南懷燕，孫尚琛，胡 巍，李文新，王永剛，劉曉風(fēng)，冷非凡

（1.蘭州蘭石能源裝備工程研究院有限公司，甘肅 蘭州 730314；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

微生物發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇的研究

南懷燕1，孫尚琛1，胡 巍1，李文新1，王永剛2，劉曉風(fēng)2，冷非凡2

（1.蘭州蘭石能源裝備工程研究院有限公司，甘肅 蘭州 730314；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

目前，隨著全球非可再生資源的不斷消耗及因此引起的環(huán)境問(wèn)題和公眾衛(wèi)生問(wèn)題，清潔、高效、環(huán)保型的新興能源已成為諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?；谏镆掖嫉目沙掷m(xù)性與環(huán)保性，通過(guò)微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)纖維素乙醇已成國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。該綜述歸納了可發(fā)酵纖維素生產(chǎn)乙醇的微生物種類(lèi)及其代謝途徑，以期為纖維素乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)提供菌種支撐，為我國(guó)可再生能源的發(fā)掘提供理論基礎(chǔ)。

微生物；木質(zhì)纖維素；嗜溫耐熱菌；燃料乙醇；發(fā)酵

由于全球能源消耗量的不斷上升，低成本化石燃料的損耗和氣候的不斷惡化，研究開(kāi)發(fā)可再生能源和環(huán)境友好型能源是解決以上問(wèn)題的必經(jīng)之路[1][2]。目前，以技術(shù)性、經(jīng)濟(jì)性、環(huán)境性、穩(wěn)定性為原則已提出許多潛在的可替換燃料，如：生物乙醇，生物丁醇，生物柴油，甲醇，氫，壓縮天然氣（CNG），生物沼氣和太陽(yáng)能燃料等[3]。

在諸多替代燃料中，生物乙醇被證明是最有潛力的化石燃料替代物。其不僅可減少溫室氣體、致癌物質(zhì)的排放，還可以縮減一部分生產(chǎn)成本[4,5]。

微生物產(chǎn)酶發(fā)酵纖維素是生產(chǎn)生物乙醇的一條重要途徑[6]。嗜溫耐熱微生物因具有較好的耐酸和耐鹽性，使其能更高效率地利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)（LCB）[7,8]。本文就可產(chǎn)酶催化生產(chǎn)乙醇的微生物種類(lèi)及其代謝途徑展開(kāi)論述，以期為纖維素乙醇的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供一定的技術(shù)與理論參考。

1 、產(chǎn)乙醇微生物

在發(fā)酵工業(yè)中，污染是造成乙醇產(chǎn)量低和抑制化合物生成的主要原因，而低pH、高溫度和耐酒精是解決污染問(wèn)題的有效途徑[9]。嗜溫微生物作為發(fā)酵工藝的推動(dòng)者因其能在較高溫度下保持高活性的生長(zhǎng)狀態(tài)及能發(fā)酵各種纖維素生物質(zhì)原料產(chǎn)生化學(xué)品燃料成為生物乙醇研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。其中嗜中溫菌或單一嗜熱中溫菌的最適生長(zhǎng)溫度為50-64℃，極端嗜熱菌的最適生長(zhǎng)溫度為65-79℃，超嗜熱菌的最適生長(zhǎng)溫度高于80℃[10]。以下是幾種耐熱和嗜熱產(chǎn)乙醇菌。

1.1 梭菌屬

梭菌屬是最早被發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)乙醇菌，屬于梭菌科家族（Clostridiace）。Ng等[11]研究梭菌屬熱纖維LQRI和熱硫化氫39E在以一些纖維（如MN300纖維素、微晶纖維素、濾渣、二氧化硫處理的木材和蒸汽爆裂木材纖維）為底物共培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)MN300纖維素的最高乙醇產(chǎn)量為0.46g/g。熱纖維梭菌SS19在最適培養(yǎng)基（濾紙45g/L，玉米漿8g/L，半胱氨酸氯化物0.25g/L，硫酸亞鐵0.01g/L）條件下的乙醇產(chǎn)量為0.41g/g[12]。

1.2 桿菌屬

熱解糖桿菌，之前被稱(chēng)為熱解糖熱厭氧桿菌，屬于厚壁菌門(mén)的嗜熱桿菌。熱解糖梭菌JW/SL-YS485在溫度45-65℃和pH4.0-6.5下，能直接發(fā)酵半纖維素和木聚糖聚合物，以及纖維生物質(zhì)中的主要糖類(lèi)（纖維二糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖）[13]。Sveinsdottir等發(fā)現(xiàn)用熱厭氧桿菌 AK17發(fā)酵纖維素、草和木屑時(shí)的乙醇產(chǎn)量分別為1.20、0.98和0.15g/L。Sigurbjornsdottir和Orlygss-on[14]從冰島的熱泉中分離出能生產(chǎn)乙醇的桿菌屬嗜熱微生物AK54 。

1.3 高溫厭氧桿菌屬

高溫厭氧桿菌屬屬于厚壁菌門(mén)，胞內(nèi)含有醇脫氫酶和木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與維生素B12的生物合成途徑，還可以改變戊糖代謝途徑，是已報(bào)到的在發(fā)酵領(lǐng)域最有應(yīng)用前景的微生物[15]。Georgieva和Ahring[16]發(fā)現(xiàn)在70℃的一個(gè)連續(xù)固定化反應(yīng)器中用熱厭氧桿菌BG1L1發(fā)酵玉米漿產(chǎn)生乙醇的產(chǎn)量為0.39-0.42g/g。

有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)微生物共培養(yǎng)能提高乙醇的產(chǎn)量。己糖發(fā)酵中的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和戊糖發(fā)酵中的戊糖球菌（T.pentosaceus）通過(guò)共培養(yǎng)的方式發(fā)酵油菜秸稈，最終的乙醇量是理論值的85%，分別比酵母和細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)發(fā)酵高出14%和50%[17]。

1.4 釀酒酵母菌屬

釀酒酵母具有安全性好、高產(chǎn)量和高的抑制劑耐受性等優(yōu)點(diǎn)，在纖維素生物乙醇的生產(chǎn)中具有重要作用[18]。

1.4.1 克魯維酵母屬

克魯維酵母菌是酵母科的子囊菌類(lèi)酵母屬。此類(lèi)菌種最主要的特性是在高溫下可廣泛地利用糖基質(zhì)（阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、木糖）來(lái)生產(chǎn)乙醇[19]。Kumar等[20]報(bào)道了克魯維酵母菌IIPE453在以葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、蔗糖等為底物的發(fā)酵活性進(jìn)研究結(jié)果。結(jié)果表明在溫度，pH和最初葡萄糖濃度分別為50℃，5.0和10gL-1時(shí)，甘蔗渣水解液與甘蔗汁，糖蜜和提取物混合物的產(chǎn)乙醇量分別為1.7、1.75和2.57gL-1h-1。乙醇發(fā)酵中除了葡萄糖的耐受性達(dá)到300gL-1之外，pH和溫度都是相同的[21]。

1.4.2 畢赤酵母屬

畢赤酵母（Pichia）是含有球形，橢圓和長(zhǎng)方形細(xì)胞形態(tài)的酵母科中的酵母屬。這些菌種大多用于戊糖的發(fā)酵。Kwon等[22]用畢赤酵母IPE100在42℃下發(fā)酵葡萄糖和玉米稈的產(chǎn)乙醇量分別是理論值的85%和93.8%。通過(guò)生物學(xué)的方法對(duì)畢赤酵母進(jìn)行基因改造是增加乙醇的產(chǎn)量重要途徑。Kitagawa等[23]構(gòu)建了畢赤酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以表達(dá)棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）BGL基因，100gL-1含有外源基因的轉(zhuǎn)化菌株在40℃下發(fā)酵72h生產(chǎn)的乙醇量為29gL-1。

2 、代謝途徑

嗜熱微生物能利用許多從LCB到生物能源轉(zhuǎn)化的糖類(lèi)。利用底物的范圍取決于最適生長(zhǎng)溫度和群落生境。極端嗜熱水生古菌（Topt≥80℃）能利用α-和β-葡聚糖，如淀粉、大麥葡聚糖、海帶多糖和幾丁質(zhì)，而極端嗜熱水生細(xì)菌（Topt≥80℃）同樣能利用葡聚糖、半纖維素（木聚糖和甘露聚糖）。然而，這些微生物都不能有效利用結(jié)晶纖維素[24]。

所有已發(fā)現(xiàn)的分解糖的嗜熱微生物按EMP途徑代謝葡萄糖[25]。其他的己糖如半乳糖和甘露糖在嗜熱菌的存在下通過(guò)幾種降解酶直接到EMP途徑。戊糖（木糖或阿拉伯糖）通過(guò)PPP代謝產(chǎn)生3-P-甘油醛，接著到EMP代謝途徑[9,26]。

在微生物利用天然木糖和阿拉伯糖的過(guò)程中，細(xì)菌利用異構(gòu)酶途徑形成中心代謝中的戊糖，而酵母和絲狀真菌主要利用還原酶/脫氫酶途徑[27]。細(xì)菌通常用酶XI將D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖，而酵母和真菌首先通過(guò)酶XR將D-木糖還原為木糖醇，之后通過(guò)酶XDH氧化為木酮糖，進(jìn)一步氧化形成D-木酮糖-5-磷酸[28]。

許多進(jìn)行氧化戊糖磷酸途徑的酵母和嗜熱菌形成的NADPH和核糖-5-磷酸用于還原生物合成[29]。然而，在嗜熱產(chǎn)乙醇菌中，像木糖和阿拉伯糖通過(guò)非氧化戊糖磷酸代謝途徑，木酮糖-5-磷酸異構(gòu)為核酮糖-5-磷酸，之后核酮糖-5-磷酸通過(guò)NADPH鐵氧化還原酶形成核糖-5-磷酸。戊糖磷酸途徑中的產(chǎn)物以果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸的形式用于EMP途徑。果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸在厭氧條件下通過(guò)丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為不同的終發(fā)酵產(chǎn)物[25]。

木質(zhì)纖維素的水解產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)乙醇需要微生物，該微生物在抑制劑如弱酸、糠醛和酚醛塑料存在下能發(fā)酵己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）和戊糖（木糖和阿拉伯糖）[30]。Hahn-Hagerdal等[31]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母是發(fā)酵乙醇產(chǎn)品的優(yōu)選微生物，對(duì)代謝抑制物具有抵抗性。

丙酮酸鹽是糖類(lèi)代謝中的中間代謝物，先形成乙醛最終形成乙醇。耐熱微生物中通過(guò)pdc編碼的PDC是一種TPP酶，能將丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為乙醛。在超級(jí)嗜熱菌中PDC活性具有雙重功能，一種是來(lái)自超級(jí)嗜熱古菌火球菌的依賴(lài)TPP和CoA的PFOR/PDC酶。另一種是與丙酮酸鹽催化生成乙醛有關(guān)的酶，是乙酰CoA ALDH(mhpF和adhE基因編碼)。嗜熱菌（Geo-bacillus 和Thermoanaeroba-cter）中丙酮酸鹽通過(guò)PFOR 或者PFL氧化為乙酰-CoA，ALDH催化乙酰CoA還原為乙醛。最后，乙醛通過(guò)ADH還原為乙醇[27]。另外， 也發(fā)現(xiàn)了幾種嗜熱菌在細(xì)胞中不同生理功能中的多重ADHs[32]，且通過(guò)滲透單元獲得了17%的乙醇。許多研究者已發(fā)現(xiàn)了增加膜通量的膜基質(zhì)材料。Le和Wang[33]發(fā)現(xiàn)了新的混合基質(zhì)膜Pebax/POSS通過(guò)滲透分離回收乙醇。Zhan等[34]研究沸石和沸石中Si/Al的比例對(duì)乙醇-水混合物滲透功能的影響。隨著沸石從10%到30%的增加，在50℃含有5%乙醇的混合液中，總滲透量從265gm-2h-1顯著增加至820.7gm-2h-1，而分離因子從11.3增加到13.7。含30%沸石的沸石填充復(fù)合膜在一定的乙醇濃度（5-90%）范圍內(nèi)時(shí)乙醇具有選擇透過(guò)性，尤其是在低濃度乙醇范圍內(nèi)表現(xiàn)出了優(yōu)越的滲透性能。

3 、展望

LCB為生物燃料的研究與生產(chǎn)提供了潛在的原材料，特別是有助于清潔環(huán)境和碳中期循環(huán)的生物乙醇。然而，這個(gè)過(guò)程在遺傳工程方法中具有不同的技術(shù)差距，在發(fā)酵工程中，通過(guò)高通量技術(shù)和共發(fā)酵酶復(fù)合體的高效表達(dá)來(lái)提高菌株的活性。也可利用功能基因組學(xué)和代謝工程學(xué)相結(jié)合的方法篩選優(yōu)良菌株。此外，可以用流量分析的方法改變關(guān)鍵酶的活性以增加木糖的利用。而且，對(duì)LCB原料或是相關(guān)酶理化性質(zhì)的研究也能提高乙醇的產(chǎn)量和生產(chǎn)率。相信隨著生物技術(shù)及各領(lǐng)域的協(xié)同發(fā)展，以微生物為手段的LCB原材料利用將是能源開(kāi)發(fā)的趨勢(shì)，也是解決能源危機(jī)、改善環(huán)境質(zhì)量的必經(jīng)之路。

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Microbes for production of lignocellulosic ethanol

Nan Huaiyan1 Sun Shangchen1 Hu Wei1 Li Wenxin1 WANG Yonggang2 Liu Xiaofeng 2 Leng Feifan2

（1.Lanzhou Lan Shi equipment engineering research institute co., LTD, Lanzhou, Gansu730314, China; 2.School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou,Gansu 730050 China）

With the world of renewable resources consumption，it is caused by serious environmental and public health problems，thus clean，efficient and environmentally friendly new energy has become a hot research topic in many fields.Based on the sustainability and environmental protection of bioethanol，cellulosic ethanol production by microorganism fermentation has become a key research focus at home and abroad.This review summarizes microbe types and its metabolic pathway of the fermentable cellulose ethanol，in order to provide strains for cellulosic ethanol fermentation production and theoretical basis for China's renewable energy.

Microorganism; Lignocellulose; Thermophiles; Fuel ethanol; Fermentation。