過華蕾 王文慧 邵 暢

宮頸組織HPV感染與Dicer基因表達相關性分析

過華蕾1王文慧1邵 暢2

宮頸癌；HPV感染；Dicer

在世界范圍內宮頸癌發(fā)病率位于女性腫瘤的第二位，每年有近50萬女性被確診為宮頸癌[1]。大量臨床證據(jù)與研究結果都證實人乳頭狀瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）的感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件和主要危險因素，然而HPV感染在育齡期婦女中相當常見[1]。由于微小核糖核酸（microRNA，miRNA）已被報道是潛在的癌基因或抑癌基因，作為其加工酶，Dicer也備受關注。Dicer基因在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)，最初被認為是為了抵抗病毒入侵進化而來[2]。真菌、線蟲、植物、哺乳動物以及人中均存在其同源序列，在人體中發(fā)揮作用只有Dicer1基因[3]。已有研究[4-6]表明，Dicer基因在不同種類的惡性腫瘤中表達異常。然而在宮頸正常及癌前病變的組織中，Dicer基因的表達情況尚不明確，而其表達與HPV感染的關系也未見報道。本研究收集正常宮頸標本25份，宮頸上皮內瘤變（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN）組織75份，對收集的標本進行HPVL1及Dicer1免疫組化染色，由此對HPV感染與Dicer基因表達相關性進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料選取2013年8月—2015年8月于杭州市第一人民醫(yī)院行宮頸環(huán)切術患者共100例，年齡28～62歲，平均46.8歲，無其它基礎疾病。100例患者取宮頸組織標本100份，包括HE染色確診正常宮頸組織25份、CINⅠ25份、CINⅡ25份、CINⅢ25份。

1.2 免疫組織化學法檢測HPV L1與Dicer1蛋白表達將標本進行常規(guī)脫蠟和復水。放入EDTA緩沖液中進行微波抗原修復，滴加過氧化酶阻斷溶液以阻斷內源性過氧化物酶的活性，正常羊血清封閉，分別滴加一抗配置濃度均為1∶100，4℃過夜。次日依次加生物素標記的二抗和鏈霉親和素-辣根過氧化物酶結合的復合物一起孵育。3，3-二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精-伊紅復染，脫水、透明、封固。免疫組化結果由兩位高年資病理科醫(yī)師判讀。陽性染色為棕黃色顆粒，特異性位于細胞漿內，隨機選擇5個高倍視野（400倍）計數(shù)陽性細胞數(shù)，至少計數(shù)1000個細胞。參照文獻[3]綜合計分法（綜合陽性細胞所占比例和染色強度），在高倍鏡下對細胞內反應如下評分：（1）無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。（2）陽性范圍：＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。將兩種評分結果相加，分數(shù)分為4個等級：0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（1+），3～4分為中度陽性（2+），5～7分為強陽性（3+）。弱陽性、中度陽性和強陽性例數(shù)之和作為陽性總數(shù)。按綜合評分的等級來評價蛋白變化情況。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組陽性表達率比較用卡方檢驗或Fisher＇s精確概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常組織HPV感染與Dicer基因表達情況的關系25份正常宮頸組織中HPV L1陰性8份（32.0%），其中Dicer1陰性表達7份（87.5%），Dicer1陽性表達1份（12.5%）；HPV L1陽性17份（68.0%），其中Dicer1陰性表達2份（11.76%），Dicer1陽性表達15份（88.24%）。對HPV L1與Dicer1表達相關性進行卡方檢驗，證明HPV L1與Dicer1的表達呈明顯的正相關（χ2=10.445，P＜0.001）。正常宮頸組織HPV感染伴隨Dicer的表達，Dicer在HPV陰性的組織低表達（見封三圖1）。

2.2 宮頸上皮內瘤變組織HPV感染與Dicer基因表達的關系75例宮頸上皮內瘤變組織（其中CINⅠ25例、CINⅡ25例、CINⅢ25例）中HPV L1陽性75例（100%）。25例CINⅠ組織中，Dicer1陽性表達19例（76%）；25例CINⅡ組織中，Dicer1陽性表達20例（80%）；25例CINⅢ組織中，Dicer1陽性表達25例（100%）。宮頸上皮內瘤變組織HPV感染伴隨Dicer表達，隨著病變程度增加Dicer表達的范圍和量亦增加（見封三圖2）。

3 討論

宮頸癌發(fā)生、發(fā)展一般經(jīng)過鱗狀上皮增生-不典型增生-原位癌-浸潤癌的緩慢過程[7]。大量的研究已經(jīng)表明，高危型HPV感染是宮頸癌的主要病因。本研究結果亦顯示，在宮頸癌前病變患者中，HPV陽性率明顯高于正常組。近年來得益于宮頸涂片篩查與HPV疫苗的應用，宮頸癌的發(fā)病率有所下降。在我國，由于篩查尚未普及，疫苗的應用也有待于臨床試驗的完成，宮頸癌仍是嚴重威脅女性健康的疾病之

一[8]。

近幾年，miRNA與多系統(tǒng)腫瘤的相關研究成為熱點，Dicer和Drosha均屬于核糖核酸內切酶-Ⅲ（RNase-Ⅲ）家族成員，在miRNA的合成與成熟過程中起到重要作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。Dicer同時負責miRNA和干擾核糖核酸（Small Interfering RNA，siRNA）的產(chǎn)生[9]。其中miRNA參與調節(jié)細胞增殖、分化與凋亡，參與個體發(fā)育、機體代謝以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程[10]。Dicer基因在不同種類的惡性腫瘤中均有異常表達，其中有報道表明，Dicer基因在前列腺癌、肺腺癌、結直腸癌中高表達[11-13]，但卻在卵巢癌、乳腺癌、肝細胞癌中低表達[14-16]。上述資料可以看出Dicer基因在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著不同的角色，這也可能直接參與了不同類型腫瘤中不同的miRNA表達譜情況。本研究結果顯示，宮頸上皮內瘤變組織Dicer表達增強，隨著病變程度增加Dicer表達的量亦增加。已有研究[17]結果顯示，在宮頸癌患者組織標本中，Dicer基因在蛋白及基因水平均呈高表達，且Dicer基因表達水平較低的患者往往具有更短的生存期，更差的預后。Dicer基因可能具備對抗宮頸癌進展的作用，其機制可能是通過其相應miRNA的作用，引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯從而使癌基因表達上調或者下降。

而作為Dicer的另一種產(chǎn)物-siRNA，它的作用是參與生物體抵抗病毒的防御系統(tǒng)，如抵抗人缺陷免疫病毒（human immunodeficiency virus，HIV），甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）等[18-19]。在哺乳動物的研究過程中，siRNA介導的RNA干擾技術成為了功能基因研究的一個有利工具,為我們認識人類基因功能、抵抗病毒感染提供了理論依據(jù)和技術基礎。而HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件和主要危險因素，Dicer基因對抗宮頸癌進展的作用機制可能與其病毒防御功能相關。

本研究顯示，在人類宮頸組織HPV感染伴隨Dicer基因的表達，Dicer在HPV陰性的組織中低表達。在宮頸上皮內瘤變組織中，隨著病變程度的增加，Dicer表達的范圍和量亦增加。這是首次在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)Dicer基因和HPV病毒感染相關。本研究提示，Dicer基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過程中起重要作用，為探討宮頸癌發(fā)病機制和靶向治療提供了新的思路。近年來已認識到miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及演進中發(fā)揮重要作用，因而以RNA干擾為基礎的基因沉默技術是治療癌癥的另一種方法。Dicer基因在此過程中可能成為關鍵性的靶點。在不同的腫瘤細胞中，Dicer基因的異常表達情況是十分復雜的。腫瘤的形成是多個細胞信號調節(jié)通路及其網(wǎng)絡異常的結果，雖然Dicer基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和機制尚未完全明確，但它可能作為腫瘤治療的靶分子。隨著相關研究的進展，Dicer基因可能使腫瘤的治療邁出新的一步。

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（收稿：2016-03-12修回：2017-02-09）

1杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科（杭州310008）；2杭州市第一人民醫(yī)院病理科（杭州310006）

過華蕾，E-mail：jane__123@163.com