夾脊電針聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍對(duì)大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

李曉寧，梁雪松，遲蕾，劉雙嶺，臧召霞，李諾，梅繼林

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

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夾脊電針聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍對(duì)大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

李曉寧1，梁雪松2，遲蕾2，劉雙嶺1，臧召霞3，李諾2，梅繼林2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：探討夾脊電針聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍治療對(duì)大鼠急性脊髓損傷后受損組織的病理學(xué)改變及神經(jīng)細(xì)胞凋亡表達(dá)的影響。方法：Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，用改良Allen’s打擊法制成脊髓損傷模型，分別進(jìn)行HE和TUNEL染色，檢測(cè)大鼠受損組織病理形態(tài)學(xué)的改變及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的表達(dá)。結(jié)果：HE染色顯示，急性脊髓損傷組大鼠1 d時(shí)出血明顯，3 d時(shí)神經(jīng)細(xì)胞破壞最明顯，7 d時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有所減輕，14 d時(shí)凋亡已不明顯，尤以?shī)A脊電針聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍組神經(jīng)細(xì)胞保存較完好。TUNEL染色顯示，與急性脊髓損傷組相比，術(shù)后3 d、7 d、14 d，急性脊髓損傷+夾脊電針組、急性脊髓損傷+甲基強(qiáng)的松龍組、急性脊髓損傷+夾脊電針治療+甲基強(qiáng)的松龍組、急性脊髓損傷+抑制劑組神經(jīng)細(xì)胞凋亡均減少(P<0.05)。術(shù)后7 d、14 d，急性脊髓損傷+夾脊電針治療+甲基強(qiáng)的松龍組神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少明顯(P<0.05)。結(jié)論：急性脊髓損傷后7 d、14 d時(shí)，夾脊電針聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍可以抑制大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)異常改變。

急性脊髓損傷；大鼠；夾脊電針；甲基強(qiáng)的松龍

急性脊髓損傷(acute spinal injury，ASCI)是臨床上的常見(jiàn)且嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅著患者的健康和生命[1]。目前國(guó)際通用的指南推薦中提到ASCI患者早期大劑量給予糖皮質(zhì)激素是治療本病的首選治療方案，但因其副作用較大，常常伴有嚴(yán)重并發(fā)癥，而未得到患者的廣泛認(rèn)可[2]。隨著近些年對(duì)急性脊髓損傷深入研究，夾脊電針作為一種傳統(tǒng)的康復(fù)治療手段，在臨床應(yīng)用和實(shí)踐中取得了較好的療效，本研究從時(shí)效性觀察夾脊電針聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍對(duì)大鼠急性脊髓損傷后受損組織的病理形態(tài)學(xué)改變及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，探討其治療急性脊髓損傷的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

144只Wistar雌性大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，隨機(jī)平均分為6組：假手術(shù)組(Sham組)、急性脊髓損傷組(ASCI組)、急性脊髓損傷+夾脊電針治療組(EA組)、急性脊髓損傷+甲基強(qiáng)的松龍組(MP組)，及急性脊髓損傷+夾脊電針治療+甲基強(qiáng)的松龍組(EA+MP組)，急性脊髓損傷+抑制劑組(MDL28170組)，每組再分為1天、3天、7天、14天四個(gè)亞組。每個(gè)亞組為6只。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

1.2.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器 見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器

1.2.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑及生產(chǎn)公司 見(jiàn)表2。

表2 主要試劑及其生產(chǎn)公司

1.2.3 主要配制試劑及其配制方法 見(jiàn)表3。

表3 主要配制試劑及其配制方法

1.3 造模方法

采用美國(guó)Impactor Model-Ⅲ spinal cord contusion system 打擊器，計(jì)算機(jī)程控下精確打擊制作大鼠 ASCI 模型(T10,中度損傷)。用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 ml/kg)，俯臥固定，選取后背正中切口，將大鼠固定于打擊器基座上，打擊棒以10 g×50 mm勢(shì)能撞擊以T10為中心段脊髓，造成該段的急性脊髓中度損傷，生理鹽水沖洗傷口及清除殘留血液，傷口部位常規(guī)分層縫合，選擇BBB評(píng)分在1～3分入組。

1.4 治療方法

Sham組：手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，正常捆綁，其余不予任何處置。

ASCI組：模型制備成功后單籠飼養(yǎng)，正常捆綁，其余不予任何處置。

EA組：于模型制備成功后3 h進(jìn)行夾脊電針早期干預(yù)治療，此后每日1次，直至療程結(jié)束。針刺穴位選取T9、T11節(jié)段夾脊穴。將0.35 mm×13 mm毫針直刺入所選穴位下4～5 mm，給予電針儀脈沖連續(xù)波，脈沖寬度：(0.5±0.15)ms，頻率為100 Hz，脈沖峰值為Vp1≥(40±10) V(在500 Ω負(fù)載下)，刺激時(shí)長(zhǎng)為30 min/次/日。

MP組：術(shù)后30 min時(shí)，給予實(shí)驗(yàn)大鼠一次性注射甲基強(qiáng)的松龍。甲基強(qiáng)的松龍按30 mg/kg，與0.9 g/L生理鹽水配置成0.5 ml注射液，給予大鼠腹腔注射；正常捆綁，其余不予任何處置。

EA+MP組：夾脊電針治療方法同上，治療次數(shù)同上；甲基強(qiáng)的松龍用法與治法同上。正常捆綁，其余不予任何處置。

MDL28170組：術(shù)后30 min腹腔注射MDL 28170(1 mg/kg)，此后每天同一時(shí)間點(diǎn)分別注射，直到療程結(jié)束。正常捆綁，其余不予任何處置。

1.5 取材

大鼠在實(shí)驗(yàn)治療結(jié)束后，依照相對(duì)應(yīng)打擊損傷時(shí)間進(jìn)行麻醉，然后斷頭處死，于冰盒上快速取出損傷處脊髓，長(zhǎng)度約4 cm，從損傷中心處迅速切開(kāi)，置入4%多聚甲醛緩沖液中固定后4℃冰箱待測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)

組織病理學(xué)形態(tài)變化：經(jīng)切片脫蠟至水、染色、脫水、透明、封片、鏡檢等步驟進(jìn)行HE染色并鏡下觀察。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡：經(jīng)透化、PBS漂洗、封閉、Labeling、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片鏡檢等步驟觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HE染色觀察脊髓組織病理學(xué)形態(tài)變化

ASCI組大鼠1 d時(shí)出血明顯，可見(jiàn)大量凋亡神經(jīng)細(xì)胞；3 d時(shí)細(xì)胞破壞最明顯，可見(jiàn)大量凋亡神經(jīng)細(xì)胞，核仁消失，核固縮；7 d時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有所減輕，神經(jīng)細(xì)胞壞死，正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；14 d時(shí)凋亡已不明顯，可見(jiàn)空泡存在，其余4治療組神經(jīng)細(xì)胞損傷情況較ASCI組明顯減輕，尤以EA+MP組神經(jīng)細(xì)胞保存較完好。

圖1 各組大鼠的HE染色 (200×)注：B.ASCI組；C.EA組；D.MP組；E.EA+MP組；F.MDL組；1. 1 d時(shí)間點(diǎn)；2. 3 d時(shí)間點(diǎn)；3. 7 d時(shí)間點(diǎn)；4. 14 d時(shí)間點(diǎn)。

2.2 TUNEL法檢測(cè)脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡

TUNEL檢測(cè)可見(jiàn)，Sham組未見(jiàn)明顯神經(jīng)細(xì)胞凋亡，與EA組、MP組、EA+MP組、MDL28170組相比，具有顯著差異(P<0.05)。與ASCI組相比，術(shù)后3 d、7 d、14 d，EA組、MP組、EA+MP組、MDL28170組神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，差異顯著(P<0.05)。與EA組、MP組、MDL28170組比較，術(shù)后7 d、14 d，EA+MP組神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，差異顯著(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

組別1d3d7d14dSham1.83±0.983.00±1.672.17±1.172.00±1.26ASCI7.67±3.2021.50±1.8718.33±2.3414.33±4.76EA9.00±1.7912.83±2.32▲10.67±2.73▲8.50±5.82▲MP9.67±2.1613.00±2.00▲10.83±2.23▲9.33±3.39▲EA+MP8.67±1.6311.17±3.31▲7.50±3.39▲△2.50±1.05▲△MDL6.50±1.8711.50±1.87▲10.33±2.25▲8.50±1.05▲F11.67841.50927.78910.755P<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與ASCI組比較，▲P<0.05；與EA組、MP組和MDL組比較，△P<0.05。

3 討論

急性脊髓損傷嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，其致殘率和死亡率極高?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致急性脊髓損傷肢體功能障礙的主要原因之一，其機(jī)制包括血管痙攣、血栓形成、微循環(huán)障礙、水腫、自由基形成、興奮性氨基酸生成等[3]。近年研究證實(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致神經(jīng)元大量丟失是引發(fā)急性脊髓繼發(fā)性損傷的重要病理機(jī)制。他通過(guò)兩個(gè)階段發(fā)揮作用：初始階段，凋亡伴隨著壞死發(fā)生；晚期階段，則主要局限于白質(zhì)中包括少突膠質(zhì)細(xì)胞[4]，受損細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生變化，影響各種促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的因子的表達(dá)[5]。甲基強(qiáng)的松龍是目前治療脊髓損傷的常用藥物，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)其治療ASCI作用機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究，研究表明甲基強(qiáng)的松龍具有多方面的神經(jīng)保護(hù)作用，包括改善微循環(huán)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、減少細(xì)胞鈣內(nèi)流、維持神經(jīng)元興奮性等[6-8]。張強(qiáng)，廖維宏等[9]利用原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP標(biāo)記法及免疫組化SP法觀察大劑量應(yīng)用甲基強(qiáng)的松龍對(duì)大鼠脊髓損傷區(qū)細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)早期應(yīng)用大量甲基強(qiáng)的松龍不僅減輕大鼠脊髓損傷后脊髓水腫、微環(huán)境改變，而且可以阻止或減輕脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性脊髓損傷的病機(jī)為督脈受損，導(dǎo)致與其及相關(guān)聯(lián)的經(jīng)絡(luò)、臟腑功能紊亂，病位主要與督脈、腎經(jīng)有關(guān)[10]。夾脊電針是中醫(yī)治療急性脊髓損傷的重要手段，夾脊穴循行于脊柱，內(nèi)夾督脈，外循膀胱，其下為脊神經(jīng)后支及靜脈分布，電刺激可直接作用于脊髓及包膜，形成電場(chǎng)可改善損傷區(qū)微環(huán)境，促進(jìn)脊髓纖維再生。王振宇,孫忠人等[11-12]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察電針夾脊穴對(duì)脊髓損傷大鼠皮層體感誘發(fā)電位的影響及其對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的促進(jìn)作用，發(fā)現(xiàn)電針夾脊穴對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)起促進(jìn)作用，先期電針干預(yù)的效果好于后期。李曉寧等[13]觀察夾脊電針對(duì)大鼠脊髓繼發(fā)性損傷后c-fos mRNA及BNIP3 mRNA表達(dá)及其變化規(guī)律的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了夾脊電針能促進(jìn)脊髓損傷后功能的恢復(fù)及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立ASCI大鼠模型，應(yīng)用MP及MDL28170作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，對(duì)比分析夾脊電針與MP、MDL28170對(duì)ASCI大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，證實(shí)了在急性脊髓損傷后7 d、14 d時(shí)，EA+MP可以抑制大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)異常改變，在治療ASCI上優(yōu)于兩者單獨(dú)治療，為臨床治療急性脊髓損傷患者提供新思路。

[1] Lu J,Ashwellk Waite P.Advence insecondary spinal cord injury role of apoptosis[J].Spine,2000,25:1859-1860.

[2] Stevens RD,Bhardwaj A,K irsh JR,et al.Critical care and perioperative management in traumatic spinal cord injury[J].Journal of Neurosurgical Anesthesiology,2003,15(3):215-229.

[3] Rink A，F(xiàn)ung KM，Trojanowski JQ，et al.Evidences of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injure in the rat[J].Am J Pathol,1995,147:1575-1583.

[4] CashaS,Yu WR,Fehlings MG.FAS deficiency reduces apoptpsis,spares axons and improves function after spinal cord injury [J].Exp Neurol,2005,196:390-400.

[5] Guo Q,Li S,Su B,et al.Expression of oligodendrocyle myelin glycoprotein andits receptor NgR after the injury of rat central nervous system[J].Neuroscience Letters,2007,422(2):103-108.

[6] Madsen JR,Macdonald P,Irwin N,et al.Tacrolimus(FK506) increases neuronal expression of GAP-43 and improves functional recovery after spinal cord injury in rats[J].Exp Neurol, 1998,154:673-683.

[7] Gabler C,Clinical experiences and result of high dosage methylprednisolone therapy in spinal cord trauma[J].Spine,1995,20:20-27.

[8] Gerndt SJ,Rordriguez JL,Pawli JW,et al.Consequences of high-dose steroid therapy for acute spianl cord injury[J].J Trauma,1997,42:2279-2284.

[9] 張強(qiáng),吳越,廖維宏,等.大劑量甲基強(qiáng)的松龍對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].中華創(chuàng)傷雜志,2001,17(2):89-92.

[10] 尹洪娜，孫忠人，李全.電針夾脊穴對(duì)脊髓損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CHOP影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥信息，2016,33(4):35-38.

[11] 王振宇,孫忠人,劉睿姝.電針夾脊穴對(duì)脊髓損傷大鼠皮層體感誘發(fā)電位的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2009,15(10):938-941.

[12] 尹洪娜，孫忠人，李全.電針夾脊穴對(duì)脊髓損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子Caspase-12影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016,44(3):33-36.

[13] 李曉寧,張良,楊慶紅,等.夾脊電針對(duì)脊髓損傷大鼠c-fosmRNA及BNIP3 mRNA表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].針灸臨床雜志,2015,31(7):83-86.

國(guó)家自然科學(xué)基金(面上)項(xiàng)目(No.81373715)

李曉寧(1969-)，女，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

2016-09-05

R246

A

1002-2406(2017)01-0092-04

修回日期：2016-10-04