新型自組裝肽納米纖維支架材料的生物安全性評價(jià)*

陳碩，蔣電明，何彬，周敖

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016）

論著

新型自組裝肽納米纖維支架材料的生物安全性評價(jià)*

陳碩，蔣電明，何彬，周敖

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016）

目的評價(jià)新型自組裝肽納米纖維水凝膠支架材料D-RADA16的生物相容性及安全性，為該材料的臨床推廣應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。方法根據(jù)GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1∶2009《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》，選取體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)、全身急性毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、熱源試驗(yàn)、微核試驗(yàn)評價(jià)D-RADA16的生物相容性。結(jié)果細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，材料共培養(yǎng)組相對增殖率均＞90％，細(xì)胞毒性為1級，材料無細(xì)胞毒性。溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示，生物材料D-RADA16的溶血率為0.96％，符合＜5％的國家標(biāo)準(zhǔn)。各組小鼠活動(dòng)正常，7d內(nèi)無小鼠死亡，各組動(dòng)物未見中毒癥狀或不良反應(yīng)，7 d后各組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。7 d后處死動(dòng)物，肝、脾、腎大體觀察和蘇木精-伊紅染色法染色未見異常。熱原試驗(yàn)顯示，3只動(dòng)物體溫升高，最高0.5℃，升高總數(shù)為1.2℃，符合＜1.4℃的國家標(biāo)準(zhǔn)。皮內(nèi)刺激試驗(yàn)顯示，兔各時(shí)間點(diǎn)注射肽溶液后原發(fā)性刺激指數(shù)均為0分。遺傳毒性試驗(yàn)顯示，各實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組微核數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組微核數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），材料未見明顯致突變性。結(jié)論新型納米生物支架材料D-RADA16無細(xì)胞毒性、溶血作用、急性毒性、致熱原性、皮膚刺激性、遺傳毒性，具有良好的生物安全性和生物相容性，為材料進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

自組裝肽；右旋氨基酸；細(xì)胞毒性；生物安全性

自組裝肽（self-assembling peptide，SAP）是一種新型的生物支架材料。1995年ZHANG等[1]首次報(bào)道，SAP EAK16-Ⅱ（AEAEAKAKAEAEAKAK），此后各種新型SAP被陸續(xù)開發(fā)出來并廣泛應(yīng)用于組織工程。目前應(yīng)用較為廣泛的SAP大部分是由L型氨基酸構(gòu)成，很容易被體內(nèi)的蛋白酶降解，不能持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)揮生物學(xué)活性作用，限制其應(yīng)用范圍[2]。為提高SAP在體內(nèi)的穩(wěn)定性，研究人員開展大量的工作，而采用D型氨基酸來構(gòu)建SAP是一種很好的解決方案[3]。為此，筆者設(shè)計(jì)并合成一種新型SAP：D-RADA 16（其氨基酸序列為：AcN-RADARADARADARADA -CONH2），僅由D型氨基酸構(gòu)成。筆者推測D-RA DA16具有更好地生物學(xué)穩(wěn)定性，特別適用于在體內(nèi)需要長時(shí)間發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的領(lǐng)域，如藥物的控制釋放、神經(jīng)修復(fù)及誘導(dǎo)成骨等。

然而，生物材料在與人體直接接觸或植入人體內(nèi)時(shí)都可能存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性；其次，生物材料可能被機(jī)體吸收，長期植入活體內(nèi)可能發(fā)生明顯的生物降解；再次，生物材料與人體長時(shí)間接觸，在其緩慢的降解過程中也有可能釋放毒性物質(zhì)。因此，一種生物材料應(yīng)用于臨床前必須經(jīng)過一系列的生物安全性評價(jià)。

本試驗(yàn)根據(jù)GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1∶2009《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》[4]的生物相容性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)選取6個(gè)試驗(yàn)，采用體外實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，評價(jià)D-RADA16的生物相容性及安全性，為該材料的臨床推廣應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7～8周齡健康昆明小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量19～25 g；4周齡SD大鼠1只，體質(zhì)量約160 g，雄性；6周齡新西蘭大白兔6只，體質(zhì)量2.1～2.5 kg，雌性；上述動(dòng)物均由重慶醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證:SCXK（渝）2016-0210。

1.1.2 主要材料與儀器自組裝肽D-RADA16（上海波泰生物科技有限公司合成），SB-3200D超聲震蕩清洗儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司），草酸鉀（四川成都科隆化工試劑廠），苯酚（北京化工廠），環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），四唑鹽（美國Sigma公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Sigma公司），DMEM/F12培養(yǎng)液（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），0.25％胰蛋白酶（美國Hyclone公司），TE-2000U倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），Z52型醫(yī)用低速離心機(jī)（河北省保定市安新縣白洋離心機(jī)廠），高壓滅菌鍋（日本SANYO公司），600型恒溫水箱（金壇市中大儀器廠），移液器（德國Eppendorf公司），全波長酶標(biāo)儀（芬蘭賽默飛世爾公司），萬分之一天平（日本島津公司），超純水儀（美國Milliore公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肽母液的制備將肽130 mg溶于52 ml超純水中，配制母液濃度0.25％w/v（2.5 mg/ml），超聲震蕩30 s，4℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 材料浸提液制備使用0.9％無菌氯化鈉注射液作為浸提介質(zhì)，浸提比例為每1 ml 0.9％氯化鈉注射液中加入0.2 g D-RADA16材料。先取16 ml D-RADA16材料母液，加入少量PBS待其充分形成水凝膠，再加入80 ml 0.9％無菌氯化鈉注射液，使水凝膠材料全部沒入0.9％無菌氯化鈉注射液中，將之放置于有蓋的玻璃瓶中，并轉(zhuǎn)移到37℃、5％二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中靜置，持續(xù)浸提72 h后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用GB/T 16886.5-2011體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及四甲基偶氮唑鹽比色法[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2, 5-diphenyl-2-h-tetrazolium bromide，MTT]檢測肽溶液對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的毒性。取鼠齡4周，體質(zhì)量約160 g的SD大鼠1只，采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)BMSCs，傳3代后消化細(xì)胞，得到終濃度為1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。在96孔培養(yǎng)板中，加入100 μl/孔細(xì)胞懸液，置入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)板內(nèi)原培養(yǎng)液，分材料共培養(yǎng)組（A組），陰性對照組（B組），陽性對照組（C組）3組，每組設(shè)12孔。A組加入50 μl/孔肽溶液和50 μl DMEM/F12培養(yǎng)液，B組每孔加入100 μl DMEM/F12培養(yǎng)液，C組每孔加入50μl 64g/L的苯酚溶液和50 μl DMEM/F12培養(yǎng)液。將A、B、C組全部放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)2和4 d時(shí)取A、B、C組各6孔，加入MTT溶液20 μl/孔，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)中孵育4 h。4 h后吸去孔內(nèi)液體，加入DMSO 150 μl，低速搖床反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀于波長490 nm測其光密度（optical density，OD）值，并根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞的相對增殖率（the relative growth rate，RGR）。

PGR（％）=（實(shí)驗(yàn)組平均OD值÷陰性對照組OD值）×100％

細(xì)胞毒性標(biāo)準(zhǔn)[5]：分6級評定材料的毒性程度，RGR≥100％為0級；75％～9％為1級；50％～74％為2級；25％～49％為3級；1％～24％為4級；0為5級。

1.2.4 溶血試驗(yàn)采用GB/T 16886.4-2011推薦溶血試驗(yàn)法。取1只健康新西蘭大白兔，麻醉后采用含3.2％枸櫞酸鈉抗凝劑的負(fù)壓采血管，采用心臟穿刺法獲取兔血5 ml。反復(fù)顛倒混勻后，立即取抗凝血4 ml加入0.9％無菌氯化鈉注射液5 ml稀釋，置于37℃、5％CO2、濕度為100％的培養(yǎng)箱中備用。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、陽性對照組3組。實(shí)驗(yàn)組加入浸提液5 ml，陰性對照組加入0.9％無菌氯化鈉注射液5 ml，陽性對照組加入蒸餾水5 ml。全部組別置于37℃恒溫水浴箱中，30 min后加入稀釋兔血0.1 ml。輕搖混勻后繼續(xù)置于37℃水浴箱中，60 min后2 500 r/min離心5 min，吸取上清液移入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定上清液在波長545 nm處的OD值，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取平均值計(jì)算溶血率。

溶血率（％）=[（實(shí)驗(yàn)組OD值-陰性對照組OD值）÷（陽性對照組OD值-陰性對照組OD值）]× 100％

1.2.5 急性毒性試驗(yàn)采用GB/T16886.11-2011推薦系統(tǒng)毒性試驗(yàn)。取20只7～8周齡的昆明小鼠，將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對照組，每組10只，記錄每只小鼠的初始體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射肽溶液（濃度50 ml/kg），對照組小鼠腹腔注射0.9％無菌氯化鈉注射液（濃度50 ml/kg）。在注射后連續(xù)觀察7 d，每天觀察小鼠的進(jìn)食、活動(dòng)等一般情況及毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)量，并記錄注射后1、2和3 d后小鼠的體質(zhì)量變化。注射后7 d采用10％水合氯醛以10 ml/kg的劑量處死所有小鼠，切開腹腔，觀察各小鼠腹腔內(nèi)臟器有無腹水、腹腔臟器水腫、臟器粘連或壞死。每組隨機(jī)選2只小鼠的肝、脾、腎，切片后分別行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.2.6 熱原試驗(yàn)采用GB/T 16886.10-2011推薦熱原試驗(yàn)法。取3只健康新西蘭大白兔，體質(zhì)量2.1～2.5 kg，雌雄不限。開始正式實(shí)驗(yàn)前7 d預(yù)測兔肛溫，1次/h，共4次，體溫38.6～39.4℃，最大溫差≤0.4℃。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)符合實(shí)驗(yàn)要求[6]。在相同環(huán)境下采用相同飼料飼養(yǎng)。7 d后于相同室溫和濕度下開始正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前禁食2 h，將肛門體溫計(jì)插入兔肛門，深度約6 cm，時(shí)間約3 min，間隔30 min分別測3次體溫，取其平均值為正常體溫值。經(jīng)耳緣靜脈按10 ml/kg劑量緩慢注入已預(yù)熱至37℃的材料浸提液，注射后1、2和3 h測量動(dòng)物肛溫，以3次肛溫最高值減去正常體溫即為體溫升高度數(shù)。

1.2.7 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)采用GB/T 16886.10-2011推薦最大劑量耐受法進(jìn)行皮內(nèi)刺激試驗(yàn)。取3只健康新西蘭大白兔，體質(zhì)量2.1～2.5 kg，雌雄不限。試驗(yàn)前24h，采用電動(dòng)剃毛器小心剔除受試兔脊柱兩側(cè)各5 cm×30 cm的兔毛，避免造成皮膚損傷。75％乙醇消毒剔除兔毛后的局部皮膚。在受試兔脊柱兩側(cè)各選擇5個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)間隔2.5 cm，在右側(cè)各選取點(diǎn)處皮下注射0.2 ml肽溶液，左側(cè)各選取點(diǎn)處皮下注射0.2 ml 0.9％無菌氯化鈉溶液。注射后24、48和72 h注意觀察注射點(diǎn)局部及周圍皮膚有無紅斑和水腫等炎癥反應(yīng)。根據(jù)皮內(nèi)刺激評分系統(tǒng)[7]，記錄每只受試兔在所有3個(gè)試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)注射肽溶液后出現(xiàn)紅斑和水腫的分?jǐn)?shù)（皮內(nèi)刺激反應(yīng)評分見表1）再將所有得到的原發(fā)性刺激計(jì)分相加，用結(jié)果除以3，則為SAP水凝膠支架材料的原發(fā)性刺激指數(shù)（primarily stimulation index，PII）。其中0.0～0.4分為無刺激，0.5～1.9分為輕度刺激，2.0～4.9分為中度刺激，5.0～8.0分為強(qiáng)刺激。

表1 皮內(nèi)刺激評分表

1.2.8 遺傳毒性試驗(yàn)采用GB/T 16886.3-2011推薦遺傳毒性試驗(yàn)法（骨髓微核試驗(yàn)）。取50只健康昆明小鼠，體質(zhì)量20～25 g，隨機(jī)分5組：A、B、C 3個(gè)試驗(yàn)組，D（陽性對照組）和E組（陰性對照組），每組10只，雌雄各半。A、B、C組腹腔注射肽溶液（濃度分別為12.5、25和50 ml/kg），D組腹腔注射環(huán)磷酰胺（濃度60 mg/kg），E組腹腔注射0.9％無菌氯化鈉溶液。采用2次給藥法，2次給藥的時(shí)間間隔24 h，于第2次給藥后6h采用10％水合氯醛10ml/kg的劑量處死所有小鼠，取胸骨骨髓涂片，吉姆薩（Giemsa）染色。顯微鏡下觀察每只動(dòng)物1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（polychromatic erythrocytes，PCE），計(jì)數(shù)含有微核的細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），若方差齊，則組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)2 d后，實(shí)驗(yàn)組A組和陰性對照組B組細(xì)胞幾乎全部貼壁，折光性強(qiáng)，多為梭形和多角形，并見圓形分裂細(xì)胞；陽性對照組C組部分細(xì)胞未貼壁，成懸浮的死細(xì)胞，已貼壁的部分細(xì)胞圓縮化（見圖1A～C）。培養(yǎng)4 d，實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組細(xì)胞形態(tài)正常，生長旺盛，細(xì)胞膜完整，胞體呈長梭形，貼壁良好，整體呈漩渦狀改變；陽性對照組細(xì)胞數(shù)量減少，大部分殘存細(xì)胞胞體變小成圓形，核固縮，貼壁細(xì)胞聚集成團(tuán)，為中毒形態(tài)（見圖1D～F）。各組細(xì)胞RGR及細(xì)胞毒性分級結(jié)果見表2。MTT試驗(yàn)證實(shí)，D-RADA16與大鼠BMSCs共培養(yǎng)2和4d后，細(xì)胞RGR均＞90％。依據(jù)醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施指南[8]規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，D-RADA16的細(xì)胞毒性為1級，無細(xì)胞毒性。培養(yǎng)2和4 d后，各組OD值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 069.745和2 149.382，P= 0.211和0.194）。進(jìn)一步兩兩比較，培養(yǎng)2和4 d后，試驗(yàn)組與陰性對照組OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.161和-1.215，P=0.273和0.252）；試驗(yàn)組與陽性對照組OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=41.187和85.792，P=0.000）。各組細(xì)胞增殖趨勢見圖1G。

2.2 溶血試驗(yàn)結(jié)果

離心后，實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組類似，上層液體無色透明，下層為離心得到的紅細(xì)胞沉淀（見圖2）；陽性對照組離心后上層液體呈淡紅色，下層有較少的紅細(xì)胞沉淀。試驗(yàn)組、陰性對照組、陽性對照組OD值分別為（0.053±0.003）、（0.052±0.003）和（0.220± 0.005），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3376.860，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，試驗(yàn)組與陰性對照組OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.787，P=0.449）；試驗(yàn)組與陽性對照組OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -67.592，P=0.000）。根據(jù)醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施指南[8]規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，溶血率＜5％說明受檢材料符合醫(yī)用材料溶血要求，溶血率≥5％提示受檢材料有溶血作用。測得生物材料D-RADA16的溶血率為0.96％，符合＜5％的國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

各組小鼠觀察期內(nèi)一般情況及進(jìn)食、進(jìn)水均正常，未見明顯呼吸困難、驚厥、癱瘓及死亡發(fā)生。實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠體重呈上升趨勢。兩組小鼠24、48和72 h體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.003、0.000和0.177，P=0.957、0.997和0.679）（見表3）。7d后處死動(dòng)物，切開腹腔發(fā)現(xiàn)無腹水，腹腔臟器無肉眼可見的粘連及壞死征象，主要腹腔臟器（肝、脾、腎）大體觀察和組織切片HE染色未見異常（見圖3）。

圖1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 試驗(yàn)組、陰性對照組、陽性對照組離心后大體觀察

表2 各組BMSCs增殖活力比較（n=6）

圖3 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 熱原試驗(yàn)結(jié)果

3只動(dòng)物注射材料浸提液前，體溫分別是（39.13± 0.17）、（39.30±0.08）和（39.27±0.09）℃，注射材料浸提液后，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測最高體溫分別為39.6、39.6和39.7℃，3只動(dòng)物體溫分別升高為0.5、0.3和0.4℃，均＜0.6℃，升高的總數(shù)為1.2℃，符合＜1.4℃的國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)結(jié)果

3只新西蘭大白兔在注射肽溶液后24、48和72 h，右側(cè)注射點(diǎn)出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)情況與左側(cè)各注射點(diǎn)注射0.9％無菌氯化鈉溶液的情況類似，未見明顯刺激反應(yīng)（見圖4），無明顯紅斑、局部水腫或皮膚異常壞死等情況發(fā)生，24、48和72 h原發(fā)性刺激指數(shù)均為0分。

2.6 遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果

各組小鼠胸骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核數(shù)見表4。雌性及雄性組分別行方差分析，雌性各組微核數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=95.750，P=0.000）。進(jìn)一步用兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)組（A、B、C組）微核數(shù)分別與陰性對照組（E組）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.535、0.535和0.001，P=0.713、0.713和1.000）；A、B、C組微核數(shù)分別與陽性對照組（D組）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-11.159、-11.159和-12.124，P= 0.000）。

雄性各組微核數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 111.667，P=0.000）。進(jìn)一步用兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)，A、B、C組微核數(shù)分別與E組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.447、1.897和0.632，P=0.672、0.211和0.672）；A、B、C組微核數(shù)分別與D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-12.333、-13.510和-14.241，P=0.000）。

表3 兩組不同時(shí)間點(diǎn)材料對動(dòng)物體質(zhì)量的影響（n=10，g，x±s）

圖4 不同時(shí)間新西蘭大白兔注射局部及周圍皮膚組織反應(yīng)

表4 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果（n=5，個(gè)，x±s）

3 討論

作為一種新型納米生物支架材料，SAP可在陽離子存在的水溶液中形成宏觀的水凝膠，以及微觀的納米纖維結(jié)構(gòu)，納米纖維進(jìn)一步形成三維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)[1]。原子力顯微鏡和掃描電鏡顯示，其孔徑約為5～200 nm，其纖維直徑約為10 nm，作為細(xì)胞培養(yǎng)的支架，可實(shí)現(xiàn)真正意義上的三維培養(yǎng)要求[3]。此后，SAP作為一種具有極佳應(yīng)用前景的納米纖維支架材料，逐步被應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和組織工程的各個(gè)領(lǐng)域，如骨修復(fù)、軟骨修復(fù)、神經(jīng)修復(fù)、心臟修復(fù)、創(chuàng)傷愈合、成血管、快速止血等等[9-13]。但一直以來，研究人員更傾向于使用L型即左旋氨基酸設(shè)計(jì)左旋自組裝肽構(gòu)建納米纖維支架，用于組織工程的三維微環(huán)境構(gòu)建[14]。然而，D型即右旋氨基酸構(gòu)成的肽鏈及蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定，因?yàn)榈鞍酌缚梢越到釲型肽鏈，但不能降解D型肽鏈[14-15]。

SAP在水溶液中可吸收大量水分凝膠化，從而使水分充斥于納米纖維的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，較大程度地伸展被交聯(lián)的大分子肽鏈，使整個(gè)材料形成含水量極高（＞99％）的水凝膠結(jié)構(gòu)，這與充盈大量液體的機(jī)體組織及其相似。水凝膠材料柔軟、濕潤的表面，以及與組織的親和性大大減少材料對于機(jī)體的刺激性。因此，一般認(rèn)為SAP材料具有良好的生物相容性。

然而，任何一種生物材料在獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用之前，首先應(yīng)該具備使用的安全性和良好的生物相容性，而體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)是目前評價(jià)材料生物安全性的主要手段[16]。作為一種新型材料，D-RADA16的安全性尚不明確。顯而易見，D-RADA16的降解產(chǎn)物是D型氨基酸。目前已知一些D型氨基酸對細(xì)胞的生長有毒性和抑制作用，如D-丙氨酸和D-天冬氨酸[17]。為確保新型生物材料D-RADA16在臨床應(yīng)用時(shí)的安全性，必須進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)試驗(yàn)，以便提供進(jìn)一步有關(guān)安全性的數(shù)據(jù)和資料。

醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)系列標(biāo)準(zhǔn)（即GB/T16886/ IS010993）是醫(yī)療器械安全性評價(jià)兩大基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)之一，對于保證醫(yī)療器械安全性發(fā)揮重要作用。為保證本研究的規(guī)范性、時(shí)效性及結(jié)果的準(zhǔn)確性，筆者依據(jù)最新版本GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1∶2009《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定和推薦的評價(jià)生物材料生物安全性的主要體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)方法，選擇細(xì)胞毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、微核試驗(yàn)對D-RADA16的生物安全性和生物相容性進(jìn)行全面評價(jià)。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，測定由材料導(dǎo)致的細(xì)胞溶解或死亡，以及對細(xì)胞生長的抑制和其他影響。該試驗(yàn)屬體外試驗(yàn)，能在短期內(nèi)檢出材料對細(xì)胞新陳代謝的影響，對毒性物質(zhì)具有較高的敏感性，同時(shí)可直接觀察到細(xì)胞在材料表面的粘附情況及界面反應(yīng)，可為材料的細(xì)胞相容性提供最直觀的證據(jù)[18]，從而能快速篩選材料，是所有生物學(xué)試驗(yàn)中首選的項(xiàng)目。本研究通過倒置相差顯微鏡觀察到D-RADA16水凝膠支架材料與BMSCs共培養(yǎng)2和4 d后，細(xì)胞生長旺盛，形態(tài)正常，整體呈漩渦狀改變。MTT試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其細(xì)胞RGR均＞90％，根據(jù)《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》，生物材料D-RADA16對大鼠BMSCs的細(xì)胞毒性為1級，說明該材料無細(xì)胞毒性。

溶血試驗(yàn)評價(jià)血液接觸材料后的相互作用，被認(rèn)為是細(xì)胞毒性評價(jià)的一個(gè)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也是醫(yī)療器械生物學(xué)安全性測評中最為常用的實(shí)驗(yàn)。本研究中實(shí)驗(yàn)組及陰性對照組涂片鏡檢均未見紅細(xì)胞破裂或凝聚。酶標(biāo)儀檢測OD值后計(jì)算出D-RADA16的溶血率為0.96％，符合溶血率＜5％的國家標(biāo)準(zhǔn)，說明D-RADA16材料溶血性符合安全標(biāo)準(zhǔn)，無溶血作用。

急性全身毒性試驗(yàn)是體內(nèi)試驗(yàn)之一，根據(jù)材料與人體的接觸途徑，將材料在24 h以內(nèi)通過靜脈注射、口服、腹腔注射或吸入、皮膚接觸等途徑作用于受試動(dòng)物體內(nèi)，觀察動(dòng)物的全身反應(yīng)，從而評價(jià)醫(yī)療器械是否釋放毒性物質(zhì)。其優(yōu)點(diǎn)包括程序簡單，成本低，用時(shí)省，廣泛適用于短期或長期應(yīng)用于體內(nèi)的器械。本研究中結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，小鼠一般狀況良好，體質(zhì)量正常增加。7 d后處死動(dòng)物，大體觀察和組織切片HE染色均未見異常。另外該部分實(shí)驗(yàn)還包括熱原試驗(yàn)，檢測材料的致熱反應(yīng)。其方法是將一定量的材料浸提液經(jīng)靜脈途徑注入動(dòng)物體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測動(dòng)物體溫變化，以確定浸提液中的熱原量是否符合要求。本試驗(yàn)中各觀察時(shí)間點(diǎn)兔體溫升高均＜0.6℃，升高的總數(shù)為1.2℃，符合＜1.4℃的國家標(biāo)準(zhǔn)，說明材料D-RADA16對受試動(dòng)物無致熱作用。

皮內(nèi)刺激試驗(yàn)屬體內(nèi)試驗(yàn)，方法相對比較成熟，敏感性較高，因此為各類醫(yī)用材料及器械必須評價(jià)的項(xiàng)目之一。試驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組各時(shí)相點(diǎn)注射后反應(yīng)情況相似，未見皮膚刺激反應(yīng)，說明材料D-RADA16無刺激性。

本課題組選用GB/T 16886.5-2011/ISO 10993-5:2009標(biāo)準(zhǔn)中推薦的短期遺傳毒性試驗(yàn)做初步篩選，如果短期試驗(yàn)陰性可暫不進(jìn)行致癌試驗(yàn)。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞核試驗(yàn)是目前應(yīng)用最為廣泛的微核試驗(yàn)。在眾多的致突變初篩試驗(yàn)中，該試驗(yàn)經(jīng)濟(jì)、簡單、快速，尤適用于檢驗(yàn)材料可浸出成分的潛在致突變性[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓微核試驗(yàn)陰性，表明材料D-RADA16不具有致染色體畸變作用。

綜上所述，依據(jù)GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1:2009《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》最新版本所規(guī)定和推薦的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)方法，選擇細(xì)胞毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)對D-RADA16的生物安全性和生物相容性進(jìn)行全面評價(jià)，得到如下結(jié)論：新型SAP納米纖維水凝膠支架材料D-RADA16無細(xì)胞毒性、溶血作用、急性毒性、致熱原性、皮膚刺激性、遺傳毒性，具有良好的生物安全性和生物相容性，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究為材料D-RADA16下一步的細(xì)胞生物學(xué)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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（童穎丹 編輯）

Biological safety of designer self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffolds*

Shuo Chen,Dian-ming Jiang,Bin He,Ao Zhou (Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

ObjectiveTo evaluate the biological safety of designer self-assembling peptide(SAP)nanofiber hydrogel scaffolds D-RADA16,so as to provide experimental evidence for the clinical application of the material.MethodsAccording to Biological Evaluation of Medical Devices(GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1: 2009),physiological saline lixivium of the biomaterial or the hydrogel biomaterial was used for in vitro cytotoxicity test,hemolysis test,acute toxicity test,pyrogen test,intradermal irritation test,and micronucleus test to evaluate the biocompatibility of the material.ResultsIn the cytotoxicity test,the relative growth rate of the experimental group was above 90％,and the toxicity of D-RADA16 was graded 1,indicating no cytotoxicity. The hemolysis rate of the lixivium was 0.96％,which was lower than the national standard(＜5％).The activity of mice was normal in the acute toxicity test.No animal died and no toxicity symptom or adverse effect was shown within 7 d.The increase of average daily weight showed no statistically significant difference between the experimental group and the control group after 7 d(P＞0.05).The mice were sacrificed after 7 d,and no abnormal changes were observed in general observation and HE staining of the liver,spleen or kidneys.Themaximum increase of the body temperature in the experimental group was 0.5℃,and the total increase of body temperature of the three experimental animals was 1.2℃,which met the national standard in the pyrogen test(＜1.4℃).Intradermal irritation test showed that the primary irritation index was 0 at every defined time point.In the micronucleus test,the results showed that there was no statistically significant difference at micronucleus number between the experimental groups and the negative control group(P＞0.05),and there were statistically significant differences between the experimental groups and the positive control group(P＜0.01). Therefore,potential mutagenicity was not observed in the micronucleus test.ConclusionsDesigner SAP hydrogel scaffolds D-RADA16 does not have cytotoxicity,hemolytic effect,acute toxicity,pyrogenicity,skin irritation or genetic toxicity.It has good biological safety and biocompatibility,therefore exhibits a promising clinical application prospect and provides theoretical basis for further research of cell biology study and clinical application.

self-assembling peptide;D-amino acid;cytotoxicity;biological safety

R318.08

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.004

1005-8982（2017）01-0016-08

2016-04-12

國家自然科學(xué)基金（No：81472057）

蔣電明，E-mail：jdm571026@vip.163.com

陳碩，現(xiàn)工作單位為四川省都江堰市人民醫(yī)院骨科