外源ABA對(duì)低溫脅迫下玉米幼苗內(nèi)源激素含量及Asr1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

李馨園楊 曄張麗芳左師宇李麗杰焦 健李 晶*

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030;2黑龍江省農(nóng)科院齊齊哈爾分院, 黑龍江齊齊哈爾 161006

外源ABA對(duì)低溫脅迫下玉米幼苗內(nèi)源激素含量及Asr1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

李馨園1,2,**楊 曄1,**張麗芳1左師宇1李麗杰1焦 健1李 晶1*

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030;2黑龍江省農(nóng)科院齊齊哈爾分院, 黑龍江齊齊哈爾 161006

脫落酸(ABA)是低溫逆境下的重要信號(hào)因子, 為了探討外源 ABA對(duì)低溫脅迫下玉米幼苗的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用, 以耐低溫玉米品種久龍5號(hào)為試驗(yàn)材料, 采用不同濃度(5、15、25、35 mg L-1) ABA于玉米三葉一心時(shí)噴霧于葉片, 并進(jìn)行低溫梯次處理。分析處理后玉米葉片相對(duì)電導(dǎo)率、抗氧化酶活性及內(nèi)源激素ABA、IAA的含量變化, 并采用Real-time PCR明確Asr1基因表達(dá)水平變化。結(jié)果表明, 低溫脅迫下不同濃度外源ABA處理的玉米葉片相對(duì)電導(dǎo)率整體呈上升趨勢(shì), SOD和POD活性加強(qiáng), 15 mg L-1和25 mg L-1ABA處理的SOD活性均顯著高于未應(yīng)用ABA處理, 內(nèi)玉米 源ABA和IAA合成水平上升, 應(yīng)用ABA后Asr1基因相對(duì)表達(dá)水平上調(diào), 其中5、15和25 mg L-1濃度處理基因表達(dá)上調(diào)顯著。相關(guān)分析表明, ABA含量與Asrl基因相對(duì)表達(dá)量、SOD活性均表現(xiàn)為極顯著正相關(guān), 與POD活性顯著正相關(guān)。說(shuō)明Asr1基因表達(dá)受ABA的介導(dǎo)調(diào)控, Asr1基因表達(dá)量的提升, 也促進(jìn)了內(nèi)源ABA的合成, 抗氧化酶活性加強(qiáng), 提升了應(yīng)用ABA后玉米的抗低溫能力。但外源ABA的介導(dǎo)調(diào)控具有一定濃度效應(yīng), 表現(xiàn)為低促高抑。

玉米; 外源ABA; Asr1基因; 低溫脅迫; 內(nèi)源激素

低溫是限制作物分布及其生長(zhǎng)最重要的環(huán)境因素[1]。玉米是中國(guó)第一大糧食作物, 2014年種植面積達(dá)到3.69× 107hm2。玉米生長(zhǎng)期遭遇低溫, 會(huì)引起植株體內(nèi)一系列生理代謝反應(yīng), 進(jìn)而影響產(chǎn)量和品質(zhì)。黑龍江省地處高緯度,低溫冷害發(fā)生概率為28%, 嚴(yán)重低溫冷害每5年發(fā)生一次,低溫導(dǎo)致玉米減產(chǎn)22%～34%[2]。近些年來(lái), 隨全球氣候變暖, 黑龍江省成為全國(guó)氣候變暖中心, 但氣候的自然波動(dòng)依然存在, 加上盲目北移和晚熟品種增加等人為因素,低溫冷害仍存在潛在威脅[3]。脫落酸(abscisic acid, ABA)是低溫逆境下的重要信號(hào)因子, 對(duì)細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用。低溫環(huán)境下時(shí)植物體內(nèi)ABA大量累積, 對(duì)植物起到保護(hù)性作用, 植物抗冷性提高[4]。已有研究表明, 脅迫環(huán)境下小麥[5]、甘蔗[6]、水稻[7]、大麥[8]等作物施加外源ABA, 增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量, 使SOD和POD活性增強(qiáng), 影響植物體內(nèi)內(nèi)源激素含量, 促進(jìn)脫落酸的合成, 顯著緩解脅迫效應(yīng)。黃杏等[9]研究表明, 低溫脅迫下, 外源ABA能有效降低甘蔗體內(nèi)GA3含量, 提高ABA含量。楊東清等[10]研究表明, 高溫處理下噴施外源 ABA, 使小麥ZR含量降低, ABA含量顯著提高。ABA亦被作為抗寒基因表達(dá)過(guò)程中重要的逆境信號(hào)分子及啟動(dòng)因子。水稻中Os-ASR基因在莖稈中受外源ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。我們課題組[11]在以往玉米低溫逆境研究中, 已通過(guò)蛋白質(zhì)雙向電泳和肽指紋圖譜技術(shù)分析篩選到一個(gè)低溫上調(diào)表達(dá)的Asr1基因, ASR (the abscisic acid, stress, ripening)于1993年首次被發(fā)現(xiàn)[12], 迄今該基因家族成員在作物非生物脅迫中表達(dá)廣泛[13-15]。Frankel等[16]研究發(fā)現(xiàn), 在干旱條件下, Asr1基因在番茄葉片中大量表達(dá), 增強(qiáng)其抗旱性。Chin等[17]用花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子使轉(zhuǎn)LLA23基因(LLA23是 ASR基因家族中的一個(gè)成員)擬南芥種子對(duì)ABA的敏感性降低, 證明擬南芥體內(nèi)的LLA23可以介導(dǎo)ABA信號(hào)的脅迫應(yīng)答, 使植株表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗干旱和抗鹽能力。為探討低溫脅迫下外源ABA對(duì)玉米幼苗抗冷基因 Asr1的調(diào)控機(jī)制, 揭示低溫誘導(dǎo)過(guò)程中抗氧化酶活性變化及內(nèi)在激素平衡狀態(tài)與ABA調(diào)控關(guān)系, 從總體上把握了解 ABA 對(duì)冷脅迫下植株激素代謝及在信號(hào)作用下代謝基因調(diào)節(jié)過(guò)程的影響, 為揭示春玉米抗冷機(jī)理提供新的研究思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

據(jù)課題組前期篩選鑒定所得, 選用耐低溫玉米品種久龍5號(hào), 種子由黑龍江久龍種業(yè)有限公司提供。試驗(yàn)土壤取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地常規(guī)玉米地(黑土) 0～20 cm耕層。土樣含全氮1.78 g kg-1, 速效鉀183.48 mg kg-1、速效磷66.13 mg kg-1、有機(jī)質(zhì)26.31 g kg-1、堿解氮122.34 mg kg-1、pH 6.88。試驗(yàn)所用信號(hào)物質(zhì)脫落酸(abscisic acid, ABA)購(gòu)自哈爾濱偉業(yè)生物工程有限公司,純度為95%～98%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2014年田間生產(chǎn)季即4月25日至4月29日在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室外盆栽種植。盆直徑20 cm, 高23 cm, 每盆裝土18 kg。室外正常培養(yǎng)至三葉一心, 選擇無(wú)病、健壯、生長(zhǎng)勢(shì)均一植株, 將試驗(yàn)材料分為3組, 第1組清水常溫, 為對(duì)照, 記為CK。第2組清水低溫, 為低溫處理, 記為C0。第3組在葉面噴施ABA的基礎(chǔ)上低溫處理, ABA濃度為5、15、25、35 mg L-1, 分別記為C5、C15、C25、C35, 每株噴施5 mL, 噴施誘導(dǎo)24 h后, 將植株放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫(晝溫/夜溫=14±0.5℃/5±0.5℃)處理[18], 光照時(shí)間為12 h, 光強(qiáng)為140 μmol m-2s-1, 低溫脅迫0 d、2 d、4 d、6 d、8 d后取樣。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 電導(dǎo)率 選取玉米幼苗第 2片葉片, 用清水輕輕擦洗表面玷污物, 然后分別用蒸餾水和去離子水清洗1～2次, 用濾紙將葉片表面水分擦拭掉, 用打孔器打取等量葉片(避開(kāi)葉脈), 將同處理的樣品混勻后分成 3份, 分別將樣品完全浸入裝有 20 mL去離子水的三角瓶中, 在室溫下靜置15 h后用電導(dǎo)儀(DDS-IIAGA型)測(cè)定浸泡液電導(dǎo)率R。然后將樣品煮沸25 min, 待冷卻至室溫后用同樣的方法測(cè)定各瓶溶液的電導(dǎo)率R1。

相對(duì)電導(dǎo)率(%) = R/R1×100

1.3.2 保護(hù)酶活性 采用NBT (氮蘭四唑)光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性; 愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性。

1.3.3 內(nèi)源激素含量 采用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)[19], 從低溫脅迫0 d開(kāi)始取樣, 選用倒數(shù)第2葉,選擇長(zhǎng)勢(shì)一致5株, 每個(gè)處理測(cè)定4次, 取平均值。使用Thermo Multlskan FC型酶標(biāo)儀測(cè)定ABA (脫落酸)含量、IAA (生長(zhǎng)素)含量。所用試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)作物化學(xué)控制研究中心提供。

1.3.4 總RNA提取和Real-time PCR分析 取不同處理玉米葉片100 mg(從下數(shù)第2片葉和第3片葉), 于研缽中加入少量液氮碾磨至粉末, 移入 1.5 mL離心管中, 采用 Trizol Kits抽提總 RNA。采用多聚 T 引物以及RevertAid第一條cDNA鏈合成試劑盒(Fermentas, 美國(guó)),將約3 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 用于Real-time PCR分析。

根據(jù) Asr1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(正向引物: 5′-C TACGAGAAGCACGAGGCAAAGAAGG-3′; 反向引物: 5′-GGAGGGATCAATCAGCCGAAGAAGT-3′); 根據(jù)玉米EF1α設(shè)計(jì)內(nèi)參特異性引物(正向引物: 5′-TATGGTGAAGA TGGTTCCCACTAAG-3′; 反向引物: 5′-TTGGCTCCAGT TGGGTCCTT-3′)。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。Real-time PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s后, 95℃變性5 s, 60℃退火30 s, 采集熒光, 循環(huán)40次。每個(gè)樣本至少3個(gè)重復(fù), 用2-ΔΔCt對(duì)樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對(duì)定量分析。

1.3.5 干重 將鮮樣放入烘箱內(nèi) 105℃殺青 30 min, 80℃烘干至恒重并稱重。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 用 Microsoft Excel 2007整理數(shù)據(jù),用 DPS7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析和顯著性檢驗(yàn), 差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源ABA對(duì)低溫脅迫下玉米幼苗葉片電導(dǎo)率的影響

植物受到低溫脅迫時(shí), 質(zhì)膜首先遭破壞。膜脂過(guò)氧化程度加劇, 細(xì)胞膜透性增大, 膜內(nèi)電解質(zhì)大量外滲,相對(duì)電導(dǎo)率增大, 細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)的損傷程度可以由質(zhì)膜的透性變化顯示。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 不同濃度外源ABA處理的玉米幼苗相對(duì)電導(dǎo)率整體呈上升趨勢(shì), 最高值均出現(xiàn)在第8天, 表明隨低溫脅迫強(qiáng)度增加, 細(xì)胞膜損傷程度加劇(圖1)。C35處理的增加幅度最大, C15最小。C35處理相對(duì)電導(dǎo)率低溫脅迫第8天比0 d高 91.0%, 而 C15只增加了56.6%, 表明C35的細(xì)胞膜損傷程度最大, C15細(xì)胞膜損傷程度最小。低溫進(jìn)行2 d時(shí), 低溫下各ABA濃度處理差異不顯著, 隨脅迫天數(shù)增加, 即4～8 d時(shí), C15和C25處理相對(duì)電導(dǎo)率最低, 且與C0處理差異顯著。表明ABA的使用提高了幼苗的抗冷性, 質(zhì)膜損傷減小。而在各低溫脅迫時(shí)間段 C35處理的相對(duì)電導(dǎo)率均高于 C0處理, 差異不顯著, 表明高濃度的外源 ABA對(duì)玉米幼苗耐低溫特性無(wú)提升作用, 反而出現(xiàn)一定傷害。

圖1 外源ABA對(duì)低溫脅迫下玉米苗期相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig. 1 Effect of exogenous ABA treatments on cell membrane permeability in maize seedlings under low temperature stressC0: 清水低溫; C5: 低溫ABA濃度5 mg L-1; C15: 低溫ABA濃度15 mg L-1; C25: 低溫ABA濃度25 mg L-1; C35: 低溫ABA濃度35 mg L-1; CK: 清水常溫。柱形圖上不同字母表示處理間存在顯著性差異(P ＜ 0.05)。C0: treatment of water and low temperature; C5: treatment of low temperature and ABA 5 mg L-1; C15: treatment of low temperature and ABA 15 mg L-1; C25: treatment of low temperature and ABA 25 mg L-1; C35: treatment of low temperature and ABA 35 mg L-1; CK: water and room temperature. Different letters above the bar mean significant difference between them (P ＜ 0.05).

2.2 外源 ABA對(duì)低溫脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶在植物體內(nèi)具有清除超氧自由基、防止膜脂過(guò)氧化物傷害的作用, 保護(hù)膜結(jié)構(gòu)、維持體內(nèi)活性氧代謝的平衡, 一定程度上可使植物減緩或抵御逆境脅迫帶來(lái)的傷害。2.2.1 幼苗葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性變化 由圖 2可見(jiàn), SOD活性隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,在處理第6天達(dá)到最高, 隨后下降。表明在短時(shí)間脅迫下玉米幼苗能夠依靠自身的保護(hù)酶系統(tǒng)抵御低溫的傷害,但隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng), 植物體內(nèi)超氧負(fù)離子含量增加, 植株自身保護(hù)系統(tǒng)平衡被打破, SOD活性下降。適宜濃度的外源ABA可以提高低溫脅迫下SOD活性, 脅迫2～8 d間, C15和C25處理SOD活性均顯著高于C0處理, C5處理的作用不顯著。C35處理玉米幼苗SOD活性在低溫脅迫2 d后低于C0處理, 說(shuō)明35 mg L-1的ABA濃度對(duì)玉米幼苗抗低溫能力有抑制作用。

2.2.2 幼苗葉片過(guò)氧化物酶(POD)活性變化 不同ABA濃度處理的玉米幼苗POD活性變化趨勢(shì)相似, 整體上 POD活性均隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降,活性最高值均出現(xiàn)在低溫脅迫第6天(圖 3)。脅迫2～8 d間, C15和C25處理POD活性均顯著高于C0處理。在低溫脅迫后期, C35處理的玉米幼苗POD活性急劇下降, 說(shuō)明在長(zhǎng)時(shí)間低溫脅迫下, C35處理對(duì)玉米幼苗抗冷性抑制增強(qiáng)。

2.3 ABA誘導(dǎo)低溫脅迫下玉米幼苗葉片激素含量的變化2.3.1 ABA含量 玉米葉片內(nèi)源激素ABA含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。C0處理玉米葉片ABA含量隨低溫時(shí)間的延長(zhǎng)有增加趨勢(shì), 處理8 d比0 d增加了29.2%, 增加幅度達(dá)到最大。與對(duì)照(CK)相比, 各低溫處理玉米葉片ABA含量顯著增加, 且隨外施ABA濃度的提高, 葉片內(nèi)源ABA含量有先升高后下降趨勢(shì), 差異達(dá)顯著水平。其中C15處理和C25處理的含量增加最為顯著, 最大值出現(xiàn)在低溫處理第4 天和第8天, 低溫8 d分別比對(duì)照(CK)增加了165.3%和159.4%。C5和C35濃度處理下也有一定的增加, 增幅較小。與C0處理相比, 各噴施ABA處理內(nèi)源ABA含量均表現(xiàn)增加, 達(dá)到顯著差異水平。說(shuō)明低溫脅迫下應(yīng)用外源ABA提高了玉米幼苗內(nèi)源ABA含量。

圖2 外源ABA對(duì)低溫脅迫下玉米苗期SOD活性的影響Fig. 2 Effect of ABA on SOD activity in maize seedlings under low temperature stressC0: 清水低溫; C5: 低溫ABA濃度5 mg L-1; C15: 低溫ABA濃度15 mg L-1; C25: 低溫ABA濃度25 mg L-1; C35: 低溫ABA濃度35 mg L-1; CK: 清水常溫。柱形圖上不同字母表示處理間存在顯著性差異(P ＜ 0.05)C0: treatment of water and low temperature; C5: treatment of low temperature and ABA 5 mg L-1; C15: treatment of low temperature and ABA 15 mg L-1; C25: treatment of low temperature and ABA 25 mg L-1; C35: treatment of low temperature and ABA 35 mg L-1; CK: water and room temperature. Different letters above the bar mean significant difference between them (P ＜ 0.05).

圖3 外源ABA對(duì)低溫脅迫下玉米苗期POD活性的影響Fig. 3 Effect of ABA on POD activity in maize seedlings under low temperature stressC0: 清水低溫; C5: 低溫ABA濃度5 mg L-1; C15: 低溫ABA濃度15 mg L-1; C25: 低溫ABA濃度25 mg L-1; C35: 低溫ABA濃度35 mgL-1; CK: 清水常溫。注: 柱形圖上不同字母表示處理間存在顯著性差異(P ＜ 0.05)。C0: treatment of water and low temperature; C5: treatment of low temperature and ABA 5 mg L-1; C15: treatment of low temperature and ABA 15 mg L-1; C25: treatment of low temperature and ABA 25 mg L-1; C35: treatment of low temperature and ABA 35 mg L-1; CK: water and room temperature. Different letters above the bar mean significant difference between them (P ＜ 0.05).

表1 外源ABA對(duì)低溫脅迫下玉米苗期ABA含量的影響Table 1 Effect of exogenous ABA treatments on ABA content in maize seedlings under low temperature stress (ng g-1FW)

2.3.2 IAA含量 IAA含量的增加可以提高細(xì)胞壁的可塑性, 增強(qiáng)細(xì)胞伸展性, 在低溫脅迫下, 細(xì)胞膜不至于發(fā)生形變而破裂。隨脅迫時(shí)間的延伸, 玉米葉片內(nèi)IAA含量提高, 在低溫脅迫第 8天含量達(dá)到最大值。施加外源ABA后, 葉片內(nèi)IAA含量有明顯升高, 且隨著ABA濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。C15處理在低溫脅迫 0 d比對(duì)照(常溫條件下) IAA含量提高 23.92%, 低溫脅迫 2 d、4 d、6 d、8 d, IAA含量分別比對(duì)照提高93.5%、72.2%、60.8%、57.2%, 說(shuō)明低溫脅迫對(duì)內(nèi)源 IAA含量提高的促進(jìn)效應(yīng)大于常溫狀態(tài)。低溫脅迫第4天IAA增長(zhǎng)量達(dá)到最大, C5、C25和C35各處理間的IAA含量變化不顯著。說(shuō)明適宜濃度ABA處理可增強(qiáng)玉米幼苗內(nèi)源IAA的合成能力。

表2 外源ABA對(duì)低溫脅迫下玉米苗期IAA含量的影響Table 2 Effect of exogenous ABA treatments on IAA content in maize seedlings under low temperature stress (ng g-1FW)

2.4 ABA對(duì)Asr1基因相對(duì)表達(dá)量的影響

不同濃度外源ABA處理后玉米葉片中Asr1基因均有表達(dá)(圖4)。低溫脅迫0 d, C5、C15、C25和C35處理的玉米幼苗葉片中Asr1基因相對(duì)表達(dá)水平較未施ABA處理均有不同程度上調(diào), 其中 C5、C15和 C25處理的玉米幼苗葉片中Asr1基因相對(duì)表達(dá)顯著上調(diào), 分別為對(duì)照的24.85倍、25.56倍和23.26倍。這表明Asr1基因表達(dá)受外源ABA的調(diào)控, 在玉米中屬于依賴ABA型, 噴施15 mg L-1和25 mg L-1外源ABA顯著促進(jìn)了Asr1基因的表達(dá)。各濃度ABA處理的玉米幼苗葉片Asr1基因表達(dá)水平與低溫處理0 d相比, 2～6 d表達(dá)量不同程度下降, 8 d小幅上調(diào)表達(dá)。隨低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng), C35處理的玉米幼苗葉片中Asr1基因表達(dá)受到抑制。說(shuō)明噴施高濃度35 mg L-1外源ABA玉米幼苗抗冷性基因 Asr1表達(dá)受到抑制, 這與生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果吻合。

2.5 ABA誘導(dǎo)低溫脅迫下玉米幼苗干重的變化

玉米幼苗干重隨著低溫脅迫天數(shù)延長(zhǎng)逐漸增加。C5、C15、C25處理與CK之間在低溫脅迫期間幼苗干重差異不顯著; C15處理與C0處理除低溫脅迫2 d, 其余脅迫天數(shù)下幼苗干重差異均達(dá)到顯著水平; C5、C25、C35處理與C0處理各時(shí)期幼苗干重差異不顯著, 表明適宜的外源 ABA,緩解了低溫的脅迫作用, 有利于增加幼苗干物質(zhì)的積累。

2.6 相關(guān)性分析

由表4可知, 除電導(dǎo)率外, ABA含量與Asr1基因相對(duì)表達(dá)量、SOD活性均極顯著正相關(guān), 與POD活性顯著正相關(guān)。IAA含量與Asr1基因相對(duì)表達(dá)量極顯著負(fù)相關(guān), 與電導(dǎo)率極顯著正相關(guān)。玉米葉片干重與 Asr1基因相對(duì)表達(dá)量呈極顯著正相關(guān), 與 SOD活性極顯著正相關(guān), 與POD活性顯著正相關(guān)?？梢?jiàn), ABA對(duì)抗冷基因Asr1的表達(dá)水平及玉米苗期抗低溫能力具有更為積極的作用。

圖4 低溫脅迫下不同濃度外源ABA處理玉米幼苗Asr1基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Expression patterns of gene Asr1 in maize seedlings with different exogenous ABA treatments under low temperature stressC0: 清水低溫; C5: 低溫ABA濃度5 mg L-1; C15: 低溫ABA濃度15 mg L-1; C25: 低溫ABA濃度25 mg L-1; C35: 低溫ABA濃度35 mg L-1; CK: 清水常溫。柱形圖上不同字母表示處理間存在顯著性差異(P ＜ 0.05)。C0: treatment of water and low temperature; C5: treatment of low temperature and ABA 5 mg L-1; C15: treatment of low temperature and ABA 15 mg L-1; C25: treatment of low temperature and ABA 25 mg L-1; C35: treatment of low temperature and ABA 35 mg L-1; CK: water and room temperature. Different letters above the bar means significant difference between them (P ＜ 0.05).

表3 玉米幼苗干重Table 3 Corn seedling dry weight (g)

3 討論

ABA作為“脅迫激素”在感受脅迫信號(hào)時(shí), 能提高作物的抗逆性并起到重要作用[20]。對(duì)逆境下外源ABA的調(diào)控研究表明, 滲透脅迫條件下, ABA能降低水勢(shì), 提高滲透勢(shì), 增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力[21]。高溫逆境下, 噴施外源ABA通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平, 擴(kuò)大籽粒庫(kù)容量, 從而提高產(chǎn)量。本試驗(yàn)表明, 外源ABA通過(guò)對(duì)Asr1基因表達(dá)量以及內(nèi)源激素水平的調(diào)控, 促進(jìn)脫落酸合成, 減少細(xì)胞膜損傷,進(jìn)而提高玉米幼苗抗冷能力。

激素是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)物質(zhì), 對(duì)逆境產(chǎn)生響應(yīng)的激素信號(hào)分子, 廣泛參與作物生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。研究表明, ABA和植物的抗逆性密切相關(guān), 外源激素 ABA可以通過(guò)改變內(nèi)源激素水平來(lái)調(diào)節(jié)植物內(nèi)在生理代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)[22-23]。噴施外源ABA可以促進(jìn)脫落酸在植物體內(nèi)的合成和運(yùn)輸, 增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量, SOD、POD等酶活性增強(qiáng), 誘導(dǎo)抗寒基因表達(dá), 從而提高植物抗寒能力[24]。本文ABA含量與抗氧化酶活性相關(guān)性分析也證明了此觀點(diǎn)。本研究表明, 低溫脅迫下作物的內(nèi)源ABA含量增加, 而外施ABA處理會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)源ABA的合成,使其含量達(dá)到更高水平, 這與Iqbal等[25]的研究結(jié)果相符,且在柑橘[26]、小麥[25]等作物的研究中得到證實(shí)。同時(shí)施用 ABA的C15和 C25處理低溫脅迫后抗氧化酶活性顯著高于未施用處理, 也證實(shí)了ABA對(duì)玉米苗期抗性的提升作用, 但這種提升作用并不隨著外源施用濃度的增加而正向增加, 反而表現(xiàn)出低促高抑的效應(yīng), 從文中 C35處理ABA含量低于其他濃度處理即可看出, 可能外源激素類物質(zhì)過(guò)高濃度抑制作物葉片及根系生長(zhǎng), 作物吸收能力減弱, 從而出現(xiàn)抗性減小, 具體原因還有待于對(duì)根系等營(yíng)養(yǎng)器官的吸收能力的測(cè)試來(lái)分析。與之相比, IAA在植物抗冷性研究中較少。低溫脅迫下 IAA呈增加趨勢(shì), 外施ABA 后效果更為顯著, 這與白潔等[27]研究番茄的結(jié)果先下降后升高不一致, 這可能與低溫的逆境脅迫相關(guān), 啟動(dòng)了抗性基因的表達(dá), 激素間拮抗作用減弱, 亦或者激素間的代謝與運(yùn)輸存在組織器官表達(dá)性, 本研究只關(guān)注葉片的激素效應(yīng)而未測(cè)試玉米根系的含量, 根系數(shù)據(jù)的補(bǔ)充將更有效說(shuō)明低溫下IAA含量增加的原因。

表4 玉米葉片激素含量、葉片干重與Asrl基因相對(duì)表達(dá)量、電導(dǎo)率及抗氧化酶活性的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients of leaf hormone content and leaf dry weight with Asrl gene relative expression, electrical conductivity and antioxidant enzyme activities in maize

不同物種中, ASR基因家族在不同的器官中表達(dá), 玉米幼苗的根和葉中均有表達(dá)。由 ASR基因家族編碼的ASR 蛋白是生物體中廣泛存在的一類與逆境有關(guān)的家族蛋白[28], 植物受到逆境脅迫(如低溫、干旱、鹽脅迫等)后, ASR蛋白大量表達(dá), 可以緩解逆境引起的傷害[29]。Cortés等[30]研究發(fā)現(xiàn)菜豆的Asr1基因也與植物的耐旱性有著重要的關(guān)系。Goldgur等[31]用番茄的 Asr1基因創(chuàng)制的轉(zhuǎn)基因植株, 抗鹽性增強(qiáng)。在水培番茄植株的根系和地上部分檢測(cè)到Asr1 mRNA和蛋白在鹽脅迫和水分脅迫下均上調(diào)表達(dá), 表明Asr1基因的調(diào)控主要由RNA的轉(zhuǎn)錄或RNA的穩(wěn)定性所決定[32]。在火炬松幼苗時(shí)期噴施外源 ABA,水分脅迫下松樹(shù)根系中的lp3 (ASR基因家族成員)的表達(dá)部分受ABA的介導(dǎo)調(diào)控[33]。目前對(duì)于ASR基因家族的抗冷性研究較少。本研究表明, 低溫脅迫下玉米幼苗葉片中Asr1基因的表達(dá)量增加, 推測(cè)可能與脅迫下ASR蛋白含量升高有關(guān), 從而導(dǎo)致 ASR蛋白在胞質(zhì)中表現(xiàn)出分子伴侶活性, 在解凍周期中能穩(wěn)定一定數(shù)量的蛋白質(zhì), 以避免它們因反復(fù)凍結(jié)而引起的變性, 最終提高玉米幼苗的耐冷性。本研究同時(shí)也證明外源ABA的施加可以促進(jìn)Asr1基因表達(dá)量的增加, 并隨ABA濃度的增加Asr1基因表達(dá)量先增加后降低。ABA誘導(dǎo)的Asr1基因表達(dá)量的提升能夠加快ASR蛋白的合成, ASR蛋白的積累對(duì)植物在脅迫條件下起到潛在保護(hù)作用, 這對(duì)玉米低溫脅迫研究具有重要意義[34]。相關(guān)分析也表明, 依賴于ABA介導(dǎo)的Asr1的表達(dá), 也促進(jìn)了內(nèi)源 ABA的合成, 抗氧化酶活性加強(qiáng),提升了應(yīng)用ABA后玉米的抗低溫能力。

此外, 幼苗葉片干重與生理指標(biāo)相關(guān)分析表明, ABA對(duì)玉米幼苗抗低溫脅迫表現(xiàn)出調(diào)節(jié)能力, 15 mg L-1濃度外源ABA的緩解低溫脅迫的作用表現(xiàn)最強(qiáng)。且調(diào)節(jié)能力呈現(xiàn)一定的濃度效應(yīng), 即小于35 mg L-1的外源ABA處理時(shí), 內(nèi)源激素含量與Ars1基因的表達(dá)量均隨ABA濃度增大而升高, 而施加更高濃度的外源 ABA, 并沒(méi)有一直緩解這種脅迫反應(yīng), 而表現(xiàn)出一定的抑制作用。

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Regulation on Contents of Endogenous Hormones and Asr1 Gene Expression of Maize Seedling by Exogenous ABA under Low-temperature Stress

LI Xin-Yuan1,2,**, YANG Ye1,**, ZHANG Li-Fang1, ZUO Shi-Yu1, LI Li-Jie1, JIAO Jian1, and LI Jing1,*

1College of Agronomy, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2Qiqihar Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Qiqihaer 161006, China

Abscisic acid (ABA) is an important signal factor under low-temperature stress. This study aimed to investigate the effect of exogenous ABA on growth regulation of maize seedlings under low-temperature stress. Maize variety “Jiulong 5” resistant to low temperature was used with foliage spray of ABA (5, 15, 25, 35 mg L-1) at three-leaf period under varying degrees of low-temperature, to analyze relative electric conductivity, activities of autioxidant enzymes and contents variation of endogenous ABA and IAA of maize blades, as well as Asr1 gene expression level by Real-time PCR. The relative electric conductivity of maize blades showed an increasing tendency, meanwhile, activities of SOD and POD were enhanced by exogenous ABA treatments among which SOD activity was significantly higher in ABA treatments of 15 mg L-1and 25 mg L-1than in the control under low-temperature stress. Also the synthesis of endogenous ABA and IAA were increased significantly. The expression level of Asr1 gene significantly promoted in ABA treatments of 5, 15, and 25 mg L-1. ABA contant had a highly significant correlation with the relative expression of Asr1 gene and SOD activity and a significant correlation with POD activity. In conclusion the expression of Asr1 gene is mediated and regulated by ABA, the promotion of Asr1 gene expression also promotes the synthesis of endogenous ABA, and enhances antioxidant enzyme activities, resulting in improved maize resistance to low temperature. But the mediation and regulation of exogenous ABA have a concentration effect, showing promotion at low concentation and inhibition at high concentation.

Maize; Exogenous ABA; Asr1 gene; Low-temperature stress; Endogenous hormone

10.3724/SP.J.1006.2017.00141

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401320)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31401320).

*通訊作者(Corresponding author): 李晶, E-mail: jingli1027@163.com, Tel: 0451-55190304**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)第一作者聯(lián)系方式: 李馨園, E-mail: lipan.08@163.com; 楊曄, E-mail: 125915501@qq.com

稿日期): 2015-12-04; Accepted(接受日期): 2016-09-18; Published online(

日期): 2016-09-27.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160927.0842.006.html