自組裝有序納米銀線表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)牛奶中三聚氰胺

趙蕊池+王培龍+石雷+蘇曉鷗

摘 要 制備具有表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）增強(qiáng)效果的基底是獲得靈敏SERS檢測(cè)的基礎(chǔ)。本研究以多元醇法合成、流體流動(dòng)法組裝制備的有序納米銀線作為三聚氰胺的SERS增強(qiáng)基底，實(shí)現(xiàn)了樣品中痕量三聚氰胺的快速靈敏檢測(cè)。通過(guò)理論計(jì)算及實(shí)驗(yàn)考察得到了三聚氰胺的拉曼特征峰，優(yōu)化了三聚氰胺在有序納米銀線基底上的SERS檢測(cè)條件。在pH=8、水為溶劑、溶劑揮發(fā)時(shí)間為14 min的最佳條件下，三聚氰胺特征峰強(qiáng)度與濃度在0.05～1.00 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)R=0.997，檢測(cè)限為0.05 mg/L。在牛奶中添加不同濃度的三聚氰胺，其回收率為89.7%～109.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于6.8%。本方法對(duì)三聚氰胺檢測(cè)具有很好的靈敏度和穩(wěn)定性，為其它小分子化合物的SERS檢測(cè)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 有序納米銀線； 三聚氰胺； 表面增強(qiáng)拉曼散射

1 引 言

三聚氰胺（Melamine，C3N3（NH2）3），是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，由于其氮含量高（66.6%）常被非法添加到牛奶和各種乳制品中[1]。三聚氰胺難以代謝，動(dòng)物或人食用后會(huì)產(chǎn)生不同程度的腎衰竭，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡[2]。2011年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第10號(hào)公告規(guī)定，三聚氰胺在嬰兒配方食品中用量不得超過(guò)1 mg/kg，在其他食品中亦不得超過(guò)2.5 mg/kg[3]。因此，研究開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速并且高靈敏檢測(cè)食品中三聚氰胺的技術(shù)十分必要。

目前，三聚氰胺的檢測(cè)手段主要有質(zhì)譜法（MS）[4]、高效液相色譜法（HPLC）[5]、氣相色譜法（GC）[6]、電化學(xué)法[7]和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[8]等。上述方法雖然有很高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但大多數(shù)存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、技術(shù)要求高、儀器造價(jià)昂貴和樣品前處理繁瑣等不足[9]，因此很大程度上限制了這些技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）分析技術(shù)是以拉曼散射效應(yīng)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的一種分子結(jié)構(gòu)表征技術(shù)。當(dāng)一些分子被吸附到某些粗糙的金屬表面時(shí)，拉曼信號(hào)的強(qiáng)度會(huì)增加104～106倍，這種現(xiàn)象稱為表面增強(qiáng)拉曼散射[10，11]。SERS信號(hào)強(qiáng)度與其增強(qiáng)基底材料有關(guān)。目前應(yīng)用比較多的增強(qiáng)基底主要以銀、金、銅3種金屬材料為主，其中銀的增強(qiáng)活性最好[12]。例如，Li等[13]以包裹在SiO2外殼上金粒子為SERS增強(qiáng)基底檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺，檢測(cè)限為1 mg/L； Zhang等[14]以銀膠體為SERS增強(qiáng)基底，其牛奶中三聚氰胺的檢出限低至0.5 mg/L。納米銀線作為一種新興材料，將其作為SERS增強(qiáng)基底已成功地用于藥品中藥物成分的定量分析[15]。常見(jiàn)的納米銀線制備方法有模板法[16]、晶種法[17]、水熱法[18]和多元醇法[19]等。其中，多元醇法操作簡(jiǎn)單、原料易得、反應(yīng)體系環(huán)保易控，因此受到了科研工作者的青睞。很多研究表明，納米銀線呈有序排列能夠有效增強(qiáng)SERS的檢測(cè)信號(hào)，且信號(hào)重現(xiàn)性較好[20，21]。

本研究采用多元醇法合成、流體流動(dòng)法組裝、制備有序納米銀線，并將其應(yīng)用于三聚氰胺的SERS檢測(cè)。其有序納米銀線基底大大增強(qiáng)了牛奶中三聚氰胺的SERS檢測(cè)信號(hào)，有效克服了常用SERS增強(qiáng)基底（如銀或金納米溶膠）重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較差、分析結(jié)果精確度低的不足，使用此基底對(duì)三聚氰胺進(jìn)行定性與定量分析，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和靈敏度高的特點(diǎn)，可為乳制品的檢測(cè)提供技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

RamTracer@.200.HS型便攜式拉曼光譜儀（美國(guó)Opto Trace公司）；S.4800冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日立高新技術(shù)株式會(huì)社，上海）；XRD粉末衍射儀（Rigaku Dmax.2500）；48孔正壓固相萃取裝置（J2，美國(guó)）；TARGINTM VX.Ⅲ型多管渦旋振蕩器；明澈TM.D 24UV型超純水制備器（美國(guó)Millipore公司）；3K15型高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗儀；MG.2200型氮吹儀（Eyela，日本）；Vortex Genius 3新型旋渦混勻器（IKA，德國(guó)）；SPE離子交換柱（60 mg/3 mL）。實(shí)驗(yàn)中所用玻璃器皿均在王水（HCl.HNO3， 3∶1， V/V）中浸泡8 h以上，使用前用超純水沖洗，烘干后使用。

AgNO3（99%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW=55000）、乙二醇（99%）及AgCl（99%）均購(gòu)自Aldrich公司；三聚氰胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈、濃HNO3、三氯乙酸、乙酸鉛（北京化工廠）。所有試劑均為分析純，所有實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。市售某品牌袋裝純牛奶。

2.2 有序納米銀線的制備

通過(guò)多元醇法制備納米銀線（AgNWs）[22]。室溫下將0.34 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）加到20 mL乙二醇中，升溫至170℃，再加入25 mg AgCl粉末形成Ag的結(jié)晶核[19，23]。3 min后，在10 min內(nèi)分5次加入110 mg AgNO3粉末，將此混合體系反應(yīng)30 min。經(jīng)6000 r/min離心5 min后，用甲醇清洗得到AgNWs。在合成納米銀線過(guò)程中，乙二醇既為溶劑又為還原劑。

采用流體流動(dòng)法組裝有序納米銀線。將0.154 mol/L AgNWs乙醇懸浮液在800 μL/min的流速下流經(jīng)玻璃毛細(xì)管，得到內(nèi)壁附以有序納米銀線的毛細(xì)管拉曼增強(qiáng)基底。

2.3 樣品的制備

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取0.0100 g三聚氰胺粉末標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，用甲醇溶解并定容至100 mL， 得到100.00 mg/L三聚氰胺儲(chǔ)備液。

2.3.2 牛奶樣品的處理 （1）提取 取5 mL牛奶樣品，加入15 mL三氯乙酸溶液（ρ=10 g/L），搖勻后再加入1 mL乙酸鉛溶液（ρ=22 g/L）（其中三氯乙酸是強(qiáng)酸，鉛是重金屬，兩者均可使蛋白質(zhì)變性沉淀）。然后超聲30 min，10000 r/min離心5 min，提取上清液備用； （2）凈化 SPE柱分別經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化后，移取10 mL上清液分次上柱，對(duì)三聚氰胺進(jìn)行吸附。然后用3 mL水和3 mL甲醇洗滌SPE柱，洗去雜質(zhì)，抽干。再用3 mL、5%氨水.甲醇溶液洗脫三聚氰胺，收集洗脫液，抽干。洗脫液于50℃氮吹干后加1 mL水，振蕩、溶解、搖勻，待測(cè)[24]。