閆翠環(huán)++王亞利++王鑫國++張明泉++劉湘

摘要：目的 觀察春、夏、秋、冬不同季節(jié)衛(wèi)氣虛證SD大鼠的血漿代謝組學特征，尋找與衛(wèi)氣虛相關的物質基礎，探討衛(wèi)氣虛的本質。方法 分別于春分日、夏至日、秋分日、冬至日前7 d適應性喂養(yǎng)SD雄性大鼠各20只，與各季節(jié)氣候同步控制條件，按隨機數(shù)字法將大鼠分為實驗組和對照組。實驗組通過疲勞加寒熱交替法復制衛(wèi)氣虛大鼠模型。于各節(jié)氣當日12：00取血，采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀檢測血漿代謝物，通過偏最小二乘判別分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，比較各季節(jié)實驗組和對照組的數(shù)據(jù)和圖譜，探尋體現(xiàn)組間差異的代謝物，推測與衛(wèi)氣虛相關的生物標志物。結果 在春、夏、秋、冬不同的季節(jié)中，各實驗組和對照組大鼠間代謝譜呈現(xiàn)明顯差異。在4組比較中，同型半胱氨酸在春、夏、秋季實驗組與對照組比較差異顯著，神經(jīng)酰胺在夏、冬季實驗組與對照組比較差異顯著，睪酮在春、夏季實驗組與對照組比較差異顯著，環(huán)鳥甘酸在秋、冬季實驗組與對照組比較差異顯著，肌氨酸在春、夏、冬季實驗組與對照組比較差異顯著，這些物質的生理功能涉及機體的脂代謝、氨基酸代謝、神經(jīng)遞質以及激素水平的調節(jié)。結論 伴隨季節(jié)變化，衛(wèi)氣虛的生物標志物也發(fā)生相應變化，主要體現(xiàn)在氨基酸代謝、脂類代謝、神經(jīng)遞質以及激素調節(jié)水平等方面。

關鍵詞：衛(wèi)氣虛；代謝組學；季節(jié)變化；生物標志物；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.017

中圖分類號：R228 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）01-0066-05

Research on Seasonal Variation of Plasma Metabolic Markers of Wei-qi Deficiency YAN Cui-huan1， WANG Ya-li2， WANG Xin-guo1， ZHANG Ming-quan1， LIU Xiang3， LI Bo-lin3， CAO Wen-li1 （1. Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang 050200， China； 2. Hebei Medical University， Shijiazhuang 050017， China； 3. Hebei Province Chinese Medicine Hospital， Shijiazhuang 050011， China）

Abstract： Objective To study the plasma metabolomics features of SD rats with wei-qi deficiency respectively in spring， summer， autumn and winter； To seek the potential markers related to wei-qi deficiency； To discuss the essence of wei-qi deficiency. Methods Twenty male SD rats were adaptively fed 7 days before Chinese Vernal Equinox Day， Summer Solstice， Autumn Equinox and Winter Solstice， synchronous controled with temporal condition. The rats were randomly divided into experimental and control groups according to random number method. Rats in the experimental groupwere made into wei-qi deficiency models through fatigue stimulation alternately with cold and heat stimulation. Blood was collected at 12：00 each solar term. High performance liquid chromatography- mass spectrometry instrument was used to detect plasma metabolites. Partial least squates-discriminant analysis was used to process statistical analysis of the data to compared the original data of plasma metabolomics between the two groups of each season， and explore the difference metabolic markers between each two groups， then speculate the potential biomakers of wei-qi differency. Results With the changes of spring， summer， autumn and winter， significant differences were showed in metabolic profile between the experimental and control groups. Homocysteine showed a significant difference in spring， summer and autumn； Ceramide showed a significant difference in summer and winter； Testosterone showed a significant difference in spring and summer； Cyclic guanosine monophosphate showed a significant difference in autumn and winter； Sarcosine showed a significant difference in spring， summer and winter. The physiological functions of these substances related to lipid metabolism， amino acid metabolism， neurotransmitter and hormone regulation. Conclusion Potential biomakers of wei-qi deficiency changed along with the seasonalendprint

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81273609）

通訊作者：王亞利，E-mail：wang1955@163.com

variation， which mainly reflected in lipid metabolism， amino acid metabolism， neurotransmitter and hormone regulation.

Key words： wei-qi deficiency； metabolomics； seasonal variation； biomarker； rats

《靈樞·禁服》有“審察衛(wèi)氣，為百病母”，衛(wèi)氣功能失常是多種疾病的主要病機，衛(wèi)氣的溫養(yǎng)、固護肌表和抗御外邪功能失?？蓪е潞棺C、痹證、失眠或多寐、善忘、癰疽腫瘍等多種疾病的發(fā)生。關于衛(wèi)氣虛的實質，有學者從白細胞相關抗原的角度認為人類白細胞抗原-DR4是衛(wèi)氣虛人群對外感疾病易感的免疫遺傳學基礎[1]；或認為衛(wèi)氣虛與機體黏膜免疫及神經(jīng)-內分泌-免疫網(wǎng)絡相關[2-3]。本課題組前期研究表明，衛(wèi)氣虛證周期性變化可能與能量代謝密切相關，同時還伴隨著細胞、激素及神經(jīng)調節(jié)[4]；衛(wèi)氣及衛(wèi)氣虛的季節(jié)變化與淋巴細胞生物鐘基因Clock密切相關[5]。衛(wèi)氣虛的實質研究為衛(wèi)氣虛相關疾病的預防、治療及療效判定提供了客觀依據(jù)，但仍未達成統(tǒng)一的意見。本實驗利用代謝組學技術，從生物標志物的角度觀察衛(wèi)氣虛證在不同季節(jié)的血漿代謝組學變化，進一步探討衛(wèi)氣虛的本質。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD大鼠80只，SPF級，6～8周齡，體質量（180±30）g，河北醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號1309031、1312049、1403037、1406027。飼養(yǎng)于光照周期12 h/12 h的環(huán)境中。

1.2 主要試劑與儀器

乙酸、乙酸銨均為色譜純，Dikmapure（中國）公司；乙腈、甲醇均為色譜純，美國Fisher Scientific公司；蒸餾水，屈臣氏公司；其他試劑均為分析純。高效液相色譜儀（ULTRIP-LC-100），美國AB公司；色譜柱，美國phenomenex公司，型號Hypersil Golda Q C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司，型號TGL-16M；超低溫保存箱，日本三洋公司，型號MDF-382E。

2 實驗方法

2.1 造模和分組

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。通過疲勞加寒熱交替法制造衛(wèi)氣虛大鼠模型[6]。將大鼠置于20 ℃水中游泳約30 min，常規(guī)條件飼養(yǎng)30 min后，放入恒溫箱（40±1）℃中15 min進行熱刺激，密切關注大鼠變化，每5 min觀察1次，造成玄府開泄、衛(wèi)表不固。大鼠取出后，常規(guī)條件飼養(yǎng)30 min，再放入-20 ℃冰箱10 min進行冷刺激，密切關注大鼠變化，每2 min觀察1次。每只大鼠每日9：00疲勞加寒熱刺激1次，連續(xù)7 d。大鼠癥狀表現(xiàn)：扎堆、蜷縮、發(fā)抖，被毛凌亂，汗出明顯，出現(xiàn)鼻腔分泌物，活動減少，輕度腹瀉等；血常規(guī)檢查白細胞計數(shù)升高。符合以上表現(xiàn)為造模成功[7-8]。按隨機數(shù)字法將大鼠分為春分實驗組、對照組，夏至實驗組、對照組，秋分實驗組、對照組，冬至實驗組、對照組，每組10只。對照組常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何干預。

2.2 取樣

大鼠分別于春分（2014-03-21）、夏至（2014-06-21）、秋分（2013-09-23）、冬至（2013-12-22）當日12：00取血，肝素鈉抗凝，3500 r/min離心10 min，上清液移至凍存管-80 ℃保存。

2.3 血漿樣本預處理

2.3.1 檢測樣品制備 乙腈、蒸餾水4 ℃過夜預冷。按乙腈/水（3∶1）混合液沉淀蛋白，混勻，14 000 r/min離心10 min；取上清液，按1∶1比例加入蒸餾水稀釋，14 000 r/min離心10 min，移上清液入液相加樣瓶中待測。

2.3.2 質量控制樣本制備 各組血漿樣品4 ℃復融，分別取10 μL血清，渦旋震蕩混勻，按每管100 μL分裝于EP管中，即為質量控制樣本（QC），其余處理同檢測樣品處理方法。

2.4 HPLC-MS檢測

應用ULTRIP LC-100和AB SCIEX Q-Triple 4500 System檢測和采集數(shù)據(jù)。色譜條件：流動相A溶劑為水（0.05%乙酸，2 mmol乙酸銨溶液），B溶劑為乙腈（0.05%乙酸，2 mmol乙酸銨溶液）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。質譜條件：采用正離子（ESI+）模式檢測；質荷比（m/z）50～850 Da；Curtain Gas：30 psi；Gas1：55 psi；Gas2：55 psi；DP：60 V；EP：10 V；CE：5 eV；ISP：5500 V；Tem：500 ℃。

3 統(tǒng)計分析

3.1 數(shù)據(jù)預處理

利用Markerview1.2.1代謝組學分析軟件將數(shù)據(jù)進行預處理，包括數(shù)據(jù)格式轉換、導入；圖譜查看、對比（TIC、2D、3D、MS）；去噪音；提取質譜峰；反卷積處理；峰排列、對齊、合并；列表去噪音；縫隙填補處理；數(shù)據(jù)導出獲得二維數(shù)據(jù)陣。

3.2 數(shù)據(jù)分析

采用SIMCA13.0.3統(tǒng)計軟件進行多變量分析，采用偏最小二乘判別分析（PLS-DA），結合代謝組學分析軟件Markerview1.2.1的t檢驗，分析標志性代謝物的組間差異。

3.3 差異性代謝物挖掘

利用PLS-DA模型變量因子（VIP值、閾值>1），結合t檢驗的P值（P<0.05）尋找差異性表達代謝物，在線檢索數(shù)據(jù)庫（http：//metlin.scripps.edu/）查找代謝物并推測其種類。endprint

4 結果

4.1 代謝物分析

R2X是判別模型質量好壞的主要參數(shù)，它代表模型的解釋率，一般其數(shù)值>0.4即表示該模型可靠。

4.1.1 春分大鼠血漿代謝物分析 在正離子模式下，共獲得3個主成分。R2X：0.318；R2Y：0.997；Q2：0.861。PLS-DA得分圖表明，兩時間節(jié)點間差異顯著，實驗組與對照組完全被第一主成分分隔，表明當前PLS-DA模型可靠，可用于解釋2組間的代謝差異并探索體現(xiàn)2組間差異的代謝標志物。結果見圖1。

4.1.2 夏至大鼠血漿代謝物分析 在正離子模式下，共獲得1個主成分，R2X：0.431；R2Y：0.807；Q2：0.775。PLS-DA得分圖表明，兩時間節(jié)點間差異顯著，實驗組與對照組完全被第二主成分分隔，表明當前PLS-DA模型可靠，可用于解釋2組間的代謝差異，并探索體現(xiàn)2組間差異的代謝標志物。結果見圖2。

4.1.3 秋分大鼠血漿代謝物分析 在正離子模式下，共獲得2個主成分。R2X：0.316；R2Y：0.999；Q2：0.963。PLS-DA得分圖表明，兩時間節(jié)點間差異顯著，實驗組與對照組完全被第一主成分分隔，表明當前PLS-DA模型可靠，可用于解釋2組間的代謝差異，并探索體現(xiàn)2組間差異的代謝標志物。結果見圖3。

4.1.4 冬至大鼠血漿代謝物分析 在正離子模式下，共獲得1個主成分。R2X：0.125；R2Y：0.935；Q2：0.698。PLS-DA得分圖表明兩時間節(jié)點間差異顯著，實驗組與對照組完全被第二主成分分隔，表明當前PLS-DA模型可靠，可用于解釋2組間的代謝差異，并探索體現(xiàn)2組間差異的代謝標志物。結果見圖4。

4.2 差異性代謝產(chǎn)物的挖掘及鑒定

經(jīng)PLS-DA模型分析結合t檢驗篩選候選代謝物信息后，進行在線數(shù)據(jù)庫檢索，推測代謝物種類和生物學特征。經(jīng)過初步比對，推測出膽紅素、同型半胱氨酸、肌氨酸、二磷酸尿苷、睪酮、腦苷脂、半乳糖神經(jīng)酰胺、胞嘧啶核苷8種差異代謝物為春季衛(wèi)氣虛可能標志物（見表1）；同型半胱氨酸、神經(jīng)酰胺、睪酮、血管緊張素、肌氨酸、L-谷氨酰胺、N-乙酰天門冬氨酸、膽堿磷酸8種差異代謝物為夏季衛(wèi)氣虛區(qū)可能標志物（見表2）；維甲酸、同型半胱氨酸、環(huán)鳥甘酸、糞卟啉、甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（FMLP）5種差異代謝物為秋季衛(wèi)氣虛可能標志物（見表3）；富馬酸二甲酯、膽固醇酯、神經(jīng)酰胺、肌氨酸、環(huán)鳥甘酸5種差異代謝物為冬季衛(wèi)氣虛可能標志物（見表4）。同型半胱氨酸在春、夏、秋季實驗組與對照組差異性比較中顯著表達，神經(jīng)酰胺在夏、冬季實驗組與對照組差異性比較中顯著表達，睪酮在春、夏季實驗組與對照組差異性比較中顯著表達，環(huán)鳥甘酸在秋、冬季實驗組與對照組差異性比較中顯著表達，肌氨酸在春、夏、冬季的實驗組與對照組差異性比較中顯著表達。

5 討論

衛(wèi)氣虛是機體衛(wèi)外不足，肌表失于固護，易于感受外邪的一種病機，容易導致表虛證?！秲冉?jīng)》通過“天溫日明，則人血淖澤而衛(wèi)氣浮，故血易瀉，氣易行；天寒日陰，則人血凝泣而衛(wèi)氣沉”指出衛(wèi)氣隨季節(jié)變化的特征。以此推測以衛(wèi)氣生理功能失常為主要表現(xiàn)的衛(wèi)氣虛證也應該存在季節(jié)性變化特征。代謝組學描述的是生物體的內源性代謝小分子隨時間變化而形成的代謝圖譜，具有即時性和動態(tài)性特征。所以，代謝組學技術有助于客觀認知衛(wèi)氣虛的生物學本質。若能確定衛(wèi)氣虛的生物標志物，則有助于進行辨證施治的療效評價，并結合機體內源性生物標志物的軌跡變化，確定中藥藥效的物質基礎。這也是“中醫(yī)方證代謝組學”的觀點[9]，通過代謝組學技術的利用，為中醫(yī)辨證和療效判定提供量化的客觀依據(jù)。

本實驗結果顯示，同型半胱氨酸、富馬酸二甲酯、睪酮、神經(jīng)酰胺、膽固醇酯、環(huán)鳥甘酸、肌氨酸等物質在實驗組和對照組間呈現(xiàn)明顯差異，這些物質的功能涉及機體的脂代謝、氨基酸代謝、神經(jīng)遞質及激素水平的調節(jié)。同型半胱氨酸由肌肉、肝臟等組織蛋氨酸脫甲基生成，靠自身代謝的動態(tài)平衡調節(jié)濃度。當其濃度異常時可成為“毒性氨基酸”，導致甲硫氨酸循環(huán)發(fā)生紊亂，可使多個基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，進而影響其表達[10-11]。肌氨酸又名N-甲基甘氨酸，由S-腺苷酶的一組甲基轉移到甘氨酸后生成，是膽堿代謝成為甘氨酸過程中的一個非編碼氨基酸中間體，存在于人體的肌肉和一些其他組織中，其生成過程中需要的甘氨酸-N-甲基轉移酶主要表達在前列腺和其他組織[12]。肌氨酸轉變成的甘氨酸是結構性氨基酸，是肌酸、嘌呤、谷胱甘肽等活細胞必需成分的代謝來源，在人體生理活動中具有重要作用。L-谷氨酰胺是人體肌肉中最豐富的游離氨基酸[13]，一方面能促進蛋白質的合成，參與保持谷胱甘肽儲備，保護組織細胞避免受到氧自由基帶來的損傷[14]，提高機體對應激的適應性；對于營養(yǎng)不良的個體，谷氨酰胺還通過提供能量ATP到巨噬細胞，調節(jié)巨噬細胞的分泌功能，也有認為谷氨酰胺能增強機體的體液免疫[15]。腦苷脂是廣泛存在于生物細胞膜中的一類重要活性脂質，具有免疫調節(jié)、改善脂質代謝等多種生物活性[16-18]，其主要結構單元即糖基和神經(jīng)酰胺，后者是細胞膜的重要組成成分，是神經(jīng)鞘脂類的骨架結構。同時，神經(jīng)酰胺可以作為第二信使，參與膜的信號傳導[19]，在細胞的分化、增殖、衰老和凋亡過程中發(fā)揮良性調節(jié)作用[20-21]。N-乙酰天門冬氨酸存在于機體的正常神經(jīng)元內，普遍存在于神經(jīng)細胞胞體和神經(jīng)軸突中，發(fā)揮營養(yǎng)神經(jīng)的功能，并沿軸索傳遞信號[22]。睪酮的分泌主要受下丘腦-腺垂體-性腺軸調節(jié)，同時可以將信息反饋至調節(jié)軸，形成循環(huán)以維持體內性激素分泌的平衡。睪酮能夠增加骨骼肌細胞膜對氨基酸的攝取、促進核酸、肌蛋白、紅細胞和磷酸肌酸的生成，與機體的體質和運動能力密切相關。

在春、夏、秋、冬季節(jié)差異性表達的代謝物中，同型半胱氨酸、肌氨酸、神經(jīng)酰胺、睪酮、環(huán)鳥甘酸分別在2個以上不同季節(jié)的實驗組與對照組比較中發(fā)揮作用，尤其是同型半胱氨酸和肌氨酸分別在3個季節(jié)的實驗組和對照組差異性比較中發(fā)揮作用，其對衛(wèi)氣和衛(wèi)氣的生理功能影響幾乎持續(xù)四季，說明衛(wèi)氣虛的季節(jié)性變化與氨基酸代謝關系尤為密切，這也與本課題組前期研究中反復上呼吸道感染肺衛(wèi)氣虛證的潛在標志物多為氨基酸類的研究結果一致[23]。endprint

綜上所述，衛(wèi)氣虛的病理狀況涉及機體氨基酸、脂類、神經(jīng)遞質、激素4個層面的代謝標志物變化。我們推測機體衛(wèi)外功能的異常，即衛(wèi)氣虛狀況的出現(xiàn)，與機體氨基酸、脂類代謝有關，也和機體神經(jīng)調節(jié)以及激素調節(jié)密切相關，從代謝組學角度分析機體內源性生物標志物的細微變化，可以在早期通過量化指標確定衛(wèi)氣虛證，從而達到未病先防或既病防變的目的。

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（收稿日期：2016-07-05）

（修回日期：2016-08-05；編輯：華強）endprint