夾心法免疫層析試條的數(shù)學(xué)模型與仿真研究

曾念寅+朱盼盼+李玉榕+姜海燕+褚蘆濤+杜民

摘 要 基于夾心法免疫層析試條檢測原理，結(jié)合對流擴(kuò)散方程和流體動(dòng)力學(xué)方程，建立了夾心法免疫層析試條動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程的數(shù)學(xué)模型，并通過COMSOL軟件對試條動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程進(jìn)行仿真。分別探究了目標(biāo)待測物A濃度在0～20 mol/L，標(biāo)記物P濃度在1 × 10 2～1 × 103 mol/L以及硝酸纖維素膜的孔隙率 在0～1范圍內(nèi)變化時(shí)，檢測線上夾心復(fù)合物濃度關(guān)于位置和時(shí)間的濃度變化情況，并分析了各物質(zhì)初始濃度以及試條結(jié)構(gòu)對于檢測結(jié)果和檢測時(shí)間的影響。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，目標(biāo)待測物A以及標(biāo)記物P濃度的增加將提高試條的定量檢測性能，而孔隙率通過影響混合液流速和混合液中各物質(zhì)反應(yīng)接觸情況來影響檢測結(jié)果。

關(guān)鍵詞 免疫層析試條； 夾心法； 對流擴(kuò)散； 數(shù)學(xué)模型； 生化反應(yīng)過程

1 引 言

免疫層析測定（Lateral flow immunoassay， LFIA） 是基于抗原抗體特異性反應(yīng)和層析技術(shù)發(fā)展起來的一項(xiàng)新興、簡便快速的免疫檢測技術(shù)，具有特異性強(qiáng)，操作簡單，可以單人份檢測以及無污染等優(yōu)點(diǎn)[1～3]。由于符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)倡導(dǎo)的“床邊檢驗(yàn)” （Point.of.care testing， POCT） 的發(fā)展潮流，免疫層析試條品種日益增多，應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣，主要包括有臨床診斷、食品安全檢測、環(huán)境檢測、農(nóng)業(yè)以及一些新興領(lǐng)域比如分子診斷等[1～5]。

近年來，越來越多的研究者們關(guān)注和研究提高免疫層析試條的檢測性能的方法，主要研究包括有：（1）大量生物化學(xué)研究者通過改進(jìn)制備技術(shù)和層析材料復(fù)合方式、受體固定方式等，提高試條檢測靈敏度和定量檢測性能[6～10]；（2）搭建基于光電/圖像的檢測系統(tǒng)采集免疫層析試條的檢測信息實(shí)現(xiàn)定量檢測[11～15]。 針對生物化學(xué)研究者們在改進(jìn)和提高試條特性時(shí)，尚無數(shù)學(xué)模型，而只能依賴反復(fù)嘗試， 本研究組前期工作中， 基于免疫層析試條的反應(yīng)機(jī)理及貝葉斯理論，建立其非線性狀態(tài)空間方程模型，能夠描述試條中各物質(zhì)動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程，優(yōu)化試條性能，通過模型實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)定量測定[3，16～20]。

Qian等[21，22]根據(jù)免疫層析試條反應(yīng)機(jī)理以及對流擴(kuò)散方程初步建立了數(shù)學(xué)模型，該模型能夠檢測試條系統(tǒng)中各參數(shù)對試條性能的影響，輔助優(yōu)化設(shè)計(jì)試條?；诖耍狙芯恳罁?jù)免疫層析試條反應(yīng)原理，結(jié)合對流擴(kuò)散方程和流體動(dòng)力學(xué)方程，建立模型，描述試條動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程，并通過COMSOL軟件對試條動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程進(jìn)行仿真，分析了試條中各物質(zhì)初始濃度和試條硝酸纖維素膜孔隙率等對試條性能以及檢測結(jié)果的影響。此模型能夠有助于研究者們通過快速且低成本的方法設(shè)計(jì)和優(yōu)化試條，為改善試條檢測靈敏度和定量檢測性能創(chuàng)造條件。

2 夾心法免疫層析試條的數(shù)學(xué)模型

夾心法免疫層析試條原理如圖1所示[1，3]。在一片塑料片上，從左到右、首尾互相銜接地依次粘貼如下組分：樣本墊 （Sample pad）、玻璃纖維膜的結(jié)合釋放墊 （Conjugate pad），膜上固定著干燥的標(biāo)記的特異抗體/抗原、硝酸纖維素膜 （Nitrocellulose membrane），膜上包被線條狀的抗體/抗原，即線狀的檢測線 （Test line） 與質(zhì)控線 （Control line）、吸水墊 （Wicking pad）。

為了簡便，建模時(shí)先不考慮質(zhì)控線，用A表示樣本中的目標(biāo)待測物，P表示結(jié)合釋放墊處的標(biāo)記物，R表示檢測線上的抗體。各物質(zhì)的濃度都可以視為關(guān)于空間一維位置（x）和時(shí)間（t） 的相關(guān)函數(shù)，如[A]（x，t）表示A在時(shí)間t時(shí)位置x處的濃度。本研究將免疫層析試條的動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程分為兩個(gè)過程： 在結(jié)合釋放墊的標(biāo)記過程和在檢測線上形成夾心復(fù)合物過程。

在結(jié)合釋放墊的標(biāo)記過程形成復(fù)合物發(fā)生的生化反應(yīng)式：

P+Aka1k d1PA（1）

基于對流擴(kuò)散方程[21]反應(yīng)（1）中的物質(zhì)濃度變化如下：

3 數(shù)學(xué)模型的約束條件與環(huán)境設(shè)置

免疫層析試條中各物質(zhì)的生化反應(yīng)除了需要滿足如上建立的數(shù)學(xué)模型的物質(zhì)傳遞規(guī)律外，還需滿足一定的流體流動(dòng)規(guī)律。首先，樣本液在試條中流動(dòng)反應(yīng)需滿足質(zhì)量守恒定律，即：

4.1 待測目標(biāo)分析物[A0]對復(fù)合物[RPA]的影響

首先通過改變待測目標(biāo)分析物濃度[A0]， 得到[RPA]在不同[A0]時(shí)關(guān)于時(shí)間的曲線如圖2所示，由圖2可見， [RPA]在開始階段隨著時(shí)間的增加呈線性快速增大，并隨著反應(yīng)的進(jìn)行[RPA]慢慢飽和。因此，根據(jù)仿真結(jié)果可以選擇一個(gè)具有較好特性的時(shí)間點(diǎn)作為免疫層析試條的檢測時(shí)間。

為了更好地觀察，基于圖2的結(jié)果選擇了3個(gè)固定時(shí)間來分析[RPA]跟與[A0]的關(guān)系，如圖3所示。當(dāng)待測物濃度較低時(shí)，[RPA]與[A0]呈正相關(guān)，但是當(dāng)?shù)竭_(dá)一定濃度后，隨著[A0]的增加，[RPA]反而下降，這與免疫層析試條系統(tǒng)中存在Hook效應(yīng)吻合[1，3]。

4.2 標(biāo)記物[P0]對復(fù)合物[RPA]的影響

考察了[P0]對于檢測結(jié)果的影響，得到[RPA]在不同[P0]下關(guān)于時(shí)間的曲線，如圖4所示。在[P0]濃度較低時(shí)，[RPA]增長速率緩慢，且趨于一個(gè)偏小的數(shù)值，待測分析物沒有得到完全反應(yīng)；在[P0]濃度較高時(shí)，[RPA]增長的速率幾乎相同；而且[P0]增加到某數(shù)值后，[RPA]的增長

速率和穩(wěn)定值都基本保持不變。因此，[P0]濃度在一定程度上會(huì)影響試條的檢測范圍和檢測結(jié)果。

如果在忽略反應(yīng)（9）的情況下，則[RPA]由[PA]直接轉(zhuǎn)化而來，可以用[RPA]/[PA]表征標(biāo)記復(fù)合物在檢測線上的轉(zhuǎn)化程度，在t=10 min， [A0]=10 mol/L時(shí)， 得到的結(jié)果如圖5所示。當(dāng)[P0]濃度較低時(shí)，[RPA]/[PA]幾乎隨著[P0]的增加而呈線性增加。當(dāng)標(biāo)記物[P0]超過一定值時(shí)，[RPA]/[PA]將達(dá)到最大值，此時(shí)[PA]的轉(zhuǎn)化情況最好；當(dāng)[P0]超過該值繼續(xù)增加，

[RPA]/[PA]略有下降，這可能是由于檢測線上R的結(jié)合能力有限導(dǎo)致的。

4.3 硝酸纖維素膜上的孔隙率對試條反應(yīng)的影響

考察了試條硝酸纖維素膜上的孔隙率對流過試條中混合液的流速的影響。從圖6可見，硝酸纖維素膜上孔隙率越小，孔徑越細(xì)，越有利于樣本液的流速。分析孔隙率對生成[RPA]的影響（圖7）可知，孔隙率對[RPA]的濃度影響不大。為了更好地分析孔隙率的影響，進(jìn)一步得到了[RPA]/[PA]與孔隙率的變化關(guān)系。如圖8所示，孔隙率影響了樣本液在試條中移動(dòng)的速度和樣本液中各物質(zhì)的反應(yīng)程度?？紫堵瘦^小時(shí)，PA能以相對較快的速度轉(zhuǎn)化為RPA，進(jìn)而使[RPA]/[PA]的值在同一時(shí)間內(nèi)以較快的速度攀升。但并不是孔隙率越小越好，如果孔隙率太小，樣本液在試條中的移動(dòng)速度過快，導(dǎo)致標(biāo)記混合物來不及與包被在檢測線上的抗體結(jié)合，也影響檢測效果。

5 結(jié) 論

基于夾心法免疫層析試條的反應(yīng)機(jī)理與對流擴(kuò)散方程建立其動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程的數(shù)學(xué)模型，并用COMSOL軟件對模型進(jìn)行仿真分析試條中各個(gè)參數(shù)對檢測結(jié)果的影響。得到的主要結(jié)論如下： （1） 通過模型優(yōu)化試條的參數(shù)能夠使生成的夾心復(fù)合物濃度與待測的目標(biāo)分析物濃度成正比，但需要注意試條的檢測范圍，從而避免試條出現(xiàn)Hook效應(yīng)。（2） 結(jié)合釋放墊上的標(biāo)記物濃度較小時(shí)，生成的夾心復(fù)合物濃度能與之成正比，但當(dāng)其達(dá)到一定值后，標(biāo)記物濃度的增加將不利于夾心復(fù)合物的生成。（3） 檢測線上包被的抗體濃度的增加有利于夾心復(fù)合物的轉(zhuǎn)化。 （4）硝酸纖維素膜上的孔隙率較小時(shí)，有利于樣本液的流動(dòng)和樣本液中各物質(zhì)的充分混合；而相對較大的孔隙率，則有利于樣本液與檢測線上包被的抗體更充分的結(jié)合，因此，選擇合適的材料和控制孔隙率對于試紙條的性能也很重要。

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Abstract A mathematical model of sandwich.type lateral flow immunoassay （LFIA） is established to describe the dynamic process of LFIA according to the biochemical principle of LFIA together with the convection.diffusion equations and the hydromagnetic equations. Based on the established model， the COMSOL software is utilized to simulate the dynamic process of LFIA. The simulation results not only demonstrate the relationships between the concentration of the sandwiched substance and the position or the time， but also analyze the influences of the initial concentrations of all substances and the structure on the performance of LFIA system when the target analyte A is from 0 to 20 mol/L， reporter particle P is from 1 × 10

2 mol/L to 1 × 103 mol/L and the porosity is from 0 to 1. Especially， within a certain concentration range， the increasing concentration of target analyte A and reporter particle P will enhance the quantitative performance of LFIA， and the porosity affects the result by controlling the flow rate of the test mixture and the material contact in the mixture.

Keywords Lateral flow immunoassay； Sandwich.type； Convection.diffusion equation； Mathematical model； Biochemical reaction process