陳致印++何佳慧++許澤文

摘 要：該文以早竹竹葉為研究對象，pH7.8的磷酸緩沖溶液為提取劑，采用微波提取法，并用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)含量，在料液比、提取時間、提取溫度、微波功率等單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行L9（34）正交試驗設(shè)計，優(yōu)化了微波提取早竹竹葉蛋白的工藝參數(shù)。結(jié)果表明：各因素對早竹竹葉蛋白質(zhì)的提取率的影響順序依次為：微波時間>微波溫度>微波功率>料液比。微波提取早竹竹葉蛋白的最佳工藝條件為：料液比為1∶25，微波時間為8min，微波溫度為54℃，微波功率為500W，在此最佳條件下，提取率為8.07%。

關(guān)鍵詞：早竹竹葉；蛋白質(zhì)；微波

中圖分類號 S795 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）24-0103-04

Optimization of Microwave Assisted Protein Extraction from Phyllostachys praecox Bamboo Leaves

Chen Zhiyin et al.

（College of Agriculture and Biotechnology，Hunan University of Humanities，Science and Technology，Loudi 417000，China）

Abstract：Taking the leaves of Phyllostachys praecox bamboo as material，phosphate buffer solution as extract solvent，and the protein content was determined by Coomassie Brilliant Blue Staining. On the basis of single factor tests of solid-liquid ratio，microwave time，microwave temperature and microwave power，L9（34）orthogonal experiment was used to optimize the extraction of Phyllostachys praecox bamboo leaves. The results showed that the effect of the investigated factors on the extraction yield of Phyllostachys praecox bamboo leaves protein was in sequence of microwave time，microwave temperature，microwave power，solid-liquid ratio.The optimum conditions of microwave-assisted extraction of Phyllostachys praecox bamboo leaves protein were：solid-liquid was 1∶25，microwave time was 8min，microwave temperature was 54℃，microwave power was 500W. Under these circumstances，the extraction rate of Phyllostachys praecox bamboo leaves protein reached 8.07%.

Key words：Phyllostachys praecox bamboo leaves；Protein；Microwave

早竹（Phyllostachys praecox）為禾本科剛竹屬植物，筍期在3月下旬至4月上旬或更早，故稱為早竹。經(jīng)周兆祥研究[1]發(fā)現(xiàn)早竹竹葉中含有機酸、酚類化合物、蛋白質(zhì)、多糖等有機物，且富含鈣、硅等礦物元素，其豐富的化學(xué)成分使其具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂等[2]生物功能。目前對早竹竹葉的研究大多數(shù)側(cè)重在糖類、葉綠素、黃酮、竹葉的抗氧化活性及天然竹葉飲料[3]等方面，而關(guān)于竹葉蛋白則少有研究，近年竹葉蛋白被發(fā)現(xiàn)有抗菌[4]、防霉、防腐[5-6]等功能，如何提高竹葉蛋白質(zhì)的提取率，成為了近年來研究的熱點。本文以早竹竹葉為試材，以料液比、微波時間、微波溫度和微波功率為考察因素，研究微波提取方法對早竹竹葉蛋白得率的影響，以期為工業(yè)開發(fā)竹葉蛋白提供理論依據(jù)[7]。

1 材料和儀器

1.1 材料 早竹竹葉粉由采摘自婁底人文科技學(xué)院毓師園的早竹竹葉晾干制成粉，過80目篩。蒸餾水、磷酸氫二鈉（分析純）、牛血清白蛋白（生化試劑）、硼酸、溴甲酚綠：國藥集團化學(xué)試劑有限公司、磷酸二氫鈉（分析純）：湖南匯虹試劑有限公司、氫氧化鈉：天津市化學(xué)試劑工廠、硫酸鉀：臺山市粵僑試劑塑料有限公司、硫酸銅：國藥集團化學(xué)試劑有限公司、無水碳酸鈉：西隴化工股份有限公司、鹽酸：衡陽市信凱化工試劑、濃硫酸：湖南匯虹試劑有限公司、考馬斯亮藍G-250：天津市光復(fù)精細化工研究所、無水乙醇：湖南匯虹試劑有限公司、溴甲酚綠：國藥集團化學(xué)試劑有限公司、甲基紅：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器 101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司、XEB-400型高速中藥粉碎機：吉首市中誠制藥機械廠、UVmini-1240島津紫外可見分光光度計、KDN系列凱氏定氮儀、Multwave PRO安東帕微波消解儀、SHIMADZU AUW120D十萬分之一分析天平、SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵：鄭州英峪予華儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 工藝流程 工藝流程如下：采集新鮮的早竹竹葉→洗凈晾干、在45℃的鼓風(fēng)干燥機中烘24h→中藥粉碎機打粉→過80目篩→早竹竹葉樣品→PBS磷酸緩沖溶液浸泡0.5h[8]→微波提取→過濾→考馬斯亮藍法測定吸光度→計算蛋白質(zhì)得率。

2.2 單因素試驗 稱取早竹竹葉粉1g，以pH 8.4磷酸緩沖液為提取劑，按料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35添加磷酸緩沖液，溫度分別為46℃、48℃、50℃、52℃、54℃，微波時間分別為2min、4min、6min、8min、10min，功率分別為200W、300W、400W、500W、600W的情況下，浸泡0.5h，過濾，得濾液，在595nm下用紫外分光光度計測吸光度，測定蛋白質(zhì)得率。

2.3 正交試驗 在單因素的基礎(chǔ)上，采用L9（34）進行正交實驗，進一步研究料液比、溫度、時間、功率的變化對蛋白質(zhì)提取率的影響。

2.4 蛋白質(zhì)的測定

2.4.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取100mg牛血清蛋白，用蒸餾水配置成1 000mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，取6支10mL干凈的具塞試管分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補充至1mL，分別加入5mL考馬斯亮藍溶液，搖勻，反應(yīng)2min，用1cm比色皿在595nm下測定吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

2.4.2 早竹竹葉中蛋白質(zhì)總含量的測定 采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)總含量[9]。

2.4.3 早竹竹葉蛋白提取率的測定 計算公式如下：提取率（%）=提取蛋白質(zhì)的質(zhì)量/蛋白質(zhì)的總質(zhì)量×100

3 結(jié)果與分析

3.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 在595nm波長下測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、牛血清蛋白濃度（x）為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）及回歸方程：A=0.7646x-0.008，R2=0.999 1。

3.2 蛋白質(zhì)總含量 用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，測得早竹竹葉中的蛋白質(zhì)含量為10.757%。毛燕、王學(xué)利[10]等利用凱氏定氮法研究過9種竹葉中的蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果表明這9種竹葉中蛋白質(zhì)平均含量為13.6%，不同品種的竹葉蛋白質(zhì)含量差異也較大，其中白哺雞竹葉的蛋白質(zhì)含量高達18.25%，石竹的蛋白質(zhì)含量為10.81%，金竹的蛋白質(zhì)含量為10.63%，芽竹的蛋白質(zhì)含量為10.88%。與本試驗測定的10.75%數(shù)值相近。

3.3 單因素試驗結(jié)果

3.3.1 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響 不同的料液比對早竹竹葉蛋白的提取效果不同，從圖2可以看出，在1∶15～1∶25蛋白質(zhì)提取率有較大的提升，當(dāng)料液比過大時，溶劑太少，浸提不夠充分，可能有部分蛋白質(zhì)沒有溶解，影響提取率，而隨著溶劑的增加，體系在中的粘度降低，便于蛋白質(zhì)溶解；1∶25時蛋白質(zhì)的提取率達到最大，為7.51%；當(dāng)料液比的比值繼續(xù)下降時候蛋白質(zhì)的提取率反而下降，這可能是因為溶劑的量過大，導(dǎo)致蛋白濃度下降。

3.3.2 提取溫度對早竹竹葉蛋白質(zhì)的影響 從圖3可以看出，隨著提取溫度的升高早竹竹葉蛋白的提取率逐漸增高，這是因為隨著溫度的增加，體系中的熵值增加，蛋白質(zhì)加速溶解和擴散，當(dāng)溫度達到52℃時，蛋白質(zhì)的提取率達到最高，為6.76%。隨著溫度的繼續(xù)增加早竹竹葉蛋白的提取率反而下降，可能是溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解。因此，提取溫度以52℃左右為宜。

3.3.3 時間對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖4可知，從2～4min，早竹竹葉蛋白的提取率迅速上升，在4min時達到提取率的峰值，為7%；隨著時間的延長，蛋白質(zhì)的提取率緩慢下降。這說明在第4min時，蛋白質(zhì)的提取基本完成，繼續(xù)微波會導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解、變質(zhì)，且長時間的微波會使水分過分蒸發(fā)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶出減少，反而使得率緩慢下降，故選取4min、6min和8min進行正交試驗。

3.3.4 提取功率對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖5可知，從200W開始隨著功率的增加早竹竹葉蛋白質(zhì)的提取率緩慢上升，到400W時，蛋白質(zhì)的提取率達到最大為6.946%，而后隨著提取功率的增加，蛋白質(zhì)的提取率逐漸下降，這可能是因為微波處理技術(shù)是將微波電磁能轉(zhuǎn)化成熱能，利用微波整體受熱的特點，促使細胞膜破裂，加速蛋白質(zhì)的滲透及溶解。當(dāng)功率過高時，受熱過快，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分解，且受熱過快，易導(dǎo)致暴沸，使得提取物粘連在管壁上，影響到蛋白質(zhì)溶解在溶液中，故提取功率為400W。

3.4 正交實驗 根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，設(shè)計（L9（34））正交表，詳見表1（表2）。由表2可知，根據(jù)極差的數(shù)值大小，可知微波法提取早竹竹葉蛋白質(zhì)中，各因素對早竹竹葉蛋白質(zhì)的影響大小順序為微波時間>微波溫度>微波功率>料液比，微波時間對蛋白質(zhì)的影響最大，在提取時間8min時，蛋白質(zhì)的得率最高。這可能是因為微波對細胞壁有穿透作用，且微波附帶著的熱量能使蛋白質(zhì)溶解在溶劑中，隨著微波時間的增加，物質(zhì)吸收的波能越多，固液傳質(zhì)的速度越快，即更多的蛋白質(zhì)溶解在提取介質(zhì)中。綜合各因素的作用，微波法提取早竹竹葉蛋白的最佳條件是A1B3C3D3，即在料液比為1∶20，微波溫度為54℃，微波功率為500W的條件下微波8min，蛋白質(zhì)的提取率為8.07%。

3.5 驗證試驗 為驗證所選工藝的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，精確稱取1.00g早竹竹葉粉末，在最佳提取工藝參數(shù)下進行3次平行驗證試驗，得出蛋白質(zhì)的平均提取率為8.03%，RSD值為0.56%。表明該工藝穩(wěn)定可行。

4 結(jié)論與討論

通過本試驗確定了微波法提取早竹竹葉蛋白的最佳工藝參數(shù)，通過單因素試驗法確定了料液比、溫度、時間和功率4個因素的取值范圍，并得出影響蛋白質(zhì)提取率的因素大小為微波時間>微波溫度>微波功率>料液比，正交試驗得出最佳工藝參數(shù)組合：料液比為1∶20，溫度為54℃，功率為500W，微波時間為8min，早竹竹葉蛋白質(zhì)的提取率為8.07%。實驗結(jié)果低于陳學(xué)仕等[11]利用微波法提取茶葉蛋白質(zhì)的提取率11.26%以及扶慶全等[12]利用微波輔助提取紅豆蛋白的提取率93.56%，這可能是因為實驗材料不同，也可能是因為在扶全慶等進行試驗時將pH作為單因素，而本試驗沒有將pH的影響考慮在內(nèi)。

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