劉芝君，胡予，杜曉慶，黃業(yè)傳，王艷蓉

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010)

臘肉酶解物抗氧化性研究

劉芝君，胡予，杜曉慶，黃業(yè)傳*，王艷蓉

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010)

為研究臘肉酶解液的抗氧化性，將四川臘肉用動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶進(jìn)行水解，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解條件。結(jié)果表明：最優(yōu)酶解條件為53.3 ℃，6 h，0.25%(酶量)，1∶3(料液比)，在此條件下臘肉樣品水解度達(dá)7.35%。取上述酶解液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò)測(cè)定其對(duì)羥基自由基(·OH)與DPPH自由基的清除能力對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)臘肉酶解液濃度為10%時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到79.79%，其IC50為6.19%；當(dāng)臘肉酶解液濃度為5%時(shí)，羥基自由基(·OH)清除率達(dá)到70.61%，其IC50為3.26%。

臘肉；水解度；羥基自由基(·OH)；DPPH；抗氧化

臘肉是我國(guó)具有悠久歷史的傳統(tǒng)干腌肉制品之一，它是將原料肉用食鹽、硝酸鹽、糖和調(diào)味香料等腌制后，再經(jīng)晾曬或烘烤、煙熏處理等工藝加工而成的生肉類(lèi)制品，具有色澤美觀(guān)、風(fēng)味濃郁、貯藏性好、食用方便等特點(diǎn)，是非常受人們喜愛(ài)的傳統(tǒng)肉制品[1]。目前借助于現(xiàn)代食品科學(xué)和工程技術(shù)手段，雖然傳統(tǒng)腌臘肉制品產(chǎn)業(yè)有了可喜的成績(jī)，但與其他食品產(chǎn)業(yè)和肉類(lèi)工業(yè)相比，傳統(tǒng)腌臘肉制品的發(fā)展水平仍然較低，很多基礎(chǔ)科學(xué)研究仍然較為薄弱，加工理論仍不成熟，機(jī)械裝備水平有限[2]。

蛋白質(zhì)酶解是指蛋白質(zhì)在酶的作用下降解成肽類(lèi)以及更小分子量氨基酸的過(guò)程，是改造蛋白質(zhì)、實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)功能多元化、提高蛋白質(zhì)價(jià)值的最有效途徑之一，因其作用過(guò)程溫和、高效、安全性高且易控制，已成為當(dāng)今蛋白質(zhì)加工領(lǐng)域最有前途的發(fā)展方向之一。酶解產(chǎn)物具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、易消化、加工性能改善、呈味更加豐富等特點(diǎn)，而且還具有很多重要生理功能，如抗氧化性。我國(guó)利用蛋白酶解法制備食品基料方面的研究起步較晚，雖然我國(guó)的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，但應(yīng)用力度還不夠，酶解基礎(chǔ)理論研究相比歐美發(fā)達(dá)國(guó)家很薄弱。在畜禽產(chǎn)品方面，研究最多的為雞肉及其產(chǎn)品，如對(duì)碎雞肉、雞雜碎、雞骨架、雞頭等的酶解都有較多報(bào)道，而在豬產(chǎn)品方面的研究很少，在原料方面有少量關(guān)于豬皮、豬骨和豬血酶解的報(bào)道，在產(chǎn)品方面對(duì)火腿酶解的相關(guān)報(bào)道較多，而對(duì)臘肉則沒(méi)有任何報(bào)道。

蛋白質(zhì)酶解物具有抗氧化性主要是酶解過(guò)程中會(huì)生成一些生物活性肽，F(xiàn)itzgerald等[3]研究結(jié)果表明，生物活性肽在降血壓、抗氧化、抗癌、抗糖尿病等方面有顯著效果?，F(xiàn)已有部分研究者對(duì)肉制品酶解物的抗氧化性進(jìn)行了研究，如倪孔巍等[4]通過(guò)花蟹肉酶解物與還原糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了抗氧化性研究，結(jié)果表明其抗氧化能力較好。對(duì)于腌臘制品，也有對(duì)一些火腿制品進(jìn)行酶解的研究，例如陳黎洪等[5]對(duì)金華火腿副產(chǎn)品進(jìn)行酶解，并取其酶解物進(jìn)行美拉德反應(yīng)以測(cè)定其MPRs的抗氧化活性；Elizabeth Escudero等[6，7]對(duì)西班牙火腿進(jìn)行酶解研究，其研究結(jié)果表明西班牙火腿酶解液具有一定抗氧化及抗高血壓能力。

盡管關(guān)于肉制品酶解物抗氧化性已經(jīng)有了一些報(bào)道，但關(guān)于臘肉酶解及酶解物的抗氧化性現(xiàn)沒(méi)有任何報(bào)道，而根據(jù)前期研究，臘肉具有較強(qiáng)的抗氧化性，且臘肉水解后可以作為調(diào)味品和調(diào)味品的原料。臘肉中的抗氧化物質(zhì)可能來(lái)源于兩部分：一是煙熏過(guò)程中產(chǎn)生的大量酚類(lèi)；二是在臘肉較長(zhǎng)時(shí)間的加工過(guò)程中，發(fā)生了美拉德反應(yīng)，很多美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有抗氧化性。因此，本研究擬以四川臘肉為原料，對(duì)其進(jìn)行酶解、優(yōu)化酶解工藝，并測(cè)定酶解物的抗氧化性，研究其抗氧化機(jī)理，以此為臘肉的深加工及利用臘肉水解產(chǎn)物生產(chǎn)相關(guān)調(diào)味品等奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

臘肉：市售。

1.2 主要試劑

動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶(食品級(jí))：銳陽(yáng)生物。

酚酞指示劑、中性甲醛、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、無(wú)水乙醇等：均為分析純(AR)以上級(jí)別試劑；DPPH 上海金穗生物科技有限公司。

試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.3 主要儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇常州澳華儀器有限公司；LDZ5-2低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；UV1000分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法進(jìn)行[8]。

1.4.2 酶解液的制備

取從超市所購(gòu)的臘肉，用刀切成細(xì)小顆粒并剁碎，稱(chēng)取10 g樣品于燒杯中，在合適的酶量、酶解時(shí)間、料液比、酶解溫度下進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)完畢后取出于90 ℃滅酶10 min，在4800 r/min離心10 min，考慮脂肪對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，除去酶解液上層脂肪后，取上清液以測(cè)定其水解度[9,10]。

1.4.3 水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法測(cè)定游離氨基氮含量[11]，吸取1.4.2中制取的酶解液20 mL，稀釋定容至100 mL，準(zhǔn)確吸取已稀釋的樣品溶液10 mL于三角瓶中，加入10 mL中性甲醛，滴加2～3滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅，且30 s不褪色即為終點(diǎn)，做3次平行試驗(yàn)；同時(shí)用去除二氧化碳的蒸餾水替代樣品進(jìn)行滴定，做為空白試驗(yàn)。

水解度(DH)=游離氨基氮含量/總含氮量×100%[12]。

1.4.4 酶解條件單因素試驗(yàn)

1.4.4.1 酶量對(duì)反應(yīng)的影響

稱(chēng)取制備好的樣品10 g，準(zhǔn)確稱(chēng)取占樣品總質(zhì)量0，0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%的動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶，加入30 mL水，攪拌均勻后用保鮮膜密封，置于50 ℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)5 h，反應(yīng)完畢后取出于90 ℃滅酶10 min，在4800 r/min離心10 min，取上清液以測(cè)定其水解度。

1.4.4.2 料液比對(duì)反應(yīng)的影響

稱(chēng)取制備好的樣品10 g，酶解條件為酶量0.2%，溫度50 ℃，酶解時(shí)間5 h，加水量(樣品∶水)1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7。反應(yīng)完畢后于90 ℃滅酶10 min，在4800 r/min離心10 min，取上清液以測(cè)其水解度。

1.4.4.3 時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

稱(chēng)取制備好的樣品10 g，酶解條件為酶量0.2%，溫度50 ℃，加水量(樣品∶水)1∶3，酶解時(shí)間0，1，2，3，4，5，6，7 h。反應(yīng)完畢后于90 ℃滅酶10 min，在4800 r/min離心10 min，取上清液以測(cè)其水解度。

1.4.4.4 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

稱(chēng)取制備好的樣品10 g，酶解條件為酶量0.2%，酶解時(shí)間5 h，加水量(樣品∶水)1∶3，酶解溫度40，45，50，55，60 ℃。反應(yīng)完畢后于90 ℃滅酶10 min，在4800 r/min離心10 min，取上清液以測(cè)其水解度。

1.4.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

根據(jù)1.4.4中單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取酶量、時(shí)間、溫度3個(gè)因素，運(yùn)用Design Expert 8.06軟件按表1做三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定制備臘肉酶解液的最優(yōu)條件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因子水平表

1.4.6 清除羥基自由基(·OH)能力的測(cè)定

根據(jù)Motoko Ohata、徐清萍、王文莉等[13-15]的方法，略加修改，分別取由最優(yōu)酶解條件下得到的酶解液稀釋成不同濃度的酶解液2 mL，加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4，2 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇，混勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的雙氧水2 mL啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃水浴保溫30 min，以蒸餾水作為空白對(duì)照，于510 nm下測(cè)吸光度；以9 mmol/L的FeSO41 mL，9 mmol/L的水楊酸-乙醇2 mL，不同濃度的酶解液2 mL為本底吸收，每個(gè)試樣做3次平行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)計(jì)算羥基自由基(·OH)的IC50值，即清除羥基自由基(·OH)達(dá)到50%所需的酶解液濃度。

清除率計(jì)算公式如下：

·OH清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%。

式中: A0為空白對(duì)照的吸光度值；Ax為加入樣液的吸光度值；Ax0為不加雙氧水的樣液的吸光度值。

1.4.7 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

根據(jù)Zhu C Z、豆海港、江敏等[16-18]的方法，略加修改，用無(wú)水乙醇配制2.0×10-4mol/L的DPPH溶液，于棕色瓶中低溫避光保存?zhèn)溆?。分別取2 mL由最優(yōu)酶解條件下得到并稀釋成不同濃度的酶解液于比色管中，加入2 mL配制好的DPPH溶液，混合均勻，置于暗處反應(yīng)30 min，移入1 cm比色皿中，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，于517 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)i，同時(shí)測(cè)定2 mL樣液加2 mL無(wú)水乙醇于暗處反應(yīng)30 min后的吸光度值A(chǔ)j，以及2 mL DPPH加2 mL蒸餾水于暗處反應(yīng)30 min后的吸光度值A(chǔ)0，每個(gè)試樣做3次平行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)計(jì)算DPPH自由基的IC50值，即清除DPPH自由基達(dá)到50%所需的酶解液濃度。

酶解液對(duì)DPPH的清除率按下式計(jì)算：

清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。

式中: A0為試劑空白的吸光值；Ai為樣液的吸光值；Aj為樣液本底的吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本文利用Excel對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，再利用Design Expert 8.06對(duì)酶解優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶量對(duì)反應(yīng)的影響

動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶用量對(duì)臘肉蛋白水解度的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶量對(duì)臘肉水解度的影響

水解度在一定范圍內(nèi)隨動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶濃度的增大而增大，酶用量較低時(shí)，臘肉蛋白水解度較小，但當(dāng)濃度增大到0.2%以后,水解度有下降的趨勢(shì)。因酶量由0.15%增加到0.2%時(shí)，臘肉蛋白水解度增加了8.7%，而后由0.2%變?yōu)?.25%時(shí)水解度反而下降了4.3%。可能因酶量與反應(yīng)底物達(dá)到飽和，水解度的變化較為緩慢。因此，確定動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶的用量為0.15%～0.25%。

2.2 料液比對(duì)反應(yīng)的影響

料液比對(duì)臘肉蛋白水解度的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)臘肉蛋白水解度的影響

在料液比為1∶1時(shí)水解度達(dá)到最大值，再繼續(xù)提高水量，所得的水解度出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其中在料液比達(dá)到1∶4之前下降趨勢(shì)較大，料液比達(dá)到1∶4后，下降趨勢(shì)較小。料液比由1∶3變?yōu)?∶4時(shí)，臘肉蛋白水解度下降了32.4%，料液比降為1∶5時(shí)，與料液比為1∶4時(shí)相比水解度下降了22.5%?？紤]成本等問(wèn)題，確定料液比為1∶3，在此條件下臘肉蛋白水解度為5.98%。

2.3 時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

酶解時(shí)間對(duì)臘肉蛋白水解度的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)臘肉蛋白水解度的影響

水解度在一定時(shí)間范圍內(nèi)隨酶解時(shí)間的增大而增大，酶解時(shí)間較短時(shí)，臘肉蛋白水解度較小，且隨時(shí)間的增加水解度也相應(yīng)有所增加，但當(dāng)時(shí)間達(dá)到5 h以后，水解度的變化較為緩慢。水解時(shí)間由4 h變?yōu)? h時(shí)，臘肉蛋白水解度增加了17.3%，但是由5 h變?yōu)? h只增加了0.9%，說(shuō)明水解時(shí)間達(dá)到5 h后，水解基本達(dá)到平衡。這可能是由于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使得底物被基本消耗完全造成。因此，確定酶解時(shí)間為4～6 h。

2.4 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

酶解溫度對(duì)臘肉蛋白水解度的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)臘肉蛋白水解度的影響

水解度先隨溫度升高而增大，但超過(guò)一定溫度后水解度反而降低。當(dāng)溫度由45 ℃升為50 ℃時(shí)，臘肉蛋白水解度增加了18.2%，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，其水解度與50 ℃時(shí)相同，繼續(xù)升高溫度，水解度下降趨勢(shì)較大，可能因?yàn)闇囟冗^(guò)高使動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶的活性受到影響，導(dǎo)致水解度下降。由圖4可知試驗(yàn)最佳溫度在50～55 ℃之間，為更好地確定最優(yōu)試驗(yàn)溫度，選取酶解溫度為45～55 ℃。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由上述單因素試驗(yàn)結(jié)果選取3個(gè)因素做酶解優(yōu)化試驗(yàn)。雖然料液比對(duì)酶解的影響較大，但對(duì)于酶解液的收集及后續(xù)試驗(yàn)操作不便，且與酶量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響有重合部分，則優(yōu)化試驗(yàn)中不選擇料液比。運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)水解度顯著影響的因素:酶量、溫度、時(shí)間，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)[19-23]，設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.5.2 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行回歸擬合，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design Expert 8.06軟件，通過(guò)對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=-62.09825-61.82000A-3.09875B+3.00725C+0.35000AB+0.71000AC-0.033000BC+80.80000A2+0.50950B2-0.028020C2。

表3 方差分析表

注：“**”表示差異極顯著(P<0.001)，“*”表示差異顯著(P<0．05)。

由表3 可知，本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型極顯著(P<0．001)，且方程失擬項(xiàng)不顯著(P=0.5661>0．05)，說(shuō)明各因素值與響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型來(lái)函數(shù)化。相關(guān)系數(shù)R2=0．9809，表明水解度的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間具有較好的擬合度；其校正決定系數(shù)RAdj2=0．9563，說(shuō)明該模型能解釋95.63%響應(yīng)值的變化，表明只有約4.73%的水解度的總變異不能用此模型來(lái)解釋。從3個(gè)因素對(duì)水解度的影響來(lái)看，回歸方程的一次項(xiàng)酶量、溫度、時(shí)間對(duì)水解度的線(xiàn)性效應(yīng)顯著，影響順序?yàn)镃>B>A，說(shuō)明相對(duì)來(lái)講，溫度是最重要的因素，其次是時(shí)間；二次項(xiàng)B2和C2對(duì)水解度的曲面效應(yīng)顯著。3個(gè)因素對(duì)水解度交互作用的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖5～圖7。

圖5 時(shí)間與溫度對(duì)臘肉蛋白水解度的影響

圖6 溫度與酶量對(duì)臘肉蛋白水解度的影響

圖7 時(shí)間與酶量對(duì)臘肉蛋白水解度的影響

因3個(gè)因素的交互作用都不顯著，相比之下AC(酶量和溫度)、BC(時(shí)間和溫度)對(duì)臘肉蛋白的水解度交互作用影響接近顯著。

由圖5可知，隨著溫度升高，水解度呈先升后降的明顯趨勢(shì)。這可能是由于酶活性隨溫度升高而逐漸增強(qiáng)，但繼續(xù)升溫可導(dǎo)致部分酶失活。從等高線(xiàn)圖中發(fā)現(xiàn)，酶解溫度較低時(shí)等高線(xiàn)較密，說(shuō)明這段溫度變化對(duì)水解度影響較大。時(shí)間曲線(xiàn)較為平緩，說(shuō)明時(shí)間對(duì)水解度影響不大。酶解溫度較高時(shí)等高線(xiàn)稀疏，說(shuō)明這段溫度變化對(duì)水解度的影響較小。時(shí)間等高線(xiàn)變化舒緩，間距較寬，說(shuō)明時(shí)間對(duì)水解度影響并不顯著。

由圖6可知，酶量曲線(xiàn)比較平緩，說(shuō)明酶量在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)水解度影響不明顯。溫度曲線(xiàn)變化與圖5相似，都呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。從等高線(xiàn)圖中發(fā)現(xiàn)，溫度較低時(shí)等高線(xiàn)較密，低溫時(shí)對(duì)水解度影響較大，高溫時(shí)等高線(xiàn)較稀疏，則其對(duì)水解度影響較小。加酶量等高線(xiàn)變化舒緩，間距較寬，對(duì)水解度影響較小。

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert 8.06軟件中的Optimization分析得出優(yōu)化結(jié)果，即獲得較高水解度的條件為動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶用量0.25%，溫度53.30 ℃，時(shí)間6 h，動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶水解臘肉蛋白的水解度預(yù)測(cè)可達(dá)到7.36%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在最佳酶解條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的水解度為7.35%，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶對(duì)臘肉的水解情況。

2.6 酶解液抗氧化能力測(cè)定

2.6.1 清除DPPH自由基的能力

本試驗(yàn)在最優(yōu)酶解條件下得到酶解液并對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋,其濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 酶解液濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基清除率隨酶解液濃度的增大而增大，當(dāng)酶解液濃度達(dá)到10%時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到79.79%，Lu-juan Xing等[24]對(duì)宣威火腿進(jìn)行酶解并測(cè)定其抗氧化活性得到在酶解液濃度為0.5 mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除率達(dá)到74.45%。與 Lu-juan Xing等試驗(yàn)結(jié)果相比較，本試驗(yàn)得到的臘肉酶解物的DPPH清除效果有較大優(yōu)勢(shì)。且由圖8可知酶解液濃度與DPPH自由基清除能力有一定的線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程為y=8.2232x-0.9240，相關(guān)系數(shù)R2=0.9915。由上述方程可求得臘肉酶解液清除DPPH自由基的IC50為6.19%。

2.6.2 清除羥基自由基(·OH)的能力

本試驗(yàn)在最優(yōu)酶解條件下得到酶解液并對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋,其濃度對(duì)羥基自由基(·OH)清除率的影響結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 酶解液濃度對(duì)羥基自由基(·OH)清除率的影響

羥基自由基(·OH)的清除率隨酶解液濃度增大而增大，當(dāng)酶解液濃度為5%時(shí)，羥基自由基(·OH)清除率達(dá)到70.61%。Zhu C Z等對(duì)金華火腿進(jìn)行不同條件下的酶解，取在最優(yōu)條件下的酶解液測(cè)其清除羥基自由基的能力，其清除率達(dá)到51.8%。與Zhu C Z等試驗(yàn)結(jié)果相比較，本試驗(yàn)得到的臘肉酶解物的羥基自由基(·OH)清除效果有較大優(yōu)勢(shì)。由圖9可知酶解液濃度與羥基自由基(·OH)清除率有一定線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程為y=12.471x+9.2709，回歸系數(shù)R2=0.9954。由上述方程可求得臘肉酶解液清除羥基自由基(·OH)的IC50為3.26%。

3 結(jié)論

本文采用動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶對(duì)臘肉進(jìn)行水解，最優(yōu)酶解條件為溫度53.30 ℃，酶量0.25%，時(shí)間6 h，料液比1∶3，在此條件下臘肉蛋白水解度為7.35%。對(duì)最優(yōu)酶解條件下得到的酶解液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)〔煌♂対舛鹊拿附庖哼M(jìn)行DPPH自由基和羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)DPPH自由基清除能力、羥基自由基(·OH)清除能力與酶解液濃度呈現(xiàn)出一定的線(xiàn)性關(guān)系。臘肉酶解物抗氧化能力可根據(jù)DPPH自由基及羥基自由基(·OH)的IC50值表示，由相應(yīng)線(xiàn)性回歸方程可測(cè)得DPPH自由基的IC50為6.19%，羥基自由基(·OH)的IC50為3.26%。與魷魚(yú)酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化能力及火腿酶解物抗氧化能力相比，臘肉酶解物抗氧化能力較優(yōu)。

[1]陳鑫炳,范素琴.臘肉風(fēng)味的研究[J].肉類(lèi)工業(yè),2010(2):31-34.

[2]王虎虎,劉登勇,徐幸蓮,等.我國(guó)傳統(tǒng)腌臘肉制品產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].肉類(lèi)研究,2013,27(9):36-40.

[3]Fitzgerald C, Mora-Soler L, Gallagher E, et al. Isolation and characterization of bioactive pro-peptides with in vitro renin inhibitory activities from the macroalgaPalmariapalmate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012，60(30):7421-7427.

[4]倪孔巍,張萌,徐大倫,等.花蟹肉酶解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2015,34(3):239-245.

[5]陳黎洪,唐宏剛,肖朝耿.金華火腿副產(chǎn)品酶解物的MRPs抗氧化活性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(6):1218-1223.

[6]Elizabeth Escudero, Maria-Concepcion Aristoy, Hitoshi Nishimura, et al. Antihypertensive effect and antioxidant activity of peptide fractions extracted from Spanish dry-cured ham [J].Meat Science, 2012, 91(3):306-311.

[7]Elizabeth Escudero, Leticia Mora, Paul D Fraser, et al. Identification of novel antioxidant peptides generated in Spanish dry-cured ham[J].Food Chemistry,2013,138:1282-1288.

[8]GB 5009.5-2010，食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].

[9]鐔雪瑩,秦希杰,查恩輝,等.酶解牛肉工藝的研究[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010，31(5):438-440.

[10]Leticia Mora, Marta Gallego, Elizabeth Escudero, et al. Small peptides hydrolysis in dry-cured meats[J].International Journal of Food Microbiology,2015,212:9-15.

[11]王啟軍,戚穗堅(jiān),吳曉萍,等.食品分析實(shí)驗(yàn)(第二版)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:28-29.

[12]褚仕超,孫彥,劉章武.鴨肉蛋白酶解液制備的工藝優(yōu)化[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2013(1):20-23.

[13]Motoko Ohata, Saeko Uchida, Lanxi Zhou, et al. Antioxidant activity of fermented meat sauce and isolation of an associated antioxidant peptide[J].Food Chemistry, 2016,194:1034-1039.

[14]徐清萍.鎮(zhèn)江香醋抗氧化性研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2005.

[15]王文莉,張偉,于新瑩,等.大鯢肉酶解產(chǎn)物的制備及其抗氧化性的研究[J].河北漁業(yè),2012(9):1-4.

[16]Zhu C Z,Zhang W G,Zhou G H, et al.Isolation and identification of antioxidant peptides from Jinhua ham [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61:1265-1271.

[17]豆海港.香辛料提取物抗氧化作用研究[D].海口：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[18]江敏,胡小軍,張永芹,等.魷魚(yú)酶解液美拉德反應(yīng)優(yōu)化及其產(chǎn)物消除自由基的研究[J].中國(guó)調(diào)味品,2012, 37(8):26-30.

[19]宋慧,馬利華,陳學(xué)紅.響應(yīng)面優(yōu)化酶法澄清牛蒡汁工藝的研究[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械,2011(29):132-135.

[20]李娟娟,董文娟,鄭義.基于響應(yīng)面法的復(fù)合酶輔助提取金針菇多糖的工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械,2011(29):152-155.

[21]姚芳,祁興普,劉萍.復(fù)合蛋白酶水解低值淡水魚(yú)工藝的響應(yīng)面優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(6):229-233.

[22]侯付景,金春華,董明敏,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化海地瓜酶解工藝及其抗氧化活性的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,32(3):276-280.

[23]Satish Cingadi, Katla Srikanth, Arun E V R, et al. Statistical optimization of cassava fibrous waste hydrolysis by response surface methodology and use of hydrolysate based media for the production of optically pure d-lactic acid[J].Biochemical Engineering Journal,2015,102:82-90.

[24]Xing Lu-juan,Hu Ya-ya,Hu Hong-yan,et al.Purification and identification of antioxidative peptides from dry-cured Xuanwei ham[J].Food Chemistry,2016,194:951-958.

Study on Antioxidant Activity of Bacon Hydrolysate

LIU Zhi-jun, HU Yu, DU Xiao-qing, HUANG Ye-chuan*, WANG Yan-rong

(College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

To investigate the antioxidant activity of bacon hydrolysate, Sichuan bacon is hydrolyzed by animal protein complex enzyme, and then response surface methodology is used to optimize the hydrolysis conditions based on the single factor experiment. The result shows that the optimum conditions are temperature of 53.3 ℃, time of 6 h, enzyme level of 0.25%, ratio of material to solvent of 1∶3, under such conditions, DH can reach 7.35%. Bacon hydrolysate is diluted by gradient to appraise its antioxidant activity using the DPPH and OH-radical scavenging assay. The hydrolysate exhibits 79.79% scavenging activity on DPPH at the concentration of 10%. The OH-radical chelating ability of the hydrosate reaches 70.61% at the concentration of 5%. And the IC50values of scavenging DPPH effect and removal of hydroxyl OH-radicals are 6.19% and 3.26%, respectively.

bacon; DH; OH-radical; DPPH; antioxidant

2016-07-16 *通訊作者

肉類(lèi)加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(15-R17)；西南科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX15-041)

黃業(yè)傳(1975-)，男，副教授，研究方向：肉制品加工與酶工程。

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.009

1000-9973(2017)01-0037-07