學(xué)檢測是針對手術(shù)或者活檢取材后的腫瘤組織進行的，取材均應(yīng)保證足夠的腫瘤細胞，盡量剔除非腫瘤組織和細胞。 這存在許多弊端，首先是腫瘤組織的獲取是侵入性的有創(chuàng)操作，難以用于常規(guī)檢查。對于腫瘤晚期不能耐受手術(shù)或者腔鏡檢查的患者來說，無法取得腫瘤組織進行相關(guān)基因的檢測。其次是腫瘤的異質(zhì)性，無法保證檢測的腫瘤組織具有代表性，會導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏差。再次是基因狀態(tài)的改變，隨著藥物的使用，機體融合基因的表達或突變狀態(tài)可能發(fā)生改變，從而導(dǎo)致機體對藥物的敏感性發(fā)生改變，無法實現(xiàn)腫瘤的早期診斷、療效評價和實時監(jiān)測[2]。 液態(tài)活檢是對體液進行的檢測，通過檢測腫瘤細胞釋放到體液中的標志物信息，從而獲得患者體內(nèi)腫瘤基因或者蛋白表達的全面信息。液態(tài)活檢的主要檢測物包括腫瘤標志物分子[3]、循 環(huán) 腫 瘤 細 胞(circulating tumor cells，CTCs)[4]、 循 環(huán) 腫 瘤 DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)[5]和外 泌 體[6]。 液 態(tài) 活 檢 的樣 本 主要 是 血液，其他的還有尿液、唾液、乳汁、胸水和腦脊液等體液[7]。 作者主要綜合闡述液態(tài)活檢的主要檢測物、常用檢測技術(shù)和在腫瘤診治領(lǐng)域的一些應(yīng)用。

1 液態(tài)活檢的主要檢測物

1.1 典型的腫瘤標志物分子 腫瘤標志物分子是指在惡性腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身癌癥相關(guān)基因表達產(chǎn)生或機體對抗腫瘤產(chǎn)生反應(yīng)而異常表達的一類可以反應(yīng)腫瘤存在和增殖狀況的物質(zhì)[8]。 血液中存在許多腫瘤細胞產(chǎn)生的生物分子，與腫瘤的類別、增殖狀況等息息相關(guān)。腫瘤抗原(cancer antigen，CA)15-3 最早是在乳腺癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，確認為乳腺癌細胞表面過表達的 MUC-1 在血液中的分泌形式，因此被看做是乳腺癌標志物[9]。研究發(fā)現(xiàn)在肺癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌患者體內(nèi)均能檢測出 CA15-3[10]，表明 CA15-3 的敏感性和特異性不是很高，其診斷價值相對較低。 但是研究表明，轉(zhuǎn)移型乳腺癌患者術(shù)前 CA15-3 含量升高預(yù)示無病生存率和總體生存率低[11]，所以 CA15-3 可應(yīng)用于腫瘤早期轉(zhuǎn)移的檢測。癌胚抗原是血清中一種廣譜的腫瘤標志物明星分子，且常與 CA15-3 聯(lián)合用于腫瘤的預(yù)后分析[12]。 在一項1 681例乳腺癌 患者預(yù)后分析研究中發(fā)現(xiàn)，單獨的癌胚抗原在腫瘤的診斷上并不理想，但是當(dāng)癌胚抗原與 CA15-3 聯(lián)合檢測時，分析的敏感性和特異性都有大幅度提高，所以認為2種腫瘤標志物的聯(lián)用將會是一個有效的乳腺癌患者術(shù)后隨訪指標[13]。 血液中 還 存 在許多種類型的腫瘤標志物分子，如細胞角蛋白 19 片段[14]、胃泌素釋放肽前體[15]、神經(jīng)特異性烯醇化酶[16]等，在腫瘤的早期診斷中是一個非常重要的參考指標。

1.2 CTCs 血液中 CTCs 的發(fā)現(xiàn)最早可以追溯到1869 年，Ashworth[17]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移腫瘤患者血液中可能存在一些與原發(fā)灶腫瘤組織同源的細胞。受當(dāng)時檢測手段的限制，這一發(fā)現(xiàn)并未引起人們的關(guān)注。 如今普遍認為 CTCs是由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入血液循環(huán)中含量非常低的腫瘤細胞[18]。 在大部分惡性腫瘤患者血液中均能檢測出 CTCs，CTCs 的數(shù)量常與患者的預(yù)后密切相關(guān)[19]。 CTCs 在血液中的半衰期通常是 1.0 ～ 2.4 h[20]，這一特點使得 CTCs能夠為腫瘤的個體化治療過程提供即時的腫瘤病理進程信息，實時監(jiān)測療效。 隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤患者外周血循環(huán)中的 CTCs不僅能以單細胞形式存在，也能呈簇狀聚集形成循環(huán)腫瘤微栓[21]。 循環(huán)腫瘤微栓出現(xiàn)的機制可能有多種，包括保持 CTCs細胞間的信息交流、產(chǎn)生自分泌促轉(zhuǎn)移因子及 逃 逸 機 體 的 免 疫 應(yīng) 答[22]。 臨 床 試 驗 表 明，CTCs 是腫瘤血路轉(zhuǎn)移的重要途徑[23]。

1.3 ctDNA 1948 年，Mandel 和 Metais[24]首次 注意到外周血循環(huán)中存在一些裸露的游離 DNA 片段(cell-free DNA， cfDNA) 。 1977 年， Leon 等[25]注 意到 cfDNA 含量會隨著腫瘤治療的進程發(fā)展而出現(xiàn)波動，因此推測其中一部分 cfDNA 源自于腫瘤細胞，稱其為 ctDNA。 研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA 片段普遍短于cfDNA[26]。 但是 ctDNA 的入血機制尚不明確，目前存在3種不同的觀點:一是來自于凋亡或者壞死的腫瘤細胞；二是來自于增殖中的腫瘤細胞；三是來自于血液 中 的 CTCs[27]。 研 究 發(fā) 現(xiàn)， ctDNA 的 半 衰 期大約為 2 h， 這 使 得 以 ctDNA 為 標 志 物 實 時 監(jiān) 測 腫瘤療效成為可能[28]。

1.4 外泌體 胞外囊泡最早發(fā)現(xiàn)于網(wǎng)織紅細胞的成熟過程[29]，隨后發(fā)現(xiàn)幾乎所有類型的細胞都能正常分泌這些在細胞間起信息交流作用的胞外囊泡，并且廣泛存在于血液、尿液、膽汁、唾液和腦脊液等多種體液中[30]。 隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)這些胞外囊泡大致可以分成微囊泡、凋亡小體和外泌體3大類，其中外泌體參與多種生理病理過程逐漸成為熱門研究領(lǐng)域。 外泌體中攜帶有多種蛋白質(zhì)、活性脂質(zhì)、細胞表面受體以及信使 RNA 和微小 RNA (microRNAs，miRNAs)等，來源于腫瘤細胞的外泌體可以反應(yīng)腫瘤的蛋白質(zhì)表達譜變化和基因變異信息，外泌體能在 4 ℃ 保存 7 d 或是在-80 ℃ 保存更長時間[31]，這些特點使得外泌體可應(yīng)用于腫瘤的早期診斷和預(yù)后判斷，在臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出了強大的應(yīng)用前景[32]。

2 液態(tài)活檢常用檢測技術(shù)

2.1 腫瘤標志物分子的檢測技術(shù) 由于腫瘤標志物分子大多為蛋白質(zhì)分子，所以基本原理都是利用了蛋白質(zhì)間的相互作用這一特點。標志免疫分析法是最常用的腫瘤標志物檢測方法，通過檢測特異標志物與待測腫瘤標志物分子的結(jié)合信號來達到檢測目的，包括放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。此類方法敏感性與特異性均較好，且操作簡單、成本低。 另一類是腫瘤蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，此方法具有連續(xù)化、高通量、高敏感性和高特異性的優(yōu)點。

2.2 CTCs 的檢測技術(shù) 基于免疫吸附的 CellSearch技術(shù)，是唯一獲得美國食品藥品管理局批準應(yīng)用于臨床 CTCs 檢測 的技 術(shù)。 但 是 此 方 法主 要 依賴 于CTCs上表達的上皮細胞黏附分子，受腫瘤的異質(zhì)性和 CTCs上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響較大。 另一種是膜過濾腫瘤細胞分離法，此方法是基于 CTCs體積來實現(xiàn)細胞分離，因此較適用一些異質(zhì)性明顯的惡性腫瘤，對于一些體積小的 CTCs來說則容易得到假陰性的結(jié)果。 目前開發(fā)出了多種新一代的 CTCs檢測技術(shù)如 DEPArray 和 GILUPI CellColector 技術(shù)，在 獲 取單個 CTC 進行后續(xù)分析實驗方面具有較大優(yōu)勢[33]。

2.3 ctDNA 的檢測技術(shù) ctDNA 在血液中的含量很低，約占 cfDNA 總量的 1%，因此對檢測技術(shù)敏感性和特異性要求高。目前常用檢測技術(shù)有數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)、BEAMing 和新一代高通量基因測序等方法[34]。

2.4 外泌體的檢測技術(shù) 外泌體含量較為豐富，易于富集，常用的提取方法有超速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、免疫磁珠法、酶聯(lián)免疫吸附法和聚合法等。 Yoshioka 等[35]開發(fā)了一種快速高敏感性的外泌體檢測分析新技術(shù)，相比于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，該技術(shù)具有步驟少、耗時低、通量大等優(yōu)點。

3 液態(tài)活檢在腫瘤中的應(yīng)用

3.1 腫瘤的篩查和早期診斷 目前腫瘤的篩查多通過影像學(xué)檢查，然而影像學(xué)檢查往往難以發(fā)現(xiàn)早期腫瘤；腫瘤的確診需依據(jù)組織病理學(xué)檢驗，但獲取病變組織會給患者帶來創(chuàng)傷甚至造成醫(yī)源性腫瘤擴散。液態(tài)活檢的出現(xiàn)在一定程度彌補了臨床常規(guī)檢查的不足。 研究表明，在影像學(xué)檢查無肺癌的慢性阻塞性肺病患者中，CTCs檢測陽性的患者在 1～4年后均相繼由 CT 檢查確診為肺癌，并且發(fā)現(xiàn) CTCs異常表達上皮和間質(zhì)標志物[36]。 腫瘤早期 ctDNA檢測難度大，敏感性較低[37]。 腫瘤外泌體的分子表型可以反應(yīng)腫瘤細胞的部分表型和基因型，已有多種腫瘤特異性抗原和 miRNAs 被驗證可以作為腫瘤標志物分子，用于輔助診斷腫瘤的發(fā)生[38]。 胰腺癌血清中外泌體攜帶胰腺癌干細胞標志物，外泌體中磷脂酰肌醇蛋白聚糖 1(glypican 1，GPC1) 的檢測能區(qū)分慢性胰腺炎患者與早期和晚期胰腺癌患者，相比胰腺癌最常用的診斷血清標志物 CA19-9，GPC1＋crExos 似乎是一種更可靠的篩查工具。 在胰腺癌小鼠模型中，MRI還未檢測到胰腺疾病跡象時，GPC1＋crExos 就檢測到了胰腺癌的干細胞標志物[39]。

3.2 腫瘤治療的耐藥性檢測及實時療效監(jiān)測 乳腺癌細胞上的雌激素受體(estrogen receptor，ER) 是激素治療的一個重要靶點，但是 ER 陽性的乳腺癌細胞也可以隱藏有 ER 陰性的 CTCs從而產(chǎn)生耐藥性。 最近 Paoletti 等[40]設(shè)立了一個 CTCs 內(nèi)分泌治療指數(shù)，用于預(yù)測轉(zhuǎn)移型乳腺癌對內(nèi)分泌治療的耐藥性。 該指數(shù)綜合考慮了 CTCs 數(shù)量及其表達的ER、B 細胞淋巴瘤/白血病-2、人類表皮生長因子受體-2 和 Ki-67 的 4 種標志物對治療的影響，在指導(dǎo)治療用藥方面具有重大意義。檢測前列腺癌中CTCs上的特異性前列腺抗原與雄激素受體，有助于預(yù)測雄 激 素 受 體 靶 向 療 法 的 臨 床 結(jié) 果[41]。 檢 測ctDNA 基因突變信息可以反應(yīng)某些靶向藥物的療效，如監(jiān)測肺癌細胞表皮生長因子受體基因突變、結(jié)直腸癌細胞鼠類肉瘤病毒癌基因突變、乳腺癌細胞TP53 與 PIK3CA 基因突變以及前列腺癌雄激素受體基因突變等對療效的影響，實時監(jiān)測治療效果[20]。

3.3 腫瘤的分期及預(yù)后評估與復(fù)發(fā)風(fēng)險評價 血液系統(tǒng)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑，是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是判斷臨床分期的標準之一。在美國癌癥聯(lián)合委員會 2010 年制定的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (tumor node metastasis，TNM)分期指南中，已將缺乏影像學(xué)證據(jù)但在外周血、淋巴結(jié)和骨髓中能檢測到 CTCs 的遠處轉(zhuǎn)移時期定位為 cM0(i＋) 期，出現(xiàn)在 M0 和 M1 之間，作為 TNM 傳統(tǒng)分期系統(tǒng)的有效補充。 此外CTCs的數(shù)量與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，臨床上將每7.5 mL 外周血中 CTCs 含量作為一項獨立的預(yù)后分析因素。 在一項乳腺癌晚期患者 CTCs計數(shù)研究中發(fā)現(xiàn):CTCs≥5 個的患者腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的比例高，CTCs＜5 個的患者腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性低；并且術(shù)前CTCs≥5 個的患者腫瘤的復(fù)發(fā)率也較高[42]。 還有實驗表明，CTCs數(shù)量與腫瘤患者無病生存率和總體生存率關(guān)系密切[43]。 研究表明，外周血 ctDNA 中出現(xiàn)多拷貝的腫瘤相關(guān)基因突變?nèi)?BRF1、MTA1、DUB3 和 JAG2 都預(yù)示著腫瘤治療的臨床療效不理想[44]。 另外，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體中特異 miRNA 的水平與腫瘤狀態(tài)、分期、侵襲性及對治療的敏感性高度相關(guān)[45]。

液態(tài)活檢作為一種新興的非侵入式檢測方法，因其樣本是體液，特別是血液，取材途徑簡便，可做到隨時取樣、隨時分析、具有無滯后性并且重復(fù)性好的特點。 在腫瘤的早期診斷、病程分析、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷及復(fù)發(fā)風(fēng)險評價上展露出了強大的應(yīng)用前景，彌補了組織病理學(xué)檢查的一些短板。 盡管液態(tài)活檢的檢測技術(shù)在不斷地改進，敏感性和特異性不斷提高，然而始終未能達到理想狀態(tài)。 目前液態(tài)活檢還處于起步階段，研究分析的結(jié)果還需通過大量大規(guī)模的臨床試驗來驗證，進而推廣應(yīng)用。 隨著后基因組時代的高速發(fā)展，液態(tài)活檢將會挖掘更多的腫瘤相關(guān)的生物信息，提供更豐富、可靠的診療手段，為腫瘤患者帶來新的福音。

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Liquid biopsy for cancers

ZHONG Rongbin， WANG Youliang
(Laboratory of Cell Engineering， Institute of Biotechnology， Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071， China)

The detection of tumor-derived molecular biomarkers and cells that mainly exist in the bloodstream and other body fluids from patients with cancer， known as the liquid biopsy， which involves identified tumor markers， circulating tumor cells， circulating tumor DNA and exosomes.As an emerging kind of non-invasive molecular pathological technique， it can be used for a variety of clinical applications， including the early diagnostic of cancer， real-time monitoring of tumor progression， risk assessment of relapse and prediction of prognosis in patients with cancer.In this article，advances in the novel techniques and clinical applications as well as the challenge for liquid biopsy will be reviewed.

Liquid biopsy； Circulating tumor cells(CTCs) ； Circulating tumor DNA(ct-DNA)； Exosomes

R730.4

A

2095-3097(2017)01-0001-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.001

2016-12-18 本文編輯:張在文)

國家科技重大專項(2016ZX08006002-004)；北京市自然科學(xué)基金(7172160)

100071 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所細胞工程研究室(鐘榮斌，王友亮)